不同注射途徑的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠腸炎療效的實(shí)驗(yàn)研究

付正偉 張振宇 葛海燕

不同注射途徑的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠腸炎療效的實(shí)驗(yàn)研究

付正偉 張振宇 葛海燕

目的探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADMSCs）腹腔及靜脈注射對三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)腸炎療效的影響。方法將32只大鼠完全隨機(jī)分成正常組、腹腔注射組、靜脈注射組及模型組，每組8只。用TNBS誘導(dǎo)炎癥性腸病（IBD）動(dòng)物模型，腹腔及靜脈注入ADMSCs，記錄大鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）、觀察結(jié)腸宏觀損傷及微觀變化、測定結(jié)腸的髓過氧化物酶（MPO）活性、檢測結(jié)腸Ki-67+細(xì)胞的表達(dá)、比較血液中IL-1β、TNF-α濃度及結(jié)腸TGF-β、IL-6、IL-17A、IL-10的基因表達(dá)水平。采用單因素方差分析及獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果ADMSCs腹腔注射組（98.05±0.63）g高于靜脈注射組 [（94.32 ± 0.48）g，t=12.281，P=0.000]，同時(shí)腹腔注射組DAI評分1.71±0.75低于靜脈注射組3.57 ± 0.97，（t=-3.980，P=0.002）。另外發(fā)現(xiàn)腹腔注射組結(jié)腸組織內(nèi)髓過氧化物酶MPO濃度（95.75±5.52）U/g低于靜脈注射組（74.37±5.12）U/g，（t=-7.513，P=0.000），腹腔注射組結(jié)腸病理評分2.14 ± 0.69低于靜脈注射組3.57±0.76，（t=-3.612，P=0.004）。結(jié)腸免疫熒光檢查發(fā)現(xiàn)腹腔注射組比靜脈注射組有更多的Ki-67+細(xì)胞。酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）發(fā)現(xiàn)腹腔注射組血漿中 IL-1β 的濃度（130.71 ± 7.08）pg/ml比靜脈注射組（163 ± 9.09）pg/ml低，（t=-8.518，P=0.000），同樣腹腔注射組血漿中TNF-α的濃度（201.71±6.75）pg/ml也比靜脈注射組（242.28 ±8.30）pg/ml低，（t=-10.033，P=0.000）。此外，結(jié)腸組織實(shí)時(shí)定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（RT-qPCR）的結(jié)果顯示腹腔注射組IL-6 mRNA的表達(dá)4.34±0.48比靜脈注射低6.15 ± 1.05，（t=-4.147，P=0.001），腹 腔 注 射 組 IL-17A mRNA 的 表 達(dá) 2.61±0.53也 比 靜脈 注 射 低3.57 ± 0.46，（t=-4.301，P=0.001）。然而，腹腔注射組 IL-10 mRNA 的表達(dá)水平 37.75 ± 4.46比靜脈注射組高27.68±2.25，（t=5.327，P=0.001），腹腔注射組TGF-β mRNA的表達(dá)水平15.82 ± 0.99 也比靜脈注射組高 11.97±2.25，（t=3.740，P=0.003）。結(jié)論ADMSCs腹腔注射優(yōu)于靜脈注射并可能成為ADMSCs治療IBD的較好選擇。

