CD68、CD133和TGF-β在肝癌及癌旁組織中的表達及其在臨床轉(zhuǎn)歸中的意義

宋晨鑫 叢明華 鄒寶華 于雷

CD68、CD133和TGF-β在肝癌及癌旁組織中的表達及其在臨床轉(zhuǎn)歸中的意義

宋晨鑫 叢明華 鄒寶華 于雷

目的研究CD68+腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）、CD133+腫瘤干細胞（CSCs）及TGF-β在肝癌及癌旁組織中的表達及其在臨床轉(zhuǎn)歸中的意義。方法選取2014年1月至2016年1月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院綜合科進行手術(shù)治療的89例肝癌患者為研究對象。收集患者手術(shù)標(biāo)本，進行免疫組化染色（IHC），采用半定量積分法對免疫組化分析正常、癌及癌旁組織中CD68+腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）、CD133+腫瘤干細胞（CSCs）及TGF-β表達情況，結(jié)合隨訪資料對其意義進行分析，其表達水平與臨床病例資料之間關(guān)系采用c2檢驗或Fisher確切概率法檢驗或Wilcoxon秩和檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗。結(jié)果CD68+TAMs細胞在癌組織中陽性率為59.55﹪，癌旁組織為37.08﹪，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-3.182，P=0.001）；CD133+細胞在癌組織中陽性率為52.81﹪，癌旁組織中為57.30﹪，表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=- 0.558，P=0.557）；TGF-β在癌組織陽性率為70.79﹪，癌旁組織中為56.18﹪，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.306，P=0.021）。CD68、CD133、TGF-β表達水平與患者腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TGF-β表達水平與Child-Pugh分級相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（c2=10.930，P=0.001）。HCC癌組織中CD68與TGF-β表達，CD133與 TGF-β 表達之間存在正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為（r=0.579、0.611，P=0.026、0.020）。Kaplan-Meier生存曲線分析可知，3種分子均無表達的患者中位生存時間最長，為23.4個月，3種分子均有表達的患者中位生存期最短，僅為6.3個月（P=0.021）。結(jié)論CD68+TAMs細胞與CD133+CSCs細胞之間存在相關(guān)性，二者之間具體機制有待進一步研究，以便為肝細胞癌（HCC）治療提供有力依據(jù)。

肝細胞癌； CD68； CD133； 轉(zhuǎn)化生長因子β

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種嚴(yán)重威脅我國人民群眾生命健康的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，我國肝癌年新發(fā)病例及死亡病例數(shù)分別為36.2萬例和31.6萬例，分別占全球統(tǒng)計數(shù)據(jù)的50.5﹪和51.4﹪[1-2]。當(dāng)前，肝癌的主要治療方案仍是肝切除術(shù)及肝移植術(shù)，但兩者術(shù)后復(fù)發(fā)率始終居高不下，5年復(fù)發(fā)率分別可達70﹪和15﹪以上，使得肝癌患者總體生存情況較差。因此，研究肝癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的機制，找出新的治療靶點是最終克服肝癌的根本之道。腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）具有自我更新，無限增殖、多向分化和高成瘤性的特征，與腫瘤的起源、轉(zhuǎn)移、耐藥及復(fù)發(fā)密切相關(guān)[3]。CD133是腫瘤干細胞的重要表面標(biāo)志物，通過測量其表達水平可以評估肝癌患者的預(yù)后[4]。除腫瘤干細胞的作用外，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演進離不開腫瘤微環(huán)境的影響，其中各類炎癥細胞的浸潤和活化，各類炎癥因子的釋放發(fā)揮了重要作用，也和腫瘤干細胞之間存在密切關(guān)系[5-6]。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是一類在腫瘤微環(huán)境中具有重要地位的免疫細胞，能夠合成并釋放多種細胞因子，參與了腫瘤發(fā)生演進的整個過程，表達水平和功能狀態(tài)是腫瘤預(yù)后的重要標(biāo)志[7]。本研究擬通過研究肝癌患者組織標(biāo)本中CSCs、TAMs及相關(guān)細胞因子表達水平來分析其間關(guān)系，并結(jié)合隨訪資料研究兩種細胞對患者預(yù)后的影響。

