馬哈利櫻桃根際產(chǎn)吲哚乙酸細菌多樣性及產(chǎn)素能力研究

趙柏霞+閆建芳+夏國芳+李俞濤+潘鳳榮

摘要：分離6年生砂蜜豆/馬哈利櫻桃的根際細菌，通過16S rDNA基因序列分析確定分類地位，利用比色法篩選IAA產(chǎn)生菌并定量檢測其產(chǎn)素能力。研究發(fā)現(xiàn)，共分離獲得52株細菌，分屬于2個類群11個屬的17個種。對各代表菌株進行產(chǎn)素能力測定，共發(fā)現(xiàn)15株菌可分泌生長素，其中A07、A20、B20及B26菌株具有較強的產(chǎn)素能力。馬哈利砧木作為遼東地區(qū)甜櫻桃的主要砧木，其根際促生菌的多樣性分析及菌株利用研究較少，本研究為甜櫻桃增產(chǎn)及生物菌肥開發(fā)提供了重要菌株資源。

關鍵詞：馬哈利櫻桃；根際細菌；多樣性；吲哚乙酸；產(chǎn)素能力

中圖分類號： S662.501 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）20-0169-04

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）指生存于植物根際、根表，并能直接或者間接促進或者調(diào)節(jié)植物生長的微生物。這類微生物一般具有固氮、解磷、產(chǎn)生植物激素等能力或者至少其中之一的能力。1978年，研究人員首次在馬鈴薯上發(fā)現(xiàn)并報道了PGPR，經(jīng)過了30多年的發(fā)展，這類菌被大量報道，其中包括了假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、固氮螺菌屬（Azospirillum sp.）[1]、克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）[2]、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）[3-4]、固氮菌屬（Azotobacter sp.）、腸桿菌屬（Enterobacter sp.）[5]、節(jié)桿菌屬（Arthobacter sp.）[6]、布克霍爾德氏菌屬（Burkholderia sp.）[7]等。這些菌種部分已經(jīng)作為新型肥料的菌源在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中開發(fā)利用。Kumar等從葫蘆巴的根瘤中分離的E. meliloti 和R. leguminosarum具有多重促生活性，并對Fusarium oxysporum具有一定的拮抗作用[8]。王光華等從大豆根際土壤分離到一株芽孢桿菌BRF-1，該菌對7種病原菌有較好的拮抗作用[9]。

馬哈利[Cerasus mahaleb （L.） Mill.]是一種歐美普遍應用的甜櫻桃砧木，該種櫻桃根系發(fā)達，固地性好，耐旱、耐寒、耐貧瘠，是我國北方重要經(jīng)濟作物甜櫻桃的主要嫁接砧木[10]。其根際促生菌的種類及數(shù)量對于甜櫻桃產(chǎn)量有重要影響。但目前遼東地區(qū)對于該砧木根際微生物及PGPR菌的研究尚未見報道，其研究對甜櫻桃的增產(chǎn)及品質提高具有重要意義。

本研究對6年生砂蜜豆/馬哈利櫻桃樹的根際細菌進行分離鑒定，并以植物生長素吲哚乙酸（IAA）為指標進行產(chǎn)素能力測定，篩選到了馬哈利根際促生細菌并明確了其產(chǎn)素能力，為生物促生菌肥的開發(fā)利用提供了豐富的資源。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

土壤樣品采集自遼寧省大連市農(nóng)業(yè)科學研究院甜櫻桃園，采集時選擇生長良好的6年生甜櫻桃根部土壤，除去土壤表面覆蓋的凋落物及雜物，鏟除表面約5 cm厚的土壤，用滅菌鏟采集5～20 cm深的根際土壤，裝于滅菌袋中，過20目篩后4 ℃保存。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。IAA檢測培養(yǎng)基為含L-色氨酸LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，色氨酸100 mg/L，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2。

1.3 菌株分離純化

采用梯度稀釋法分離土壤中細菌菌株，純化后編號LB斜面上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 16S rDNA擴增

將菌株用LB培養(yǎng)液培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）提取菌株總DNA。以細菌通用引物27F/1525R（引物1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；引物2：5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3）進行PCR擴增。50 μL PCR反應體系為Taq酶（5 U/μL）0.3 μL，10×Buffer（Mg2+）4 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，引物（10 μmol/L）各2 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反應條件：95 ℃、5 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35個循環(huán)；72 ℃、5 min。PCR擴增產(chǎn)物采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，4S Red（上海生工）染色后，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）中觀察照相。

1.5 測序

16S PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）有限公司進行測序。測序結果在EzTaxon網(wǎng)站與細菌模式菌株的16S rDNA序列進行比對。用MEGA 6.0 對16S rDNA 基因相似度高的菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹。將測得的16S rDNA全序列提交Genbank數(shù)據(jù)庫（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得序列登錄號。

1.6 IAA產(chǎn)生菌的篩選

將分離純化后的細菌接種于含有L-色氨酸（100 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)1 d。按照Libbert等的方法[11]進行顯色反應。以加入50 μL IAA[50 mg/L，生工生物工程（上海）有限公司，純度>99%]的標準液作為陽性對照，以加入50 μL無菌培養(yǎng)液作為陰性對照。白色陶瓷板置于避光條件下、室溫反應30 min后，觀察顏色變化，顏色變紅者表示能夠產(chǎn)IAA，且顏色越深表示分泌的能力越強，否則表示不能產(chǎn)生IAA。