炎癥性腸?。?脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞； 注射途徑

炎癥性腸?。╥n fl ammatory bowel disease，IBD）是一種病因不明的慢性腸道炎癥性疾病，包括克羅恩病（Crohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）。該病主要發(fā)生在歐美，近年來亞洲呈指數(shù)增長[1-2]。發(fā)病病因及機(jī)制不明確，內(nèi)科主要控制炎癥活動(dòng)及調(diào)節(jié)免疫紊亂[3]，外科主要治療并發(fā)癥，但效果均不理想[4-5]。因此，人們期待找到治愈IBD的更好辦法[6-11]。Drakos等[12]首次報(bào)道了1例非霍奇金淋巴瘤合并CD患者在接受同種異體造血干細(xì)胞后其CD得到改善，此后逐漸有血液疾病合并IBD患者行干細(xì)胞移植后IBD得到緩解的報(bào)道，這引起了學(xué)者的大量關(guān)注，開啟了干細(xì)胞移植治療IBD的研究。近年來，國內(nèi)外形成了主要用造血干細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞來治療IBD的研究并顯示具有廣闊的應(yīng)用前景[13]。這些研究主要集中在療效上，但干細(xì)胞注射方式對IBD的療效影響研究較少且結(jié)果相互矛盾[14-15]。為探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose tissue derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）的最佳注射途徑，本研究ADMSCs的腹腔及靜脈注射對三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）誘導(dǎo)腸炎的療效影響。

材料與方法

一、主要材料及試劑

Ⅰ型膠原酶、三硝基苯磺酸購自美國Sigma公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、青（鏈）霉素、胰酶-EDTA、胎牛血清（etalbovine serum，F(xiàn)BS）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自美國GIBCO公司，大鼠脂肪間質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基購于廣州華粵瑞科有限公司，CD29-FITC、CD90-APC、CD106-PE、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-APC、CD11b-PE流式抗體購于美國BD公司，大便隱血試驗(yàn)試劑盒購于珠海Baso公司，髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，抗TSG-6及 TNF-α酶鏈免疫反應(yīng)（enzyme-linked immunoassays，ELISA）試劑盒購于中國CUSABIO公司，RNA提取試劑盒（trizol）購于美國 Ambion公司，F(xiàn)astQuant RT及SYBR Green SuperRealPreMix Plus試劑盒購于TIANGEN BIOTECH（BEIJING）公 司，抗Ki-67抗體、HRP標(biāo)記二抗、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、DAPI染液、引物合均來自于生物工程上海股份有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：32只 8周 SD 雄性大鼠（250 ～280 g/只），購于上海斯耐克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，喂養(yǎng)在同濟(jì)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心普通級喂養(yǎng)間，溫度20℃ ～24℃，濕度50﹪，晝夜節(jié)律交替12 h/12 h。每籠5只，定時(shí)喂養(yǎng)，自由飲水。本實(shí)驗(yàn)通過了同濟(jì)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的動(dòng)物倫理審查，倫理編號：TJLAC-016-014。

2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將32只大鼠完全隨機(jī)分成正常組，腹腔注射組，靜脈注射組及模型組，每組8只。造模前24 h大鼠禁食不禁水，第1天，用TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎，正常組用PBS液灌腸1次。第2天將ADMSCs（2×106個(gè)/只）分別用腹腔及靜脈注射方式注入兩組結(jié)腸炎大鼠，正常組及模型組不治療，按表1的標(biāo)準(zhǔn)每天記錄大鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)（disease Activity Index，DAI），第 7 天處死大鼠，取標(biāo)本檢測。

表1 疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評分

3.動(dòng)物造模：禁食24 h，用3﹪異戊巴比妥鈉溶液行腹腔麻醉，麻醉成功后將5﹪ TNBS溶液0.6 ml加入到50﹪等體積的乙醇中充分混勻，用內(nèi)徑4 mm的乳膠管經(jīng)肛門插入結(jié)腸，插入8 cm，將混合液緩慢推入，推入后大鼠倒立1 min，待其自然清醒，自由食水。正常組用PBS液灌腸1次。

