無機磷降解菌株的分離、鑒定及解磷能力

呂睿+賈鳳安+劉晨+胡婷+甄麗莎

摘要：為了開發(fā)高效微生物解磷肥，利用解磷菌選擇培養(yǎng)基，從陜西省西安市周至縣獼猴桃園農田土壤中分離出具有降解無機磷能力的菌株共計9株，通過純化培養(yǎng)，篩選出1株高效無機磷降解菌JWP3。利用16S rDNA基因序列分析方法對該菌株的分類信息進行鑒定，鑒定結果表明該菌株為膠質芽孢桿菌 （Paenibacillus mucilaginosus）。并通過試驗確定了該菌株的最適培養(yǎng)條件：初始接種量4%，搖床轉速200 r/min，培養(yǎng)溫度30 ℃，初始pH值為7。試驗結果可為無機磷降解菌JWP3的大規(guī)模工業(yè)化生產提供數(shù)據(jù)支持。

關鍵詞：無機磷降解菌；篩選；鑒定；解磷能力；最適培養(yǎng)條件

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0295-04

磷元素是植物生長所必需的三大營養(yǎng)要素之一，我國有75%的土壤缺磷[1]，特別是北方石灰性土壤，雖然全磷含量很高，均在0. 57～0. 79 g/kg之間，但由于土壤中存在大量的游離碳酸鈣，大部分磷形成難溶性的磷酸鈣鹽，能被作物吸收利用的有效磷含量很低[2]，土壤中95%的磷為無效形式[3]，大部分與土壤中Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+結合形成難溶性磷酸鹽。因此，如何開發(fā)和有效利用這部分被土壤固定的磷是目前我國農業(yè)生產中急需要解決的問題。

而土壤中存在著一些微生物能夠將難溶性的磷酸鹽轉化為可利用形態(tài)，這些微生物稱為解磷微生物 （phosphate solubilizing micro-organisms，PSM ），能夠將難溶性的磷酸鹽如礦磷粉轉化為水溶性磷，提高土壤中的可溶性磷含量，從而改善植物磷素營養(yǎng)，提高作物產量[4-6]。因此，對解磷微生物菌劑及其應用的研究，成為了土壤微生物修復研究的熱點，對提高土壤肥力和促進農作物增產具有重要的意義。

由于不同種類的解磷菌或菌株之間的解磷能力和接種效果差異懸殊，所以高效解磷菌株的篩選顯得尤為重要[7]。本試驗以磷酸鈣為唯一磷源，通過選擇性培養(yǎng)，從陜西省西安市周至縣獼猴桃園大田土壤中分離篩選出9株解磷菌株，并通過分離、純化、復篩，得到1株解磷能力較強的細菌 JWP3，研究該菌株的生理生化特征及對磷礦石的降解特性，確定菌株的最適接種量，最適pH值、最適生長溫度及搖床轉速對解磷能力的影響，確定該菌株的生長情況及解磷能力，為開發(fā)新的成本低、效果好且不污染環(huán)境的解磷菌肥提供科學依據(jù)，對發(fā)展綠色農業(yè)具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 采集陜西省西安市周至縣獼猴桃園土壤，土樣釆集方法為五點采樣法，去除表層土壤，用土鉆取深度為0～20 cm 的土壤，將5個不同點的土樣混合為1份，裝入無菌樣品采集袋，標簽注明采樣信息，放入4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 無機磷液體培養(yǎng)基：蔗糖 10.0 g，（NH4）2SO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，Ca3（PO4）2 5.0 g，，蒸餾水 1.0 L，pH值 7.2～7.5，121 ℃滅菌20 min。

無機磷固體培養(yǎng)基：無機磷液體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂。

LB液體培養(yǎng)基[8]：蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，氯化鈉 5 g，加蒸餾水至 1 L，pH值 7.0。

