貴州獼猴桃潰瘍病病菌分離鑒定及其培養(yǎng)特性

龍?jiān)拼?彭熙+李葦潔+劉曼+萬合鋒+任春光

摘要：以貴州省獼猴桃基地內(nèi)獼猴桃感病組織為材料，采用組織分離法分離純化獲得1株病原菌菌株，并從形態(tài)、生理生化、16S rDNA序列對其進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步研究該菌株在不同培養(yǎng)條件下的生長情況。結(jié)果表明，通過致病性測定及形態(tài)、生理生化、16S rDNA分析，明確該菌株為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv.actinidae）；培養(yǎng)基種類、pH值、溫度會對病原菌的生長產(chǎn)生一定影響，菌株生長相對最適培養(yǎng)基為Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基，最適培養(yǎng)條件為pH值7.5、溫度15 ℃。

關(guān)鍵詞：獼猴桃；潰瘍??；丁香假單胞菌；培養(yǎng)特性；16S rDNA

中圖分類號： S436.634.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0114-03

獼猴桃享有水果之王、世界珍果之美譽(yù)，維生素C含量豐富，是等質(zhì)量蘋果的20～80倍[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界獼猴桃栽培面積約20萬hm2，而我國獼猴桃栽培面積占世界份額已超過50%[2]。獼猴桃潰瘍病是一種嚴(yán)重威脅獼猴桃生產(chǎn)的毀滅性細(xì)菌性病害，來勢兇猛，具有傳播快、致病性強(qiáng)、范圍廣、防治難度大等特點(diǎn)[3]，1996年被列為全國森林植物檢疫對象，2009年國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局將其列入禁止入境的有害生物名單，2013年國家林業(yè)局將其視為林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物[4]。

貴州是我國獼猴桃分布中心之一，在修文、六盤水、甕安等地有大規(guī)模種植[5]。近年來，隨著獼猴桃種植面積的擴(kuò)大及對外引種頻繁，獼猴桃潰瘍病有蔓延趨勢[6]。2014—2015年春，對貴州省各獼猴桃基地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分果園有潰瘍病零星發(fā)生，科學(xué)預(yù)防控制獼猴桃潰瘍病害的發(fā)生、發(fā)展，對獼猴桃產(chǎn)業(yè)及食品安全至關(guān)重要。植物病原菌在侵染傳播過程中，其菌株易發(fā)生變異分化[7]，而病原菌的培養(yǎng)特性是病原菌致病機(jī)理、病害流行及防治研究的基礎(chǔ)[8]，貴州省尚無對獼猴桃潰瘍病菌分離和其培養(yǎng)特性系統(tǒng)研究的報(bào)道。本試驗(yàn)從獼猴桃感病組織分離得到病原菌，并對該菌株進(jìn)行生理生化和分子鑒定，研究菌株在不同培養(yǎng)基種類、pH值、溫度、光照等條件下的培養(yǎng)性狀，以期摸清獼猴桃潰瘍病田間發(fā)生和流行規(guī)律，為其科學(xué)防控提供參考與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

2015年3—4月，在貴州六枝特區(qū)、修文縣等獼猴桃產(chǎn)業(yè)園內(nèi)選擇具有代表性的獼猴桃栽培地，根據(jù)發(fā)病情況和受害程度采集典型標(biāo)本帶回實(shí)驗(yàn)室鑒定。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH值7.2～7.4；Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，酵母膏10 g，水1 000 mL，pH值7.2；SPA培養(yǎng)基[9]：蔗糖20 g，蛋白胨5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，水1 000 mL，pH值7.2～7.4；肉汁胨（BPA）培養(yǎng)基[10]：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，蔗糖10 g，酵母膏1 g，水1 000 mL，pH值7.0。瓊脂固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加1.8%瓊脂。

1.3 病原菌分離

取獼猴桃感病組織制片，在德國Carlzeiss生產(chǎn)的Laboval-4型顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，檢查有無菌絲、子實(shí)體、孢子、菌核、菌索、病原線蟲蟲體、蟲卵等，判定病原是否為真菌或線蟲；將感病組織用無菌水沖洗，用75%乙醇擦拭；超凈臺上用無菌手術(shù)刀片在病健交界處切取5 mm見方的小塊，用75%乙醇消毒20 s；無菌水沖洗3遍，接種于PDA、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上恒溫培養(yǎng)，重復(fù)3次，以獼猴桃基地健康植株組織為空白對照。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 致病性測定 將純化后的菌株配成108 CFU/mL菌液，采用針刺法對獼猴桃健康葉片進(jìn)行離體接種；將接種的葉片放入墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察并記錄發(fā)病情況[6]。