4.ADMSCs的分離培養(yǎng)及純化：大鼠麻醉后消毒，取出附睪旁及腎周脂肪，用含有1﹪青（鏈）霉素PBS液洗3次，剃出可見血管并剪成1～2 mm3的組織塊，將組織塊放入625 μl/mlⅠ型膠原酶的DMEM/F12培養(yǎng)基中并在37 ℃水浴鍋中消化1 h，10﹪FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，消化液通過濾網(wǎng)后離心，760 ×g離心10 min，去上清液，用1 ml含有10﹪FBS、1﹪青（鏈）霉素及20 ng/μl TGF培養(yǎng)基重懸，取10 μl細(xì)胞懸液用臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)，后按30×103個(gè)/cm2將細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，置入37 ℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后換培養(yǎng)基清除未黏附的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長滿底板約80﹪時(shí)，用0.25﹪胰酶-EDTA-PBS稀釋液消化黏附細(xì)胞并傳代繼續(xù)培養(yǎng)，3～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

5.ADMSCs的標(biāo)記及鑒定：取培養(yǎng)擴(kuò)增后的第2代ADMSCs，吸出原培養(yǎng)液，用2.5 g/L 胰酶消化，含10 g/L血清白蛋白的PBS洗滌后制成ADMSCs單細(xì)胞懸液，加入EP管中，再分別加入CD29-FITC、CD90-APC、CD106-PE、CD34-FITC，CD44- PE，CD45-APC，CD11b-PE 各 2 μl和同型對照流式抗體，4 ℃避光孵育30 min，PBS漂洗，空白對照用PBS代替，用含10 g/L BSA 的PBS洗滌后，流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)lowjo軟件分析。用大鼠ADMSCs成骨、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基進(jìn)行成骨、成脂分化實(shí)驗(yàn)。

6.組織病理學(xué)分析：大鼠麻醉后，切除結(jié)腸并沿長軸打開并用預(yù)冷的PBS液沖洗，4﹪的多聚甲醛固定，石蠟包埋，組織塊切成5 μm的薄片并黏附于載玻片后行HE染色。結(jié)腸的微觀及宏觀評分按文獻(xiàn)執(zhí)行[16-17]。

7.大便隱血實(shí)驗(yàn)：收集大鼠新鮮大便用大鼠隱血實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測，檢測方法按說明書進(jìn)行。

8. MPO檢測：取約1 g組織用預(yù)冷的PBS液沖洗并放入玻璃勻漿器置于冰上勻漿，1600×g離心10 min，取上清液用于MPO檢測，其方法及結(jié)果計(jì)算按說明書進(jìn)行。

9.血漿中細(xì)胞因子的檢測：取腹腔動(dòng)脈血于EP管中，1500×g離心 15 min，取上清液保存于-80℃冰箱，血漿中TNF-α，IL-1β濃度用TNF-α，IL-1β ELISA試劑盒檢測，檢測方法及結(jié)果計(jì)算按照ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行。

10.實(shí)時(shí)定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）：用Trizol試劑提取樣本總RNA，測其質(zhì)量及濃度，用FastQuantcDNA合成試劑盒將2 μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后置于-80℃保存用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版試劑盒將反應(yīng)體系置于ABI 7500 Real time PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，采用2-ΔΔT相對定量分析法進(jìn)行結(jié)果分析，GAPDH mRNA作為內(nèi)參，引物由軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，生物工程上海股份有限公司合成與純化，目標(biāo)基因的引物序列見表2。

11.免疫熒光染色：結(jié)腸組織樣本嵌入樹脂，液氮罐中快速冷凍，保存于-80℃冰箱，組織在冰凍切片機(jī)上切成6 mm的薄片，風(fēng)干，組織包埋劑包埋，96 ℃抗原修復(fù)15 min，PBS液沖洗3次，BSA常溫封閉40 min，PBS液清洗，加入抗體Ki-67常溫過夜，PBS液清洗，加入連接Cy3羊抗鼠二抗，常溫避光孵浴2 h，PBS液清洗，加入DAPI負(fù)染，常溫15 min，PBS液清洗，倒置熒光顯微鏡拍片。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。大鼠體重的變化、DAI、結(jié)腸長度、結(jié)腸宏觀及微觀評分、血漿細(xì)胞因子的濃度及結(jié)腸細(xì)胞因子的mRNA的表達(dá)等均采用± s表示，組間比較采用單因素方差分析及獨(dú)立t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ADMSCs的生物學(xué)特性