1.2 方法

1.2.1 解磷菌的富集 取1只250 mL錐形瓶，加入無機磷液體培養(yǎng)基100 mL，向錐形瓶中加入1 g土壤樣品，搖床培養(yǎng)2 d（溫度30 ℃，轉速180 r/min），吸取錐形瓶底部菌液進行轉接，富集解磷菌，每次轉接前將菌液涂布到平板上計數(shù)。重復上述步驟，對不同樣品進行處理。

1.2.2 解磷菌的初篩 將富集培養(yǎng)基中的菌種轉接到含磷酸鈣無機鹽培養(yǎng)基的平板上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，出現(xiàn)菌落后，挑取單菌落轉接至新的固體培養(yǎng)基上，重復上述操作3次，將單菌落放入冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 解磷菌的復篩 將初篩出的菌株轉接到裝有50 mL磷酸鈣液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)5 d，涂布，記錄菌數(shù)，同時檢測磷酸鈣的降解，將菌液以8 000 r/min離心5 min，取上清10 mL，加5 mL鉬銻抗顯色劑，加蒸餾水定容至50 mL，以不接菌處理為對照，用分光光度計測量吸光度，計算磷含量，篩選出1株生長旺盛、降解能力強的菌株。

1.2.4 菌株形態(tài)學特征 將分離純化得到的菌株在固體平板上進行劃線培養(yǎng)，在溫度為30 ℃的條件下培養(yǎng)2 d，觀察菌株生長狀況及菌落特征。

1.2.5 菌株16S rDNA序列分析及比對 選用細菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）建立 PCR擴增體系進行擴增。PCR 反應體系（50 μL）：5×One Taq Standard Reaction Buffer 10 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L Forward Primer 1 μL，10 μmol/L Reverse Primer 1 μL，One Taq DNA Polymerase 1 μL，Template DNA 2.0 μL，Nuclease-Free water 34 μL。擴增程序：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。產物經純化后測定基因序列，利用 Blast將菌株的基因序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比較，選取相似性較高的模式菌株序列，用MEGA 5.1中Neighbor-Joining法比較同源性，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。endprint

1.2.6 菌株解磷能力測定 配制解磷培養(yǎng)基（不加磷源）按50 mL每瓶分裝于250 mL錐形瓶中，分別加入0.1 g準確稱取的磷酸鈣，在121 ℃條件下滅菌20 min，每個錐形瓶接入2%待測菌懸液，28 ℃ 180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d，菌液 8 000 r/min 離心10 min，取上清10 mL，加5 mL鉬銻抗顯色劑，加水定容至50 mL，利用分光光度計測定并計算上清液中磷含量。

1.2.6.1 最適初始接種量測定 配制液體培養(yǎng)基，按1%、2%、3%、4%和5%等5個接種量接入到解磷培養(yǎng)基中，在 28 ℃ 條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d，菌液8 000 r/min離心10 min，取上清10 mL，加5 mL鉬銻抗顯色劑，加水定容至50 mL，利用分光光度計測定并計算上清液中磷含量。

1.2.6.2 最適初始pH值測定 配制磷酸鈣液體培養(yǎng)基，分組調節(jié)pH值為5、6、7、8、9，按4%接種量接種，在28 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d，菌液8 000 r/min離心10 min，取上清10 mL，加5 mL鉬銻抗顯色劑，加水定容至50 mL，利用分光光度計測定并計算上清液中磷含量。

1.2.6.3 最適生長溫度測定 按4%接種量將菌株接入培養(yǎng)液中，調節(jié)pH值為7，將菌種接于磷酸鈣液體培養(yǎng)基中，分別置于溫度為24、26、28、30、32 ℃的搖床中培養(yǎng)5 d，菌液 8 000 r/min 離心10 min，取上清10 mL，加5 mL鉬銻抗顯色劑，加水定容至50 mL，利用分光光度計測定并計算上清液中磷含量。