1.4.2 菌株形態(tài)及生理生化特征觀察 用平板劃線法[11]將菌種接種于平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，從菌落大小、形狀、邊緣、光澤、質(zhì)地、透明程度及培養(yǎng)基顏色等進(jìn)行觀察。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》開展接觸酶試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V-P）試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、碳源利用試驗(yàn)等，對菌株進(jìn)行生理生化鑒定[12-13]。

1.4.3 分子生物學(xué)鑒定 按照生工生物工程（上海）股份有限公司的SK8255試劑盒操作說明提取基因組DNA。擴(kuò)增16S rDNA序列片段采用16S rRNA基因通用引物，上游引物為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物為：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。采用50 μL PCR反應(yīng)體系：10×Taq buffer（15 mmol/L MgCl2）5 μL，dNTP混合物（2.5 mmol/L） 4 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR循環(huán)反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測、染色、凝膠成像，送寶生物工程（大連）有限公司測定序列，并與NCBI數(shù)據(jù)庫做Blast分析；采用Clustal X軟件將序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株片段進(jìn)行比對，運(yùn)用Mega 5.2軟件采用Neighbor Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其親緣關(guān)系。endprint

1.5 病原菌培養(yǎng)特性

菌株在BPA液體培養(yǎng)基中活化24 h，按1%的接種量分別將培養(yǎng)菌液接種于50 mL pH值為7.0的不同種類液體培養(yǎng)基、不同pH值的BPA培養(yǎng)基中，30 ℃ 150 r/min無光照培養(yǎng)24 h，用分光光度計(jì)測定波長為600 nm時(shí)的吸光度（D600 nm），同時(shí)研究菌株在pH值為7.0的BPA培養(yǎng)基中不同光照、不同溫度對其生長的影響。按1%的接種量將菌液接種于優(yōu)勢培養(yǎng)基中，在優(yōu)化培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)，每隔3 h取樣測定D600 nm；以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。所有測定重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離及形態(tài)特征

試驗(yàn)結(jié)果表明，從多個(gè)感病組織（圖1）均可分離出菌落形態(tài)一致的菌落，而健康組織未分離出菌株；將菌株挑出，純化，制成菌液，用針刺法對獼猴桃新鮮健康葉片進(jìn)行接種，葉片出現(xiàn)褐色病斑，而接種無菌水的獼猴桃葉片正常，說明該菌株R01有致病性；致病菌菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上呈乳白色、圓形、光滑、半透明、生長緩慢、表面濕潤黏稠、易挑?。桓锾m氏染色為陰性，鏡檢發(fā)現(xiàn)該病原菌的菌體為直桿狀或短桿狀，有的稍彎曲，大小為（1.2～2.4） μm×（0.2～0.5）μm，兩端鈍圓，單生（圖2）。

2.2 病原菌生理生化鑒定

試驗(yàn)結(jié)果表明，分離出的菌株接觸酶試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)均表現(xiàn)為陽性，能利用葡萄糖、蔗糖、果糖；吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、氧化酶、淀粉水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)均表現(xiàn)為陰性，不能利用海藻糖、麥芽糖。

2.3 分離菌株16S rRNA基因序列分析

病原菌菌株16S rDNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果由圖3可見，菌株R01的特異性片段大小約為1.5 ku；DNA提取效果相對較好，可用于16S rDNA序列測定分析。16S rRNA測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號為KU543670，經(jīng)Blast分析顯示，菌株R01序列與丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種菌株AB001439.1相似度為99%。由圖4可見，分離菌株R01與丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種處于同一分支上，親緣關(guān)系相對較近，同源性相對較高。

因此，可確定本試驗(yàn)分離的獼猴桃潰瘍病病原菌株為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv.actinidae）。

2.4 分離菌株的培養(yǎng)特性

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株R01在不同培養(yǎng)基中的生長差異較大，其中，在SPA、LB培養(yǎng)基中生長相對較好，在PDA培養(yǎng)基中生長相對最差（圖5）；菌株生長的最適pH值為7.5；pH值為6.5～8.0時(shí)，菌株也可保持較為旺盛的生長能力（圖6）；菌株的最適生長溫度為15 ℃，溫度較低或較高菌株的生長均較為緩慢，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過25 ℃時(shí)，吸光度D600 nm大幅降低，說明此時(shí)隨溫度升高，細(xì)菌的生長受到抑制（圖7）；研究連續(xù)黑暗、光照12 h—黑暗12 h、連續(xù)光照3種方式對菌株生長的影響發(fā)現(xiàn)，光照對丁香假單胞桿菌的生長沒有顯著影響。由圖8可見，菌株R01剛開始培養(yǎng)時(shí)生長緩慢；培養(yǎng)6～9 h，菌株進(jìn)入指數(shù)期快速生長；培養(yǎng)24 h后，菌株生產(chǎn)進(jìn)入穩(wěn)定期，其吸光度D600 nm值穩(wěn)定在1.80左右。