資料與方法

一、一般資料

（一）病例資料

選取自2014年1月至2016年1月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院綜合科進行手術(shù)治療的89例肝癌患者為研究對象。男51例，女38例，年齡28 ～66歲，中位年齡（57±8）歲；腫瘤單發(fā)37例，多發(fā)52例；腫瘤最大直徑≤5 cm者54例，＞5 cm者35例；Child-Pugh分級A級50例，B級39例。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，并在其監(jiān)督下進行，患者及家屬簽署書面知情同意意見（倫理編號為ZZL2013101789）。

（二）納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者癥狀、體征及影像學(xué)、病理學(xué)檢查結(jié)果符合肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；（2）癌腫局限于一葉或兩葉，肝功能代償良好；（3）心、肺、腎功能良好，無明顯器官功能衰竭；（4）術(shù)前未經(jīng)放射治療、化療或其他免疫、生物治療。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）同時伴有其他組織或系統(tǒng)惡性腫瘤；（2）患者肝功能Child-Pugh分級為C級以上或存在肝外轉(zhuǎn)移。

（三）試劑

即用型羊血清封閉液、即用型兔抗多克隆轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）單克隆抗體、羊抗小鼠或抗兔IgG抗體及全套免疫組化試劑盒均購自武漢博士德公司，小鼠抗人CD133單克隆抗體購自美國Abcam公司，顯微鏡購自德國Leica公司。病理組織包埋及切片由本院病理科技師進行，二甲苯、酒精、水浴鍋、微波爐、烤箱及冰箱等常規(guī)試劑或儀器由病理科提供。

二、研究方法

1.免疫組化染色（IHC）：組織標(biāo)本收集后立即使用PBS溶液（pH 7.4）沖洗干凈，之后使用4﹪多聚甲醛固定；常規(guī)脫水、透明、置蠟，切片（厚度5 μm）；烤片過夜后二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。使用檸檬酸溶液于高壓下進行抗原熱修復(fù)，3﹪H2O2中浸泡10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；羊血清封閉后滴加的小鼠抗人CD68單克隆抗體、小鼠抗人CD133單克隆抗體稀釋液（1 : 100）或兔抗人TGF-β單克隆抗體稀釋液（1 : 50），4 ℃孵育過夜；室溫下復(fù)溫1 h后，滴加HRP標(biāo)記的羊抗小鼠或抗兔IgG抗體，37 ℃孵育1 h；PBS洗后滴加DAB顯色液（武漢博士德公司），鏡下觀察顯色反應(yīng)，PBS終止，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水返藍；使用酒精、二甲苯脫水透明后樹膠封片。以PBS溶液代替一抗作為陰性對照，陽性對照片由公司提供。結(jié)果判定：根據(jù)染色強度和（或）陽性細胞所占比例采用半定量積分法對免疫組化結(jié)果進行判定（因腫瘤干細胞數(shù)量少，CD133染色只考慮染色強度）[9]：光學(xué)顯微鏡高倍視野下（×200）隨機選擇3個視野，計數(shù)200個細胞；陽性細胞數(shù)＜5﹪ 0分，5﹪～24﹪1分，25﹪～50﹪ 2分，51 ﹪～74﹪ 3分，≥75﹪ 4分 ；每張切片陽性細胞的著色強度按無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩項積分相加判定最終評分結(jié)果 ：0 分陰性（-），1～2 分弱陽性（+），3～5 分中等陽性（++），6～7 分強陽性（+++）。每例均設(shè)有HE切片作對照觀察。

2.患者隨訪：通過電話、QQ及微信等聯(lián)系方式對患者進行隨訪，截止日期為2017年4月，隨訪頻率為間隔3個月隨訪1次，連續(xù)2次無法聯(lián)系定為失訪。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

使用SPSS22.0軟件包對數(shù)據(jù)進行分析，CD68、CD133、TGF-β表達水平與臨床病例資料之間關(guān)系采用c2檢驗或Fisher確切概率法檢驗或Wilcoxon秩和檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。（56.18﹪）表達差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1，圖 1）。