1.2.6.4 最適生長轉速測定 按4%接種量將菌株接入培養(yǎng)液中，調節(jié)pH值為7，溫度設置為30 ℃，調節(jié)搖床轉速分別為140、180、200、220 r/min，培養(yǎng)5 d后，菌液8 000 r/min離心10 min，取上清10 mL，加5 mL鉬銻抗顯色劑，加水定容至50 mL，利用分光光度計測定并計算上清液中磷含量。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用 Excel 2010和 SPSS 19統(tǒng)計軟件進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 解磷菌的篩選

對土壤樣品進行涂布處理，初步得到菌株 21株，經復篩，得到具有高效解磷能力的菌株9株，通過鉬藍比色法測量解磷量。由表1可知，9株解磷菌的解磷能力相比于對照都有明顯增加。其中，JWP 2解磷效果最弱，菌液中速效磷含量為10.47 mg/L，比空白對照增加了3.72 mg/L，而菌株JWP3培養(yǎng)液中速效磷含量最高，達到73.22 mg/L，比空白對照增加了66.47 mg/L，其解磷能力最強，本試驗以 JWP3菌株為研究對象，對其菌落特征和解磷特性做進一步研究。

2.2 菌落形態(tài)特征

采用平板劃線法將JWP3菌株進行純化，并涂布至固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2 d后，觀察菌株形態(tài)。如圖1所示，菌株單菌落呈水滴狀，菌落無色透明，邊緣光滑，表面濕潤且黏稠，菌落直徑約為0.5 cm。

2.3 16S rDNA測序分析

菌株JWP3經16S rDNA測序獲得1 400 bp的基因片段，將序列信息提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫中，利用Blast將菌株的基因序列進行相似性比較，結果表明，菌株JWP3與膠質芽孢桿菌屬同源性很高，從16S rDNA序列相似性比較結果看，菌株JWP3與膠質芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）相似性達到100%，選取21株同源性較高的膠質芽孢桿菌菌株序列與待測菌株序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌株JWP3與膠質芽孢桿菌相似性達到100%且處于同一分支，距離最近，鑒定菌株JWP3為膠質芽孢桿菌。

2.4 菌株解磷能力研究

2.4.1 最適初始接種量 由圖3可以看出，從接種量1%開始，隨接種量的增加，速效磷含量呈逐漸上升的趨勢，當接種量為4%時，菌液中速效磷含量達到最大（96.56 mg/L），比接種量為3.0%時高了17.6 mg/L，有顯著性差異，而當接種量達到5%時，解磷量為96.55 mg/L，與4%時無顯著性差異，從經濟角度考慮，選取4%為最適接種量。

2.4.2 最適初始pH值 不同pH值對菌株生長及解磷能力有顯著影響，由圖4可看出，當pH值達到7時解磷量達到最大，菌液中的速效磷含量達到97.28 mg/L，與其他pH值時有顯著差異，當pH值達到6時解磷能力為74.90 mg/L，比pH值 9時高了2.5 mg/L，而比pH值 8時低了13 mg/L，有顯著差異。因此確定，菌株JWP3的最適生長pH值為7，且菌株適合生長于中性或偏堿性的環(huán)境中，這對于菌株的大規(guī)模生產有重要指導意義。

2.4.3 最適培養(yǎng)溫度 溫度的變化對菌株的降解作用有顯著影響，由圖5可看出，隨著溫度的升高，菌株解磷能力逐漸增強，當溫度達到30 ℃時，解磷量達到最高，菌液中的速效磷含量達到112.6 mg/L，比28 ℃時增加了14.6 mg/L，而溫度為32 ℃時，解磷量為89.05 mg/L，與28 ℃時相比，顯著降低，可能是溫度升高導致菌株生長受到抑制，使解磷能力降低，因此確定菌株JWP3的最適生長溫度為30 ℃。

