大鼠面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中VGCC表達(dá)變化的研究

曹鸝儷 胡榮城 樸正根

大鼠面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中VGCC表達(dá)變化的研究

曹鸝儷 胡榮城 樸正根

目的探討大鼠面神經(jīng)切斷后面神經(jīng)核運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中電壓門控性鈣離子通道(VGCC)的表達(dá)變化。方法用熒光染料Dil神經(jīng)逆行示蹤確定面神經(jīng)核位置，并通過尼氏染色確認(rèn)。建立大鼠面神經(jīng)損傷模型，左側(cè)為手術(shù)組行面神經(jīng)主干切斷，右側(cè)為假手術(shù)組僅暴露面神經(jīng)。于術(shù)后3、 7、 14、 28 d取面神經(jīng)核標(biāo)本，免疫組織化學(xué)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)P/Q、N、L、R型鈣離子通道α1A、α1B、α1C、α1E亞基的表達(dá)。結(jié)果免疫組化：手術(shù)組α1B、α1C亞基陽性表達(dá)在術(shù)后3 d開始降低， 14 d達(dá)到最低(Plt;0.01)， 28 d回升至對(duì)照組水平(Pgt;0.05)，而α1A、α1E亞基陽性表達(dá)無明顯變化(Pgt;0.05)。RT-PCR：手術(shù)組α1B、α1C亞基mRNA表達(dá)水平下降， 14 d表達(dá)最弱(Plt;0.01), 28 d基本恢復(fù)至正常(Pgt;0.05)， α1A、α1E亞基mRNA表達(dá)無顯著變化(Pgt;0.05)。結(jié)論VGCC參與面神經(jīng)損傷，N型和L型鈣離子通道可能以下調(diào)方式發(fā)揮作用。

電壓門控性鈣離子通道(VGCC)； 面神經(jīng)； 神經(jīng)損傷； 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元； 神經(jīng)再生

Ca2+是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，廣泛參與機(jī)體的各種功能活動(dòng)，包括細(xì)胞生長代謝、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、基因表達(dá)和電生理等[1]。電壓門控性鈣離子通道(voltage-gated calcium channels，VGCC)是Ca2+進(jìn)入興奮性細(xì)胞的主要途徑，有重要的臨床藥理作用，是許多藥物開發(fā)的有效靶點(diǎn)[2]。神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在多種亞型的VGCC，根據(jù)電生理學(xué)及藥理學(xué)特性不同分為[3]：①高電壓激活鈣離子通道，包括P/Q、 N、 L及R型；②低電壓激活鈣離子通道，只有T型。研究表明，神經(jīng)損傷可擾亂細(xì)胞膜的通透性、細(xì)胞內(nèi)外間電化學(xué)梯度改變，引起神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，Ca2+濃度及其所介導(dǎo)的信號(hào)通路改變將造成一系列代謝紊亂[4-5]。

面神經(jīng)損傷后不但神經(jīng)纖維發(fā)生變性，而且中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元也發(fā)生變化，包括形態(tài)結(jié)構(gòu)、分子代謝的改變。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠面神經(jīng)損傷模型，利用免疫組織化學(xué)和RT-PCR等技術(shù)研究面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中鈣離子通道各亞基的表達(dá)變化，探討鈣離子通道在面神經(jīng)損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

兔抗鼠Cav2.1(α1A)、Cav2.2(α1B)、Cav1.2(α1C)、Cav2.3(α1E)多克隆抗體(Alomone Labs，以色列)；SP試劑盒、DAB試劑盒(北京中杉金橋生物工程有限公司)；Dil(Molecular Probe，美國)；Trizol試劑(Molecular Research Center，美國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific Fermentas，美國)；冷凍切片機(jī)CM 1900，熒光顯微鏡DM6000 B(Leica，德國)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 健康雄性SD大鼠40只，體重約 180～200 g(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左側(cè)為手術(shù)組(operated group, Op)，右側(cè)為假手術(shù)對(duì)照組(control group, Ct)，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)3、 7、 14、 28 d隨機(jī)分為4 個(gè)小組(n=10)。 大鼠用3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射后，常規(guī)外科消毒、鋪巾。沿著大鼠耳廓軟骨下緣行弧形切口，依次切開皮膚，逐層分離組織至莖乳孔處。手術(shù)組在左側(cè)莖乳孔處暴露面神經(jīng)并將面神經(jīng)主干完全切斷，右側(cè)為假手術(shù)對(duì)照組僅暴露面神經(jīng)不切斷，充分止血后縫合創(chuàng)口。