表1 CD68、CD133及TGF-β在HCC組織及癌旁組織中的表達

結(jié) 果

一、CD68、CD133、TGF-β在HCC組織中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，CD68于TAMs細胞的細胞膜、細胞質(zhì)及細胞核中均有表達，陽性細胞呈巢狀或彌漫狀分布于癌組織及癌旁組織中，癌組織表達水平（59.55﹪）較高，與癌旁組織中表達（37.08﹪）差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CD133細胞內(nèi)定位于CSCs的細胞膜及細胞質(zhì)中，細胞核表達相對較少，陽性細胞散在分布于癌組織（52.81﹪）及癌旁組織（57.30﹪）中，表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；TGF-β細胞內(nèi)定位于陽性細胞細胞膜、細胞質(zhì)及細胞核，陽性細胞在癌組織及癌旁組織中均有分布，癌組織（70.79﹪）表達水平較高，與癌旁組織

二、CD68、CD133、TGF-β表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

結(jié)果分析顯示，CD68、CD133、TGF-β表達水平與患者年齡、性別、病灶數(shù)量、腫瘤大小無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與患者腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CD68、CD133 表達水平與 Child-Pugh分級無相關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），TGF-β表達水平與Child-Puge分級相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表 2）。

三、CD68、CD133、TGF-β 表達的相關(guān)性

統(tǒng)計結(jié)果顯示，HCC癌組織中CD68與TGF-β表達，CD133與TGF-β表達之間存在正相關(guān)關(guān)系，分別為（r=0.579、0.611，P=0.026、0.020）；CD68與CD133表達之間無相關(guān)關(guān)系（P＞ 0.05）。

四、CD68、CD133、TGF-β表達與患者生存期之間的關(guān)系

將患者資料錄入軟件，通過Kaplan-Meier生存曲線分析可知，3種分子均無表達的患者中位生存時間為23.4個月，單分子陽性患者中位生存時間為20.4個月，有2種分子表達的患者的中位生存時間為9.7個月，3種分子均有表達的患者中位生存期最短，僅為6.3個月，經(jīng)Log-rank檢驗證實結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.021，圖 2）。

討 論

圖1 Leica光學(xué)顯微鏡下觀察CD68、CD133及TGF-β在正常、HCC及癌旁組織中的表達（×200）

圖2 CD68、CD133、TGF-β表達與患者生存期之間關(guān)系

癌組織由許多具有不同分化等級的細胞亞群所組成，這些細胞亞群有可能來自單一細胞克隆。腫瘤干細胞學(xué)說認(rèn)為，少數(shù)具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能的細胞在腫瘤的形成、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)中處于中心地位，這一理論已在乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤和結(jié)腸癌的相關(guān)研究中得到了證實[10]。CD133是CSCs的特異性標(biāo)志物，能夠影響CSCs的成瘤活性、分化潛能、侵襲潛能以及對化療藥物的敏感性。研究表明，CD133陽性的HCC細胞在動物模型中能夠更快成瘤，荷瘤體積更大，并且經(jīng)檢測其瘤細胞內(nèi)有關(guān)侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因較CD133陰性細胞均表達上調(diào)，因此CD133可以作為患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的新型標(biāo)志物[11]。You等[12]研究證實TGF-β可通過Smads信號通路在HCC細胞系中上調(diào)CD133表達，并增強腫瘤細胞成瘤活性。此外，體外實驗證實通過siRNA下調(diào)HCC細胞系中CD133表達能夠降低癌細胞的增殖活性和集落形成能力，促進細胞凋亡，因此CD133也可能成為HCC治療的重要靶點[10]。