從大鼠附睪旁及腎周脂肪分離ADMSCs并行體外培養(yǎng)及分化實(shí)驗(yàn)。圖1顯示ADMSCs呈現(xiàn)典型的紡錘樣形態(tài)，具有成脂、成骨的分化潛能。圖2顯示ADMSCs對CD29、CD44高表達(dá)，而對CD34、CD106低表達(dá)。

二、比較不同注射途徑的ADMSCs對腸炎的緩解作用

表2 RT-qPCR中的引物序列

表3 各組大鼠每日的相對體重變化（± s）

表3 各組大鼠每日的相對體重變化（± s）

注：與腹腔注射組比較，aP＜0.05

分組 動(dòng)物數(shù) 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天正常組 8 101.00±0.84 102.07±0.77 102.74±0.64 103.08±0.40 103.37±0.44 103.74±0.33腹腔注射組 8 96.80±0.90 94.81±0.80 93.27±0.46 5.22±0.51 96.24±0.56 98.05±0.63靜脈注射組 8 97.55±1.33 93.18±0.53 92.14±0.62 92.70±0.53a 93.47±0.48a 94.32±0.48a模型組 8 97.95±1.00 92.10±0.67 89.88±0.78 90.67±0.71a 91.41±0.51a 92.37±0.45a F值 22.145 283.773 548.216 680.569 751.259 727.073 P 值 0.186 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 倒置熒光顯微鏡下觀察脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（×100）

用TNBS誘導(dǎo)IBD的動(dòng)物模型，與CD癥狀相似[18]，表現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，血便及體重降低。從表3可以看出ADMSCs腹腔注射大鼠的體重降低比靜脈注射下降慢。治療后第3天，大鼠的體重逐漸恢復(fù)，但腹腔注射組體重恢復(fù)更快。在第6天，腹腔注射組的體重恢復(fù)比靜脈注射組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.281，P=0.000）。從表4發(fā)現(xiàn)大鼠DAI評分在造模后開始逐漸增高，在第3天各組評分達(dá)到最高，DAI評分逐漸下降，在第6天時(shí)，腹腔注射組DAI評分低于靜脈注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.980，P=0.002）。從表5發(fā)現(xiàn)結(jié)腸組織中MPO的濃度腹腔注射組也低于靜脈注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-7.513，P=0.000），從圖 3a～d 看

到治療組結(jié)腸腸壁充血水腫及腹腔粘連好于模型組，但進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)腹腔注射組更優(yōu)于靜脈注射組。接著切除全部結(jié)腸，行結(jié)腸長度及結(jié)腸黏膜損傷的宏觀比較，從表5及圖3e發(fā)現(xiàn)腹腔注射組的結(jié)腸長度長于靜脈注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.487，P=0.000）。從圖3f發(fā)現(xiàn)腹腔注射組結(jié)腸黏膜充血、水腫、潰瘍較靜脈注射組輕。從表5可以發(fā)現(xiàn)黏膜宏觀損傷評分腹腔注射組低于靜脈注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.000，P=0.011）。為比較結(jié)腸微觀變化，結(jié)腸組織行HE染色。從圖4可以看出腹腔注射組較靜脈注射組黏膜修復(fù)好，較少的炎性細(xì)胞浸潤、黏膜潰瘍及缺損。從表 5可以看出腹腔注射組結(jié)腸病理評分低于靜脈注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.612，P=0.004）。同時(shí)，為了進(jìn)一步評價(jià)結(jié)腸黏膜的修復(fù)情況，結(jié)腸炎性組織進(jìn)行了Ki67的免疫熒光實(shí)驗(yàn)，從圖5發(fā)現(xiàn)在腹腔注射組的結(jié)腸黏膜內(nèi)發(fā)現(xiàn)更多Ki67+細(xì)胞，表明腹腔注射組的結(jié)腸黏膜比靜脈注射組增殖更活躍。