2.4.4 最適搖床轉速 由圖6可看出，不同搖床轉速對菌株解磷作用有明顯影響，當搖床轉速增加時，菌株解磷能力逐漸增加，當轉速達到200 r/min時，菌液中速效磷含量最高（114.5 mg/L），當轉速達到220 r/min時，解磷能力降低，菌液中速效磷含量為96.77 mg/L，比 200 r/min 時明顯減少，二者有顯著差異，其原因可能是轉速過高，產生的剪切力對菌體造成機械損傷，降低了菌株的解磷能力[15]，結果表明菌株JWP3的最適培養(yǎng)轉速為200 r/min。endprint

3 討論

解磷微生物在土壤中磷循環(huán)相關的生物學系統(tǒng)中擔任著重要的角色，它可以將難溶磷素轉化為可溶性磷，提高磷肥利用率。解磷微生物分布十分廣泛，但是，在自然條件下，這些解磷微生物在土壤中的數(shù)量不足，難以發(fā)揮其活性，僅僅依靠自然條件的作用不足以釋放滿足植物生長發(fā)育所需的磷素。因此，人們便設想從自然條件下或生物體內篩選解磷菌株，制成菌劑后回接到土壤中以轉化足夠的有效磷[9-10]。本試驗從周至獼猴桃園根際土壤中篩選出9株具有解磷作用的菌株，采用難溶性磷酸鹽Ca3（PO4）2為磷源，對解磷菌株的降解能力進行測定，國內外已有許多關于解磷菌篩選的報道，解磷菌株多為芽孢桿菌和假單胞菌[11]，其解磷能力一般在 31.5～519.7 mg/L 范圍內[12-13]，本試驗篩選的菌株JWP3解磷能力為114.5 mg/L，處于中等水平。通過菌株形態(tài)特征分析，及16S rDNA測序，并對序列進行比對確定菌株JWP3為膠質芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosu）。

雖然微生物的溶磷能力取決于自身特征，如分泌質子、有機酸和其他物質的數(shù)量和種類[14]，但培養(yǎng)條件的不同也影響了菌株的生長情況和降解特性，從陜西周至縣獼猴桃園土壤中篩選得到的高效解磷菌株JWP3在最適培養(yǎng)條件下，其解磷能力達到114.5 mg/L。試驗表明，菌株JWP3在初始pH值為7，轉速200 r/min，培養(yǎng)溫度30 ℃的條件下解磷能力最強。接種量的選擇，綜合了菌株解磷能力及經濟效益等因素，接種量為4%時解磷能力達到96.55 mg/L，與5%接種量時的9656 mg/L無顯著差異，故確定最適接種量為4%。

目前，大多數(shù)研究者認為解磷菌溶解無機磷是因為解磷微生物在新陳代謝過程中產生的各種有機酸[15-17]，這些有機酸既能降低土壤pH值，又可通過螯合作用結合土壤中的鐵鋁鈣鎂等離子，從而使磷酸鐵、磷酸鈣、磷酸鎂、磷酸鋁等難溶性的磷酸鹽溶解[18]。Illmer等[10]研究認為假單孢菌屬的解磷機制主要是產生質子，降低了培養(yǎng)基的pH值，從而使磷酸鹽溶解。解磷菌的解磷機制是很復雜的，一種解磷菌可能有多個解磷機制[19]，目前對解磷微生物的解磷機制還不是特別清楚，從獼猴桃園土壤中篩選得到的這株解磷菌株JWP3，其解磷機制還需作進一步深入研究。

4 結論

本研究從周至獼猴桃園采集土樣，篩選到129株高效解磷菌，通過復篩和解磷能力的測定，得到1株降解無機磷能力最強的菌株，利用16S rDNA基因序列分析方法對該菌株的分類信息進行鑒定，鑒定結果表明該菌株為膠質芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus），命名為菌株JWP3，其解磷量達到了114.5 mg/L，具有較高的解磷能力。通過試驗確定了該菌株的最適培養(yǎng)條件：初始接種量4%，搖床轉速200 r/min，培養(yǎng)溫度30 ℃，初始pH值為7，為菌株的開發(fā)利用提供了數(shù)據(jù)支持和理論基礎。

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