腫瘤微環(huán)境對其生物學(xué)功能的發(fā)揮有著重要的影響，TAMs是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要一員。TAMs按生物學(xué)功能不同可以分為經(jīng)典巨噬細胞（M1-like macrophages）和替代巨噬細胞（M2-like macrophages）兩類，兩者作用相反，前者具有抗感染、抗腫瘤的活性，而后者可抑制免疫反應(yīng)，促進腫瘤發(fā)生和進展，兩者可以相互轉(zhuǎn)化[13]。一方面，M2型巨噬細胞處于腫瘤微環(huán)境中多種細胞因子的調(diào)控之下，另一方面又可以通過分泌TGF-β、IL-10等多種因子參與腫瘤細胞的生物學(xué)功能發(fā)揮以及腫瘤血管的發(fā)生、發(fā)育。陳利軍等[14]研究表明在HCC組織中CD68+TAMs密度越大，腫瘤細胞ki-67表達水平越高，說明其增殖活性越強，且隨訪資料統(tǒng)計結(jié)果表明患者生存時間也就越短。本研究中患者癌組織CD68+TAMs表達量遠高于癌旁組織，且表達水平越高腫瘤細胞分化程度也就越差，淋巴道轉(zhuǎn)移率也越高，患者生存期越短。

表2 CD68、CD133、TGF-β表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（例）

為了研究CD68+TAMs以上功能的實現(xiàn)是否與HCC中CSCs細胞有關(guān)，F(xiàn)an等[15]考察了HCC腫瘤組織中TAMs細胞數(shù)量與CSCs細胞密度之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者存在正相關(guān)性，且細胞學(xué)實驗表明TAMs細胞數(shù)量越多，TGF-β水平越高，可以使CD133啟動子區(qū)甲基化而表達上調(diào)，進而增強CSCs的侵襲能力。本研究通過免疫組化實驗探討了兩者在組織表達中相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者之間并不存在直接的相關(guān)關(guān)系，但是TAMs與CSCs均與HCC組織中TGF-β表達水平存在相關(guān)關(guān)系，而且隨著三種分子表達率的增加，患者生存時間明顯縮短，因此推測TAMs有可能通過分泌TGF-β作用于CSCs。然而，也有研究認(rèn)為TGF-β與HCC組織中的CSCs之間存在的是負相關(guān)關(guān)系，前者可以能夠減少CD133陽性細胞的數(shù)量、降低其密度，抑制CSCs干性基因表達[16]。對于這些不同結(jié)論，本研究認(rèn)為其機制仍有待進一步探討，特別是TGF-β在何種條件下展現(xiàn)何種生物學(xué)功能有待進一步研究來明確。

綜上所述，CD68+TAMs細胞與CD133+CSCs細胞之間存在相關(guān)性，未來將進一步進行深入實驗以找出二者相互作用的具體機制，以便為HCC治療提供有力依據(jù)。

1 赫捷. 2013年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]. 中國腫瘤, 2017,26(1):1-7.

2 魏礦榮, 彭俠彪, 梁智恒, 等. 全球肝癌流行概況[J]. 中國腫瘤, 2015,24(8):621-630.

3 Medema JP. Cancer stem cells: the challenges ahead[J]. Nat Cell Biol,2013, 15(4):338-344.

4 張華, 李蘇宜. CD133與腫瘤干細胞研究進展[J]. 癌癥, 2010,29(3):259-264.

5 黃波. 腫瘤微環(huán)境中免疫與炎癥的調(diào)節(jié)[J]. 中國腫瘤生物治療雜志,2012, 19(2):111-115.

6 喻楊, 王喻義, 王乙欽, 等. 腫瘤干細胞與腫瘤微環(huán)境相互作用的研究進展[J]. 華西醫(yī)學(xué), 2015 (9):1784-1788.

7 賀璐璐, 張紅新, 陳奎生. 腫瘤相關(guān)巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中的相互作用研究進展[J]. 河南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2016, 35(4):294-300.

8 楊秉輝. 原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)[J]. 腫瘤防治研究,2002, 29(1):83.

9 劉莉, 陸遠, 王媛, 等. EGFR、HER2、CXCR4在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2014, 14(6):1069-1073.

10 牛堅, 朱樂樂, 王月, 等. 下調(diào)CD133表達對肝癌細胞惡性生物學(xué)行為的影響[J]. 中國普通外科雜志, 2016, 25(1):77-82.

11 姚若全. CD133在肝癌干細胞中的表達及作用[D]. 長沙: 中南大學(xué),2013 .