表4 各組大鼠每日疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評分（± s）

表4 各組大鼠每日疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評分（± s）

注：與腹腔注射組比較，aP＜0.05

分組 動(dòng)物數(shù) 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天正常組 8 0 0 0 0 0 0腹腔注射組 8 1.42±0.53 6.57±0.97 7.87±1.06 5.87±1.06 3.00±0.81 1.71±0.75靜脈注射組 8 2.14±0.69 6.00±1.15 9.42±0.97 8.14±1.34a 5.42±0.97a 3.57±0.97a模型組 8 2.14±0.69 7.00±0.81 9.71±0.95 9.14±1.06b 7.28±1.11b 6.00±0.81b F值 23.077 102.500 195.222 114.651 97.400 84.587 P值 0.024 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表5 大鼠結(jié)腸髓過氧化物酶（MPO）濃度、結(jié)腸長度、結(jié)腸宏觀損傷評分及組織學(xué)評分（± s）

表5 大鼠結(jié)腸髓過氧化物酶（MPO）濃度、結(jié)腸長度、結(jié)腸宏觀損傷評分及組織學(xué)評分（± s）

注：與腹腔注射組比較，aP＜0.05

分組 動(dòng)物數(shù) MPO（U/g） 結(jié)腸長度（cm） 宏觀損傷評分 組織學(xué)評分正常組 8 56.41±5.57 19.92±1.59 0.18±0.06 0.17±0.07腹腔注射組 8 74.37±5.12 18.01±0.99 1.57±0.53 2.14±0.69靜脈注射組 8 95.75±5.52a 15.38±0.78a 2.42±0.53a 3.57±0.76a模型組 8 172.61±11.27a 14.45±1.06a 4.28±0.75a 7.87±0.69a F值 340.746 32.841 71.795 188.748 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖2 流式細(xì)胞術(shù)對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞特征性標(biāo)記物的檢測

三、不同注射途徑的ADMSCs對TNBS誘導(dǎo)腸炎炎癥因子的影響

圖3 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞不同注射途徑對腸炎宏觀損傷的影響

注：a、b、c、d圖為結(jié)腸的宏觀表現(xiàn)，圖片箭頭顯示腹腔注射組腸管充血、水腫、粘連較靜脈注射組輕；e圖為結(jié)腸長度變化，圖片顯示腹腔注射組結(jié)腸長度比靜脈注射組長；f圖顯示為腹腔注射組結(jié)腸黏膜水腫，潰瘍較靜脈注射輕

表6 大鼠血清炎性因子的濃度及結(jié)腸局部炎性因子的mRNA的表達(dá)（± s）

表6 大鼠血清炎性因子的濃度及結(jié)腸局部炎性因子的mRNA的表達(dá)（± s）

注：與腹腔注射組比較，aP＜0.05

分組 動(dòng)物數(shù) IL-1β（pg/ml） TNF-α（pg/ml） IL-6（2-ΔΔCt） IL-17A（2-ΔΔCt） IL-10（2-ΔΔCt） TGF-β（2-ΔΔCt）正常組 8 81.71±6.67 140.57±7.65 1.08±0.13 1.07±0.22 1.10±0.14 1.34±0.31腹腔注射組 8 130.71±7.08 201.71±6.75 4.34±0.48 2.61±0.53 37.75±4.46 15.82±0.99靜脈注射組 8 163.00±9.09a 242.28±8.30a 6.15±1.05a 3.57±0.46a 27.68±2.25a 11.97±2.25a模型組 8 200.42±7.97a 295.00±6.78a 8.60±0.67a 8.78±0.22a 8.25±2.25a 5.41±0.49a F值 339.835 543.776 137.346 258.390 311.892 132.632 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

