榆耳低聚肽的制備及抗氧化活性研究

常桂英++于加平+高桂鳳

摘要：以榆耳為原料，經(jīng)提取、純化、酶解，獲得2.0～10.6 μm超濾膜截留范圍的低聚肽，通過鄰苯三酚法測其抗氧化活性，對氨基苯磺酸法測定對亞硝酸鹽的清除率。結(jié)果表明，榆耳蛋白及低聚肽對超氧自由基和亞硝酸鹽都有較強(qiáng)清除效果，但緩沖溶液提取的榆耳蛋白最強(qiáng)，而對于2種提取方法得到的榆耳蛋白水解的低聚肽的對超氧自由基和亞硝酸鹽都有較強(qiáng)清除效果比榆耳蛋白的清除效果要差很多，其中緩沖溶液提取的低聚肽清除效果最低。說明榆耳蛋白具有很強(qiáng)的抗氧化活性，是天然的抗氧化劑，在食品領(lǐng)域及化妝品產(chǎn)業(yè)均有很高的開發(fā)利用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：榆耳；低聚肽；提??；抗氧化

中圖分類號： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0225-03

榆耳是分布于我國長白山區(qū)的一種食藥兼用珍貴食用菌品種，屬多孔菌目伏革菌科膠韌革菌，又稱榆蘑，它的浸出液對痢疾和腸胃系統(tǒng)疾病亦有奇效[1]。低聚肽可以改善肝功能，緩解血液芳香族氨基酸濃度過高導(dǎo)致肝昏迷；可以提供能量，緩解疲勞，可以改善手術(shù)后病人營養(yǎng)狀態(tài)，廣泛應(yīng)用于燒傷、外科手術(shù)等病人及消化酶缺失患者的腸道營養(yǎng)劑和蛋白營養(yǎng)食品；也可用作高強(qiáng)度勞動(dòng)者及運(yùn)動(dòng)員的食品營養(yǎng)劑，能及時(shí)補(bǔ)充能量、消除疲勞、增強(qiáng)體力；還具有抗氧化活性，同時(shí)具有良好風(fēng)味[2]。

本研究以榆耳為原料，通過堿法、緩沖液提取法對其蛋白質(zhì)進(jìn)行提取、純化，以酶解法制備高F值低聚肽，并對不同提取物進(jìn)行活性分析，為榆耳的深加工及產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

榆耳子實(shí)體。

1.2 儀器與試劑

LC-10AT氨基酸自動(dòng)分析儀（檢測器S-TD-10A VTPlus）；756PC紫外/可見分光光度計(jì)；YP2001N電子天平；TDL-5臺式離心機(jī)；JJ-5恒溫電動(dòng)攪拌器；超濾裝置（超濾膜孔徑：2.0 μm）；高速萬能粉碎機(jī)；紫外-可見分光光度計(jì)；離心機(jī)；恒溫干燥箱；燒杯；量筒；CaCl2固體；0.2%苯酚，6.0 mol/L 鹽酸；0.4%對氨基苯磺酸；0.2%鹽酸萘乙二胺；NaOH溶液；鹽酸溶液；NH4Cl溶液；牛血清白蛋白；考馬斯亮藍(lán)G-250；85%磷酸；乙醇。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 榆耳蛋白質(zhì)的提取與純化

1.3.1.1 NaCl的堿性溶液提取榆耳蛋白質(zhì) 稱取20 g榆耳粉末，加入0.5 mol/L的NaCl溶液，pH值為10.0（料液比 1 g ∶ 30 mL），在40 ℃下浸泡4.0 h，12 000 r/min離心20 min后，上清液即為榆耳蛋白質(zhì)粗提取液。

1.3.1.2 緩沖液提取榆耳蛋白質(zhì) 稱取20 g榆耳粉末，加入到1.0 mol/L Tris-Hcl（pH值為8.0）、甘油、聚乙烯吡咯烷酮混合定容，并經(jīng)高壓滅菌的緩沖液里（料液比1 g ∶ 30 mL），在 4 ℃ 下浸泡4.0 h，12 000 r/min離心20 min后，上清液即為榆耳蛋白質(zhì)粗提取液。