1.7 IAA產(chǎn)素能力的測定

采用上述培養(yǎng)條件，對初篩獲得能夠分泌IAA的根際細菌進行定量測定，測定菌懸液的D600 nm值后，將菌懸液 10 000 r/min 離心10 min，取上清液按照Glickmann等的方法[12]測定D530 nm值。同時以分析純IAA繪制吸光度-濃度標準曲線，以計算待測樣品中IAA含量。endprint

2 結果與分析

2.1 可培養(yǎng)細菌16S rDNA擴增與測序

通過稀釋分離法分離到細菌菌株52株，挑取培養(yǎng)形態(tài)不一致的菌株，以27F/1525R為引物進行16S rDNA片段擴增，得到長度約為1 400 bp的擴增片段，將所得的PCR產(chǎn)物進行測序，測序后得到的基因序列與EzTaxon細菌模式菌株的16S rDNA基因序列進行比對，用MEGA 6.0 對16S rDNA基因相似度高的菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹。將序列提交GenBank，所得收錄號為KX792235～KX792257。

試驗結果（圖1、表1）顯示，篩選出的菌株分布在細菌域2個綱11個屬17個種中。其中放線菌門（Actinobacteria）最多，占約70%，為最優(yōu)勢類群，分別歸屬于微球菌屬（Micrococcus）、紅球菌屬（Rhodococcus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）等。其次是厚壁菌門，其中共有6株細菌與芽孢桿菌屬（Bacilus）相似度高達99%～100%，占85.7%，為分離到的最優(yōu)勢菌屬。

2.2 IAA產(chǎn)生菌的篩選

根據(jù)分離純化結果，以23株根際細菌為代表進行分泌IAA性能測定，測定結果表明，23株根際細菌中共有15株具有分泌IAA的能力，但存在一定的差異。4株深粉色，4株粉色，7株淺粉色，顏色越深表明分泌IAA的能力越強（表2）。

2.3 PGPR菌的IAA產(chǎn)生能力測定

將初篩的具有分泌IAA能力的菌株進行定量測定，根據(jù)標準曲線計算IAA產(chǎn)生能力。結果（圖2、圖3）發(fā)現(xiàn)，分離自馬哈利櫻桃根際土壤的2個綱的根際細菌均有分泌IAA的能力，但是分泌能力有明顯差異。其中顯示深粉色的4株細菌為厚壁菌門中的B20（Bacillus aryabhattai）分泌能力最強，產(chǎn)IAA量為33.07 mg/L；其次是放線菌門的A07（Patulibacter americanus），產(chǎn)IAA量為21.24 mg/L；放線菌門的B26（Microbacterium oleivorans）分泌量位居第3，產(chǎn)IAA量為1890 mg/L；第4為放線菌門的A20（Agromyces neolithicus），分泌量為 18.84 mg/L。

3 結論與討論

本研究對遼東地區(qū)重要經(jīng)濟作物甜櫻桃的主要砧木馬哈利根際的可培養(yǎng)細菌種群進行了研究，共分離獲得52株細菌，分布屬于11個屬的17個種，顯示了櫻桃根際可培養(yǎng)細菌豐富的種群多樣性。經(jīng)顯色篩選發(fā)現(xiàn)15株細菌可分泌生長素或其類似物，其中Patulibacer sp. A07、Agromyces sp. A20、Bacillus sp. B20 及 Microbacterium sp. B26菌株具較強的產(chǎn)IAA能力，均達到18 mg/L以上。這些種屬和已經(jīng)報道過的PGPR相似[13]。其中B20和B26所屬的Bacillus、Microbacterium屬已經(jīng)在蔬菜、煙草及果樹上被大量報道了具有促生功能[5，14-15]。而Patulibacer sp.和Agromyces sp.在國內(nèi)外都罕有報道，本試驗首次從馬哈利櫻桃根際分離到，并檢測到具有產(chǎn)IAA能力。其中A07、B20等在盆栽試驗中具有較好的促生作用（另文發(fā)表）。

大量資料表明，植物根際細菌是篩選PGPR的重要資源庫?，F(xiàn)有報道表明假單胞菌屬和芽孢桿菌屬的植物根際細菌具有防病促生的能力[16-17]。PGPR集中的一些菌屬有假單胞菌屬（Pseudomonas）、布克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等。本試驗分離出的馬哈利根際產(chǎn)IAA細菌，歸屬于4個目10余個屬，即使有些菌種產(chǎn)IAA能力較低，但在一定程度上反映出馬哈利根際土壤中蘊藏著豐富的微生物資源。這些菌種的產(chǎn)素能力受培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等因素影響很大。因此，可以通過篩選培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)條件來提高產(chǎn)素能力。

本試驗首次對砂蜜豆/馬哈利櫻桃的根際微生物進行研究，篩選出近60%的根際細菌都是具有產(chǎn)IAA能力的，這將為甜櫻桃生物菌肥產(chǎn)業(yè)提供巨大的微生物資源，創(chuàng)造良好的根際生態(tài)環(huán)境，實現(xiàn)遼東經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)的進一步增產(chǎn)創(chuàng)收。

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