3 結(jié)論與討論

對貴州省六枝特區(qū)、修文縣等地的獼猴桃潰瘍病病原菌進(jìn)行分離，在完成致病性鑒定的基礎(chǔ)上，分離到病原菌菌株R01；菌株R01經(jīng)形態(tài)、生理生化及16S rDNA序列分析，明確該菌株為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv.actinidae），與趙利娜等的研究結(jié)論[10，14-17]一致，這也說明獼猴桃潰瘍病在侵染傳播過程中其病原菌沒有發(fā)生明顯的變異分化。菌株R01能在5～30 ℃溫度條件下生長，其中最適生長溫度為15 ℃；在pH值為6.5～8.0的培養(yǎng)基中也生長較好，而最適pH值為7.5；SPA、LB培養(yǎng)基是菌株R01較為適合的培養(yǎng)基。通過長期田間觀察發(fā)現(xiàn)，獼猴桃潰瘍病田間最適發(fā)病溫度為12～16 ℃，當(dāng)溫度達(dá)到25 ℃以上，田間幾乎不發(fā)病，而本研究的病原菌生長最適溫度與田間最適發(fā)病溫度基本一致，這與李黎等的研究結(jié)論[3，10，15]較為一致。

由于引起田間發(fā)病的因素較為復(fù)雜，是多因素共同作用的結(jié)果，本試驗(yàn)僅考慮病原菌的生長快慢，今后應(yīng)加強(qiáng)該病的致病機(jī)理、致病菌與植物互作機(jī)制、病原菌次生代謝物等方面的深入研究，為獼猴桃潰瘍病的綜合防治提供科學(xué)的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃 誠，周長春，李 偉. 獼猴桃的營養(yǎng)保健功能與開發(fā)利用研究[J]. 食品科技，2007，32（4）：51-55.

[2]高小寧，趙志博，黃其玲，等. 獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病研究進(jìn)展[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2012，29（2）：262-268.

[3]李 黎，鐘彩虹，李大衛(wèi)，等. 獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的研究進(jìn)展[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32（5）：124-133.

[4]邵寶林，王成華，劉露希，等. 獼猴桃潰瘍病生防芽孢桿菌B2的鑒定及應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（26）：103-108.

[5]黃 偉，萬明長，喬 榮. 貴州獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與對策[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（4）：184-186.

[6]任春光，劉 曼，李安定，等. 貴州獼猴桃病害的種類調(diào)查及防治

________________________________________

建議[J]. 中國森林病蟲，2015，34（1）：23-25.

[7]崔朝宇，張超群，周澤科，等. 煙草青枯病菌分離株RSXJ-1的培養(yǎng)性狀及其生物型鑒定[J]. 生物災(zāi)害科學(xué)，2012（2）：153-156.

[8]程艷輝，曹遠(yuǎn)銀，張 晶，等. 稻曲病菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（5）：120-123.

[9]Fahy P，Persley G. A diagnostic guide[M]. Australia：Academic Press，1983：107-374.

[10]趙利娜，胡家勇，葉振風(fēng)，等. 獼猴桃潰瘍病病原菌的分子鑒定和致病力測定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，31（5）：604-608.

[11]Wang S，Gong X，Zhou S，et al. The isolation and identification of ginger blast pathogen and screening of its antagonistic fungus[J]. Journal of Hunan Agricultural University，2014，39（3）：282-285.

[12]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：370-410.

[13]Boone D R，Castenholz R W，Garrity G M. Bergeys manual of systematic bacteriology[M]. New York：Springer，2001：217-289.

[14]張慧琴，毛雪琴，肖金平，等. 獼猴桃潰瘍病病原菌分子鑒定與抗性材料初選[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，28（7）：1181-1187.

[15]王忠肅，唐顯富，劉紹基. 獼猴桃細(xì)菌潰瘍?。╝ctinidia bacterial canker）病原細(xì)菌鑒定[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1992，14（6）：500-503.

[16]邵寶林，劉 瑤，朱天輝，等. 獼猴桃潰瘍病菌的分子檢測技術(shù)研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2013，43（5）：458-466.

[17]黃其玲，高小寧，趙志博，等. GFPuv標(biāo)記獼猴桃潰瘍病菌的生物學(xué)特性及其在土壤、根系中的定殖[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，46（2）：282-291.endprint