12 You H, Ding W, Rountree CB. Epigenetic regulation of cancer stem cell marker CD133 by transforming growth factor-beta[J]. Hepatology,2010, 51(5):1635-1644.

13 Montana G, Lampiasi N. Substance P induces HO-1 expression in RAW 264.7 cells promoting Switch towards M2-Like macrophages[J].PLoS One, 2016, 11(12):e0167420.

14 陳利君, 陳靜琦, 曾波航. 肝癌組織中CD68+腫瘤相關(guān)巨噬細胞數(shù)量與Ki-67蛋白表達及原發(fā)性肝癌預(yù)后的關(guān)系[J]. 腫瘤防治研究, 2016,43(9):774-778.

15 Fan QM, Jing YY, Yu GF, et al. Tumor-associated macrophages promote cancer stem cell-like properties via transforming growth factor-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Lett, 2014, 352(2):160-168.

16 劉蘭蘭, 楊兆娟, 鄒飛雁, 等. 轉(zhuǎn)化生長因子β1對肝癌細胞干性表型的調(diào)節(jié)作用[J]. 腫瘤, 2012, 32(4):227-233.

2017-06-14）

（本文編輯：陳媛媛）

宋晨鑫，叢明華，鄒寶華，等. CD68、CD133和TGF-β在肝癌及癌旁組織中的表達及其在臨床轉(zhuǎn)歸中的意義[J/CD].中華細胞與干細胞雜志（電子版），2017，7（5）：291-296.

Expression and clinical significance of CD68, CD133 and TGF-β in hepatocellular carcinoma and adjacent normal tissues

Song Chenxin, Cong Minghua, Zou Baohua, Yu Lei. General Department, National Cancer Center/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021,China

Yu Lei,Email:songchenxin1@qq.com

ObjectiveTo study the expression of CD68+tumor-associated macrophages(TAMs), CD133+cancer stem cells (CSCs) and TGF-β in hepatocellular carcinoma (HCC) and correlation with the prognosis of patients.Methods89 patients with HCC, who underwent surgery at our center from Jan 2014 to Jan 2016, were enrolled in this study. The tissue samples were processed by IHC to analyze the expression of CD68+TAMs, CD133+CSCs and TGF-β by semi-quantative scoring methods. The data were further interpreted with the follow-up information of patients, and c2, Fisher or Wilcoxon rank sum test was used to analyze the relation between the expression of CD68+TAMs, CD133+CSCs and TGF-β and the follow-up information of patients. The correlation of CD68+TAMs, CD133+CSCs and TGF-β with the survival of HCC patients was analyzed by the Spearman test.ResultsThe tumors had significantly higher levels of CD68+TAMs (59.55﹪) and TGF-β (70.79﹪) expression than their adjacent normal tissues (37.08﹪ and 56.18﹪) respectively(Z=-3.182，P=0.001,Z=-2.306，P=0.021) . No significant difference was found in the CD133+CSCs expression levels between the tumors (52.81﹪) and their adjacent normal tissues (57.30﹪)(Z=-0.558，P=0.557). The expression levels of CD68, CD133 and TGF-β were positively correlated with the degree of tumor differentiation and lymphatic metastases (P＜0.05). The TGF-β expression levels were positively correlated with the Child-Pugh scores (c2=10.930，P=0.001). In the HCC tissue, positive correlations were found between the CD68 and TGF-β levels (r=0.579,P＜0.05), and the CD133 and TGF-β levels (r=0.611,P＜0.05), respectively. Patients with negative expression of all the three molecules had the longest survival time, which was 23.4 months, and patients with positive expression of all the three molecules had the shortest survival time, which was 6.3 months as analyzed by Kaplan-Meier assay.ConclusionCD68+TAMs may influence CD133+CSCs, and further study is needed to elaborate the possible mechanism for the treatment of HCC in clinic.

Hepatocellular carcinoma; CD68; CD133; Transforming growth factor beta

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.05.007

100021 北京，國家腫瘤中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院綜合科

于雷，Email:songchenxin1@qq.com