1.3.1.3 純化 （1）去多糖：將所得的榆耳蛋白提取液減壓濃縮，并加入3倍體積的95%乙醇，進(jìn)行醇沉除去多糖，離心，將所得溶液減壓濃縮除去乙醇，得到除去多糖的榆耳蛋白溶液。（2）鹽析：向去多糖的蛋白質(zhì)提取液中按氯化銨 60 g/200 mL 固液比緩慢加入氯化銨粉末，鹽析后，4 ℃靜置過夜，待沉淀完全后再離心（4 000 r/min，40 min），棄上清，NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)沉淀物用蒸餾水溶解；緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)沉淀物用緩沖液溶解。

1.3.1.4 透析 取10倍以上蛋白質(zhì)體積的去離子水，將裝好樣品的透析袋懸于大燒杯中部。在燒杯底部放一個(gè)磁子，緩慢攪拌以促進(jìn)溶液交換。更換洗脫溶液數(shù)次（約 30 min/次），至達(dá)到透析平衡為止（洗出液中無Cl-），獲得榆耳蛋白質(zhì)。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定——考馬斯亮藍(lán)法

1.3.2.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 用牛血清白蛋白配制成 0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。

1.3.2.2 染色液（考馬斯亮藍(lán)G-250溶液） 稱取0.1 g考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50.0 mL 90%乙醇中，加入85%的磷酸100.0 mL，蒸餾水定容至1 L，貯存在棕色瓶中。

1.3.2.3 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]。得回歸方程：

D=0.342C+0.036 4，r2=0.999 9。

式中：D表示吸光值，C表示蛋白質(zhì)濃度。

1.3.2.4 樣品中蛋白質(zhì)含量測定 取2支試管（1個(gè)為重復(fù)）A和B，加入樣品提取液1.0 mL，考馬斯亮藍(lán)溶液 5.0 mL，按“1.3.2.3”節(jié)方法進(jìn)行測定。

1.3.3 低聚肽的制備 分別取NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)提取液和緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)提取液各10.0 mL，取1 g蛋白質(zhì)樣品加20.0 mL蒸餾水，在 35 ℃條件下預(yù)熱 15 min 后，加凝乳蛋白酶酶解4.0 h后備用。

1.3.4 維生素C溶液的制備 稱取含量分別與NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)提取液和緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)提取液具有相同含量的維生素C粉末制備溶液備用。

1.3.5 超氧自由基抑制率測定 超氧自由基測定采用改良的鄰苯三酚自氧化法[3]。在試管中按表1加入緩沖液和蒸餾水，于25 ℃恒溫15 min后加入25 ℃預(yù)熱過的樣本和鄰苯三酚，迅速搖勻，立即傾入比色皿中，在波長325 nm處每30 s測定1次吸光度D。

超氧自由基清除率=（D0-Df）/D0×100%。

式中：D0表示試劑空白液的吸光值；Df表示分別加入各種樣品和鄰苯三酚后的吸光值。endprint

1.3.6 對亞硝酸鹽的抗氧化性的測定[4-8] 分別精確吸取5.000 μg/mL的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液1.2 mL于6支15.0 mL試管中，再分別加含量為0.300 μg/mL（緩沖液提?。┗?0.300 μg/mL（堿提）的榆耳蛋白提取液1.2、1.8、2.4、3.0、36、4.8 mL，35 ℃恒溫反應(yīng)10 min。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的對氨基苯磺酸1.2 mL搖勻，靜置5 min后再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.2% 鹽酸萘乙二胺0.6 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置10 min后，在538 nm處測定吸光度，分別進(jìn)行2次平行試驗(yàn)，取平均值為D。樣本空白管用來調(diào)零的試劑空白管即樣本用蒸餾水代替測得值為D0。

清除率（SR）=（D0-D）/D0×100%。

式中：D0表示未加試樣后NaNO2的吸光度；D表示加試樣時(shí)NaNO2的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 樣品中蛋白質(zhì)含量的測定

按“1.3.2.3”節(jié)方法測得樣品中蛋白質(zhì)含量的結(jié)果為NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)含量為0.312 μg/mL，緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)含量為0.297 μg/mL。