1.2.2 確認(rèn)面神經(jīng)核位置 首先另取3 只SD大鼠用于確認(rèn)面神經(jīng)核位置，手術(shù)方法同上，將Dil晶體置于左側(cè)面神經(jīng)主干近端斷面。術(shù)后7 d大鼠深度麻醉后經(jīng)常規(guī)心臟灌注固定，先快速灌注150 ml生理鹽水沖凈血液，再換4%多聚甲醛300 ml，先快后慢。灌注后立即取材，以斜方體下方與延髓交界為標(biāo)志點(diǎn)橫斷腦干，向上下水平各切取約2 mm的腦組織。將標(biāo)本置于4%多聚甲醛， 4 ℃過夜，用PBS充分漂洗后20%、 30%梯度蔗糖脫水直至沉底。組織經(jīng)修整后制作30 μm的冷凍切片，每2 片取1 片，切片放在裝有防凍液的24 孔板中， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將切片貼于載玻片上，熒光顯微鏡觀察Dil標(biāo)記的神經(jīng)元。尼氏染色：切片經(jīng)二甲苯、逐級(jí)乙醇脫脂后雙蒸水洗；1%甲苯胺藍(lán)2 min，雙蒸水洗；70%、95%乙醇鏡下分化，脫水透明后中性樹膠封片，光鏡觀察。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 術(shù)后3、 7、 14、 28 d取面神經(jīng)核標(biāo)本制作冷凍切片，方法同上。如無特別說明，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。切片于24 孔板中PBS洗5 min×3 次； 3% H2O2孵育10 min，PBS洗5 min×3 次； 山羊血清工作液孵育20 min，吸去多余封閉液，不洗；分別滴加稀釋的一抗， 4 ℃過夜： ① Anti-Cav2.1(α1A) 1∶200; ② Anti-Cav2.2(α1B) 1∶25; ③ Anti-Cav1.2(α1C) 1∶300; ④ Anti-Cav2.3(α1E) 1∶100; ⑤ 陰性對(duì)照：用PBS代替一抗；PBS洗5 min×3 次，生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG孵育20 min； PBS洗5 min×3 次，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育20 min，PBS洗5 min×3 次； DAB顯色，鏡下觀察直到滿意；清水洗10 min終止顯色，貼于載玻片上晾干；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

選取同一層面的5張切片，每張切片隨機(jī)選5個(gè)高倍鏡視野(×400)拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)量，用累積吸光度值除以面積計(jì)算平均吸光度值(mean density，MD)，所得數(shù)值用手術(shù)組/對(duì)照組(Op/Ct)數(shù)值表示，對(duì)照組設(shè)為1.0。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè) 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)大鼠麻醉后斷頸獲取腦干，取面神經(jīng)核組織用Trizol提取總RNA，按RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。引物序列，α1A上游引物5′-CGTGGTGA-GAAAATACGCCAAA-3′，下游引物5′-AGCTGGCGA-CTCACCCTGGATG-3′。α1B上游引物5′-ACGTCGTCCG-CAAATACGCTAAG-3′，下游引物5′- ATCACACTGACGAGCAGGGGGATCTTT-3′。α1C上游引物5′-TGGCTGGAGGTGACATCGAGGGAGAA-3′，下游引物 5′-ATCGAACGTGCTCCTACGGGTCTGCA-3′。α1E上游引物5′-CATTGTCAGGAAATACGCCAAGAAGCT-3′，下游引物5′-TTGTTCATGAAGCATGCTCGATGCAAC-3′。β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)上游引物5′-GAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物5′-TAGAAGCATTTGCGGTGC-3′。PCR擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min， 94 ℃變性30 s， 72 ℃延伸1 min， 35 個(gè)循環(huán)， 72 ℃總延伸10 min其中α1A、α1C、α1E及β-actin， 54 ℃退火45 s； α1B， 58 ℃退火30 s。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像。 用Quantity one軟件進(jìn)行灰度分析，計(jì)算目的基因與β-actin比值作為目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 Dil神經(jīng)逆行示蹤