為了研究ADMSCs的腹腔及靜脈注射對腸炎炎癥因子的影響，大鼠血漿中IL-1β及TNF-α的濃度用了ELISA進(jìn)行檢測，用RT-PCR的方法檢測炎性結(jié)腸組織中IL-6、IL-17A、IL-10及TGF-β的mRNA的表達(dá)情況。從表6可以看出ADMSCs的兩種植入方式均能降低血漿中IL-1β及TNF-α的濃度，但腹腔注射組血漿中IL-1β的濃度比靜脈注射組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-8.518，P=0.000）。同樣腹腔注射組血漿中TNF-α的濃度也比靜脈注射組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-10.033，P=0.000）。表6也顯示ADMSCs的兩種植入方式均抑制了結(jié)腸組織中炎癥因子IL-6、IL-17 AmRNA的表達(dá)，增加了抗炎因子IL-10、TGF-βmRNA的表達(dá)。但進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)ADMSCs的腹腔注射組IL-6、IL-17A mRNA的表達(dá)比靜脈注射組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.147，-4.301，P均=0.001）。然而，腹腔注射組IL-10、TGF-β mRNA的表達(dá)水平比靜脈注射組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.327，3.740，P=0.001，0.003）。

圖4 正置熒光顯微鏡下觀察脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞不同注射途徑對腸炎的病理影響（HE染色，×100）

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞作為干細(xì)胞治療的種子廣泛應(yīng)用于組織再生、損傷修復(fù)及免疫系統(tǒng)疾病的治療。ADMSCs是間充質(zhì)干細(xì)胞的一種，它不僅具有一般干細(xì)胞生物特性及更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能外，還具有來源廣，取材方便，易于分離純化且無免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)，因此，ADMSCs可以作為治療IBD的一個(gè)重要細(xì)胞來源。ADMSCs治療IBD有很好的運(yùn)用前景，但至今還未解決的諸如細(xì)胞的最佳劑量，注射途徑及時(shí)間點(diǎn)，有效性及安全性問題阻礙了ADMSCs的臨床轉(zhuǎn)化。目前，最佳的給藥途徑不僅是化學(xué)藥物重要的臨床問題，而且是細(xì)胞治療臨床疾病的關(guān)鍵問題，治療的細(xì)胞到達(dá)靶器官與細(xì)胞的給藥方式有很大的關(guān)系。因此，ADMSCs的給藥方式有必要進(jìn)行深入的研究。

ADMSCs容易分離純化及培養(yǎng)。跟目前研究一樣[19]，ADMSCs為一種紡錘樣結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)了成脂、成骨的分化潛能以及典型免疫表型的表達(dá)。跟文獻(xiàn)結(jié)果一致[14]，ADMSCs腹腔注射比靜脈注射更能緩解體重降低，結(jié)腸縮短；更能改善結(jié)腸充血、水腫及黏膜潰瘍；更能減少結(jié)腸炎性細(xì)胞浸潤及加快結(jié)腸黏膜修復(fù)。

圖5 正置熒光顯微鏡下觀察脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞不同注射途徑對腸炎結(jié)腸黏膜修復(fù)的影響（免疫熒光染色，×100）

MPO是中性粒細(xì)胞激活的重要標(biāo)志[20]，是用來評估藥物在IBD的動(dòng)物模型療效的重要方法[21]。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ADMSCs的腹腔注射比靜脈注射更能降低MPO濃度。TNF-α and IL-1β在CD患者及TNBS動(dòng)物模型都出現(xiàn)表達(dá)增高[22-23]。TNF-α是IBD患者炎癥過程中關(guān)鍵因子，抗TNF-α的藥物強(qiáng)調(diào)了TNF-α在IBD病理過程中的重要作用并作為治療IBD的靶點(diǎn)[24]。IL-1β是對肽聚糖分子快速固有免疫反應(yīng)中重要的前炎癥因子[25]。在本研究中發(fā)現(xiàn)ADMSCs的腹腔及靜脈注射都降低了TNF-α and IL-1β的水平，這與已有的研究結(jié)果一致[26]，但發(fā)現(xiàn)ADMSCs的腹腔注射組TNF-α，IL-1β的下降水平更明顯。Ki67+細(xì)胞反應(yīng)了黏膜的增殖，ADMSCs腹腔注射也發(fā)現(xiàn)腸道上皮有更多的Ki67+細(xì)胞，這與TNF-α，IL-1β可以調(diào)節(jié)腸道上皮的增殖和凋亡一致[27]。