2.2 樣品中蛋白質(zhì)對超氧自由基清除效果研究結(jié)果

取等濃度和體積的NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)、緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)溶液，分別對鄰苯三酚的抗氧化活性進(jìn)行研究。由圖1可見，這2種方法提取的榆耳蛋白對鄰苯三酚超氧自由基都具有清除作用。緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)比NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)對超氧自由基的清除效果要好得多，180 s時(shí)緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)對超氧自由基的清除率達(dá)93%，而NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)對超氧自由基的清除率為78%。

2.3 樣品中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物對超氧自由基清除效果研究結(jié)果

分別取等質(zhì)量的NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物和緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，研究水解產(chǎn)物對鄰苯三酚的抗氧化活性。由圖2可知，2種方法提取的榆耳蛋白水解產(chǎn)物對鄰苯三酚超氧自由基都具有一定的清除作用，但比原液清除效果低很多，說明榆耳蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物比榆耳蛋白質(zhì)的抗氧化活性要弱得多，在應(yīng)用時(shí)最好直接應(yīng)用榆耳蛋白質(zhì)。180 s時(shí)緩沖液提取的榆耳蛋白水解產(chǎn)物對超氧自由基的清除率為43%，而NaCl的堿性溶液提取的榆耳蛋白水解產(chǎn)物對超氧自由基的清除率僅為29%。

2.4 樣品中蛋白質(zhì)與維生素C對亞硝酸鹽清除作用的比較研究

取等濃度和體積的NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)、緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)和維生素C溶液，分別對亞硝酸鹽清除作用進(jìn)行研究，由圖3可知，這2種方法提取的榆耳蛋白及維生素C對亞硝酸鹽都有一定的清除作用，隨著濃度的提高清除率都加強(qiáng)。但緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)對亞硝酸鹽的清除效果最好，當(dāng)濃度為0.096 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)93%。而NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)對亞硝酸鹽的清除效果次之，當(dāng)濃度為0.096 μg/mL時(shí)，清除率達(dá)51%。維生素C對亞硝酸鹽的清除效果最差，當(dāng)濃度為0.096 μg/mL時(shí)，清除率僅28%。由此可知，榆耳蛋白對亞硝酸鹽的清除效果強(qiáng)于維生素C，在應(yīng)用時(shí)最好選擇緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)清除亞硝酸鹽類。

2.5 樣品中蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物低聚肽與維生素C對亞硝酸鹽清除作用的比較研究

分別取等質(zhì)量的NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)和緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)6份進(jìn)行水解，研究水解產(chǎn)物低聚肽對亞硝酸鹽清除效果，結(jié)果再與相應(yīng)濃度的維生素C溶液對亞硝酸鹽清除效果進(jìn)行對比，這2種方法提取的榆耳蛋白水解產(chǎn)物低聚肽及維生素C對亞硝酸鹽都有一定的清除作用，隨著濃度的提高清除率都增強(qiáng)（圖4）。緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物低聚肽對亞硝酸鹽的清除效果最好，當(dāng)濃度為0.096 μg/mL時(shí)清除率為67%。NaCl堿性溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物低聚肽對亞硝酸鹽的清除效果次之，當(dāng)濃度為0.096 μg/mL時(shí)清除率為41%。維生素C對亞硝酸鹽的清除效果最差，當(dāng)濃度為0.096 μg/mL時(shí)清除率僅29%。由此可知，榆耳蛋白水解產(chǎn)物低聚肽對亞硝酸鹽的清除效果強(qiáng)于維生素C，但榆耳蛋白對亞硝酸鹽清除效果要好于水解產(chǎn)物低聚肽，因此，在應(yīng)用時(shí)最好選擇緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)清除亞硝酸鹽類。

3 小結(jié)

由試驗(yàn)結(jié)果可知，NaCl堿性溶液和緩沖液2種方法提取的榆耳蛋白含量分別為0.312、0.297 μg/mL。榆耳蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物對超氧自由基和亞硝酸鹽都有很好的清除效果，但緩沖液提取的榆耳蛋白質(zhì)對超氧自由基和亞硝酸鹽清除效果最好。由此可知，榆耳蛋白應(yīng)用時(shí)最好選擇緩沖溶液提取的榆耳蛋白質(zhì)。榆耳蛋白質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化性能，本研究可為榆耳的進(jìn)一步開發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

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