熒光顯微鏡下可見手術(shù)側(cè)被標(biāo)記神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)、突起呈紅色熒光，細(xì)胞核不著色，與周圍組織分界清楚，位于延髓腹外側(cè)(圖 1A、B)。

2.2 尼氏染色

兩側(cè)神經(jīng)元均分布于延髓腹外側(cè)，手術(shù)組與對(duì)照組相比，神經(jīng)元染色較深、分布較集中、各亞核定位分區(qū)不明顯(圖 1C、D)。

2.3 免疫組織化學(xué)

光鏡下，α1A、α1B、α1C、α1E亞基陽性反應(yīng)物質(zhì)呈棕色或褐色細(xì)顆粒，分布于面神經(jīng)核運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞質(zhì)和突起，手術(shù)組與對(duì)照組都有α1A、α1B、α1C、α1E亞基陽性細(xì)胞出現(xiàn)，術(shù)后不同時(shí)期各亞基的表達(dá)(圖 2)。陰性對(duì)照結(jié)果為陰性。面神經(jīng)損傷后各亞基陽性表達(dá)水平變化見表 1， 術(shù)后3 d手術(shù)組α1B、α1C亞基陽性表達(dá)開始降低， 14 d時(shí)降低最為明顯，與對(duì)照組相比差異有顯著性(Plt;0.01)， 28 d時(shí)回升至對(duì)照組水平(Pgt;0.05)，而手術(shù)組α1A、α1E亞基的各時(shí)間點(diǎn)陽性表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異(Pgt;0.05)。

2.4 RT-PCR

面神經(jīng)損傷后各亞基mRNA電泳結(jié)果見圖 3，各亞基mRNA相對(duì)量表達(dá)變化見表 2。手術(shù)組α1B、α1C亞基mRNA表達(dá)水平在術(shù)后下降， 14 d最低(Plt;0.01)， 28 d基本恢復(fù)至對(duì)照組水平(Pgt;0.05)，α1A、α1E亞基的mRNA表達(dá)水平無明顯變化(Pgt;0.05)。

圖 1 確認(rèn)面神經(jīng)核位置(A、C: ×12; B、D: ×400)

Fig 1 Identification of facial motor nucleus(A, C: ×12; B, D: ×400)

Tab 1 The expression change of α1A、α1B、α1C、α1E subunits immunoreactivity in the facial nucleus after facial nerve injury (±s, n=5)

注： ① 與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(1.000)相比，Plt;0.05; ② 與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(1.000)相比,Plt; 0.01

Tab 2 mRNA expression of α1A、α1B、α1C、α1E subunits at corresponding time point after facial nerve injury (±s, n=5)

注： ① 與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(1.000)相比，Plt;0.05; ② 與相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組(1.000)相比,Plt;0.01

3 討 論

面神經(jīng)損傷后雖然可以通過顯微外科手術(shù)修復(fù)神經(jīng)的連續(xù)性，但神經(jīng)功能的恢復(fù)常常不理想，影響患者的生活質(zhì)量[6]。神經(jīng)修復(fù)和再生因素復(fù)雜，包括神經(jīng)元存活狀態(tài)、周圍微環(huán)境變化、軸突與靶器官連接等[7]。