IL-17A及IL-6是IBD重要的致炎因子，IL- 17A的分泌量與IBD的嚴(yán)重程度成正相關(guān)[28]，IL- 17A的缺乏可改善小鼠的結(jié)腸炎癥狀[29]。TGF-β和IL-6是Th17細(xì)胞分化必需的細(xì)胞因子[30]。低濃度TGF-β誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化,而高濃度抑制Th17細(xì)胞分化并促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用[31]。IL-10及TGF-β是由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌的重要抗炎因子，能夠識別自身抗原、保護(hù)組織損傷及抑制自身免疫反應(yīng)[32]。IL-10維持腸道共生菌的自我平衡起到了重要作用[33]。目前的研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞和Th0細(xì)胞共育時(shí)減少了前炎癥因子IL-17A及IL-6的水平，增加了抗炎因子IL-10及TGF-β的水平[34]。本研究也發(fā)現(xiàn)ADMSCs的腹腔及靜脈注入均抑制了IL-17A及IL-6 mRNA的表達(dá)，增加了IL-10及TGF-β mRNA的表達(dá)。這與目前的研究結(jié)論一致[35]。但ADMSCs的腹腔植入對炎癥因子調(diào)節(jié)更為明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持ADMSCs腹腔注射優(yōu)于靜脈注射，這與Castelo-Branco等[14]研究結(jié)果一致，但與Gon?alves等[15]研究的結(jié)果完全相反，其原因可能在于本研究所使用的動(dòng)物模型不一致，這篇文章中用的是TNBS誘導(dǎo)的腸炎，而文獻(xiàn)報(bào)道用的是葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的腸炎，這兩種動(dòng)物模型目前都是世界上最常用的IBD動(dòng)物模型，這兩種模型從誘導(dǎo)發(fā)病的機(jī)理存在差異，導(dǎo)致結(jié)果差異。Antunes等[36]已經(jīng)研究了不同的間充質(zhì)干細(xì)胞及不同注射方式對實(shí)驗(yàn)性肺氣腫有不同的治療效果。據(jù)此推測不同的間充質(zhì)干細(xì)胞用不同注射方式在不同的腸炎模型會出現(xiàn)結(jié)果的差異。為什么腹腔注射優(yōu)于靜脈注射，靜脈注射出現(xiàn)的肺阻塞效應(yīng)可能是一個(gè)重要問題[37]，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大部分細(xì)胞在肺部被清除[38]，顯示少于1﹪的細(xì)胞在靶器官被探測到[39]。并且Wang等[40]發(fā)現(xiàn)注入的間充質(zhì)干細(xì)胞在非靶向的肝脾也有聚集，因此這大大減少了細(xì)胞進(jìn)入靶器官的量，從而減少了治療效果。已有文獻(xiàn)研究了細(xì)胞劑量或許是影響干細(xì)胞治療效果的重要問題[41]。腹腔注射的ADMSCs是怎樣遷移到炎癥部位而產(chǎn)生治療作用的機(jī)理不清楚，分析是否與ADMSCs在腹腔內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)增從而增大了細(xì)胞的數(shù)量且直接通過腹膜進(jìn)入了靶點(diǎn)有關(guān)。這些設(shè)想需要后面的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究的結(jié)果表明ADMSCs的腹腔注射優(yōu)于靜脈注射，腹腔注射可能是ADMSCs治療TNBS誘導(dǎo)腸炎的一種較好選擇。這對ADMSCs的臨床轉(zhuǎn)化及后續(xù)研究有重要的意義。