神經(jīng)損傷后可引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平發(fā)生變化，通過配體門控性鈣離子通道[8]和多種VGCC，使細(xì)胞膜上鈣離子通道開放，胞外Ca2+內(nèi)流；或是通過胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+。這些都可造成細(xì)胞內(nèi)的鈣超載，鈣超載是引發(fā)細(xì)胞變性和死亡的最后通路[9-10]。Ca2+在神經(jīng)損傷的應(yīng)激、再生過程中發(fā)揮重要作用，適當(dāng)濃度的鈣流可以阻止神經(jīng)元損傷后死亡、促進(jìn)神經(jīng)元恢復(fù)、軸突再生、調(diào)節(jié)突觸可塑性等[11]。Gomez等[12]研究也表明，減少細(xì)胞內(nèi)鈣流入的頻率可以增加生長錐再生和軸突延長。

圖 2 面神經(jīng)損傷后α1A、α1B、α1C、α1E亞基在面神經(jīng)核神經(jīng)元中的表達(dá)(免疫組化染色,×400)

Fig 2 Expression of α1A, α1B，α1C，α1Esubunits in the facial motoneurons after facial nerve injury(IHC staining,×400)

圖 3 RT-PCR檢測(cè)面神經(jīng)損傷后α1A、α1B、α1C、α1E亞基 mRNA的表達(dá)

Fig 3 The expression of α1A, α1B, α1C, α1Esubunits mRNA examined by RT-PCR after facial nerve injury

VGCC普遍存在機(jī)體的各種組織和細(xì)胞，在神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布在神經(jīng)元胞體、突起等部位，Ca2+通過VGCC進(jìn)入細(xì)胞對(duì)神經(jīng)突的延伸起啟動(dòng)作用[13]。Plant等[14]通過膜片鉗技術(shù)和RT-PCR發(fā)現(xiàn)T、 N、 L和Rslow型鈣離子通道存在于新生大鼠面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體，雖然胞體中沒有發(fā)現(xiàn)P/Q型鈣離子通道，但是α1A、 α1B、 α1E亞基在mRNA的表達(dá)中占主要部分，VGCC在面神經(jīng)核神經(jīng)元上的類型與腦干其他神經(jīng)元有明顯不同。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了α1A、 α1B、 α1C、 α1E亞基在大鼠面神經(jīng)核運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中有表達(dá)，提示P/Q、N、L及R型鈣通道在面神經(jīng)核中參與對(duì)神經(jīng)元的細(xì)胞骨架功形成、細(xì)胞代謝和增殖、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等正常生理功能的調(diào)節(jié)。

外周神經(jīng)切斷后，神經(jīng)元存活則軸突可以再生，成年大鼠在面神經(jīng)切斷但神經(jīng)斷端不發(fā)生偏離的情況下，神經(jīng)功能從2～4 周開始恢復(fù)[15]。Angelov等[16]研究表明，在面神經(jīng)切斷后行面神經(jīng)端端吻合術(shù)的模型中，辣根過氧化物酶逆行標(biāo)記的軸突再生與靶器官連接的神經(jīng)元從第14 天開始出現(xiàn)。Che等[17]在面神經(jīng)切斷后，用麥芽凝集素逆行標(biāo)記面神經(jīng)核運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元在神經(jīng)損傷后7～14 d開始與肌肉建立新的連接，到35 d時(shí)有近80%的神經(jīng)元完成對(duì)神經(jīng)的再支配。在本實(shí)驗(yàn)中， N、 L型鈣離子通道的α1B、 α1C亞基免疫陽性強(qiáng)度及mRNA表達(dá)水平在神經(jīng)損傷后3 d開始下降，到14 d時(shí)降至最低， 28 d基本回升至正常水平，與神經(jīng)再生功能恢復(fù)的時(shí)間基本相同。

L型鈣通道激活時(shí)表現(xiàn)為持續(xù)長時(shí)間Ca2+內(nèi)流，在培養(yǎng)的交感神經(jīng)元，Ca2+通過L型鈣通道進(jìn)入細(xì)胞對(duì)軸突再生起關(guān)鍵作用[18]。Mattsson等[19]通過免疫組織化學(xué)證實(shí)L型鈣通道位于正常和再生的面神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樹突和軸突，并且L型鈣通道拮抗劑尼莫地平通過增加軸突和髓鞘的數(shù)量和大小來促進(jìn)損傷面神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。面神經(jīng)損傷后應(yīng)用L型鈣通道阻滯劑可加速面神經(jīng)再生，起神經(jīng)保護(hù)作用[20-22]?？赡軝C(jī)制：通過阻斷L鈣通道減少胞內(nèi)Ca2+堆積和減輕軸突腫脹；加速損傷區(qū)域的氧和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌；另外，在神經(jīng)生長錐中Ca2+水平起積極的影響，促進(jìn)軸突發(fā)芽。