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2017-05-19）

（本文編輯：蔡曉珍）

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Effect of adipose tissue derived mesenchymal stem cells via different routes of injection on rats with colitis

Fu Zhengwei, Zhang Zhenyu, Ge Haiyan. Department f Gastrointestinal Surgery,Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 201200, China

ObjectiveTo investigate the effect of adipose tissue derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) via intraperitoneal and intravenous injection on colitis induced by trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS).MethodsTotally 32 rats were randomly divided into a normal group, an intraperitoneal injection group, an intravenous injection group and a model group (n=8).The animal model of inflammatory bowel disease (IBD) was induced by TNBS and ADMSCs were administrated intraperitoneally and intravenously. Disease activity index (DAI) were recorded, the microscopic changes and macroscopic damage of colon were observed, myeloperoxidase (MPO) activity were determined and the expression of Ki-67+cell were measured in colon. The expressions of IL-1β and TNF-α in the peripheral blood were compared and the expression level of gene (TGF-α, IL-6, IL-17A, IL-10) were determined in the colon. Single factor analysis of variance and independentttest were used for statistical analysis.ResultsWeight recovery in the intraperitoneal injection group 98.05±0.63 was higher than that in the intravenous injection group 94.32±0.48, (t=12.281,P=0.000) in day 6. At the same time, the DAI score in the intraperitoneal injection group 1.71±0.75 was significantly lower than that in intravenous injection group 3.57±0.97, (t=-3.980,P=0.002). In addition, the MPO concentration of colon tissues in the intraperitoneal injection group (95.75±5.52) U/g was lower than that in the intravenous injection group (74.37 ± 5.12)U/g, (t=-7.513,P=0.000). The pathological score of colon in the intraperitoneal injection group 2.14 ± 0.69 was lower than that in the intravenous injection group 3.57 ± 0.76, (t=-3.612,P=0.004). The immunofluorescence of the colonic tissues revealed more Ki67+cells in the intraperitoneal injection group than in the intravenous injection group.ELISA showed that the intraperitoneal injection group（130.71±7.08）pg/ml had lower concentration of IL-1β in plasma than did the intravenous injection group (163 ± 9.09) pg/ml, (t=-8.518,P=0.000).The plasma concentration of TNF-α in the intraperitoneal injection group (201.71±6.75) pg/ml was also lower than that in the intravenous injection group (242.28 ± 8.30) pg/ml, (t=-10.033,P=0.000).In addition, the results of RT-qPCR in the colon tissues showed that the expression levels of IL-6 mRNA in the intraperitoneal injection group (4.34±0.48) were lower than those in the intravenous injection group (6.15±1.05,t=-4.147,P=0.001) and the expression levels of IL-17A mRNA in intraperitoneal injection group 2.61±0.53 were also lower than those in the intravenous injection group (3.57±0.46,t=-4.301,P=0.001). However, the expression levels of IL-10 mRNA in the intraperitoneal injection group (37.75 ± 4.46) were higher than those in the intravenous injection group (27.68±2.25,t=5.327,P=0.001) and the expression levels of TGF-β mRNA in the intraperitoneal injection group (15.82±0.99) were higher than those in the intravenous injection group (11.97±2.25,t=3.740,P=0.003).ConclusionIntraperitoneal injection of ADMSCs is better than intravenous injection, which may be a better route of administration for ADMSCs treating IBD.

Inflammatory bowel disease; Adipose tissue derived mesenchymal stem cells; Routes of injection

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.05.005

上海市科學(xué)技術(shù)委員會面上項(xiàng)目（34119b0600；16411970800）；上海市衛(wèi)生局面上項(xiàng)目（20134194）

201200 上海，同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院胃腸外科

葛海燕，Email：gesurgery@163.com< class="emphasis_italic">Corresponding author: Ge Haiyan, Email: gesurgery@163.com

Ge Haiyan, Email: gesurgery@163.com