N型鈣通道目前僅在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，其功能主要為調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流和神經(jīng)遞質(zhì)釋放，包括P物質(zhì)、谷氨酸等。Shahlaie等[23]通過體外培養(yǎng)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的創(chuàng)傷性腦損傷模型，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后Ca2+內(nèi)流及谷氨酸增加、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞死亡，應(yīng)用N型鈣通道阻滯劑SNX-185可減少Ca2+內(nèi)流和谷氨酸釋放，使神經(jīng)元存活數(shù)目增多。在脊髓損傷后應(yīng)用L型或N型鈣通道拮抗劑可以顯著增加復(fù)合動(dòng)作電位振幅的恢復(fù), 而聯(lián)合應(yīng)用這些拮抗劑比單獨(dú)應(yīng)用更能改善復(fù)合動(dòng)作電位振幅[24]。

因此我們推測(cè)N、L型鈣通道可能在面神經(jīng)損傷后以下調(diào)的方式減少神經(jīng)元及新生軸突中Ca2+的含量，從而適應(yīng)胞體形態(tài)、功能恢復(fù)和新生軸突的需要，對(duì)保護(hù)損傷的神經(jīng)元及軸突的延伸起積極作用。而本研究中，未檢測(cè)到α1A、 α1E亞基的免疫陽性強(qiáng)度及mRNA表達(dá)有明顯的改變，可能是因?yàn)镻/Q、 R型鈣通道參與面神經(jīng)損傷早期的急性反應(yīng)，未能在損傷后幾小時(shí)至幾天的短時(shí)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)α1A、α1E亞基表達(dá)變化的發(fā)生。面神經(jīng)損傷的修復(fù)再生是多因素復(fù)雜的過程，不單只是Ca2+濃度的變化，Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)通路改變可能起更重要的作用。但其相關(guān)具體機(jī)制及Ca2+介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在面神經(jīng)損傷的修復(fù)再生中發(fā)揮怎樣的作用，有待進(jìn)一步研究。

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(收稿： 2016-11-17 修回： 2017-02-20)

VGCCexpressioninfacialnucleusmotoneuronsafterfacialnerveinjuryinadultrats

CAOLili，HURongcheng，PIAOZhenggen.

510632Guangzhou,DepartmentofStomatology，MedicalCollege，Ji'nanUniversity，China

Objective: To investigate the expression change of voltage-gated calcium channels(VGCC) in the facial nucleus motoneurons of adult rats after facial nerve injury.MethodsThe facial motor nucleus was localized by retrograde labeling with a fluorescent dye, Dil, and identified by Nissl staining. The facial nerve injury model was established by amputation of the main trunk of left facial nerve. Exposure of the right facial nerve without nerve transection was used as the control. Rats were sacrificed at 3, 7, 14 and 28 days after injury respectively(n=10), the brainstem containing facial nucleus were collected, the expression of P/Q, N, L, R-type calcium channel α1A, α1B, α1Cand α1Esubunits was examined by immunohistochemistry and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsImmunohistochemistry results show that whereas α1A, α1Esubunits levels did not vary compared with control group 3, 7, 14, 28 days after injury(Pgt;0.05),α1Band α1Csubunits immunoreactivity decreased in the motoneurons after injury, a sharp decrease was detected at 14 days after injury(Plt;0.01), thereafter returned to the control level at 28 days after axotomy(Pgt;0.05). The expression of α1Band α1CmRNA was down-regulated, especially 14 days after the injury(Plt;0.01), and then recovered to normal level at 28 days(Pgt;0.05). In addition,there was no significant difference of α1Aand α1Esubunits and their correspoding mRNA between operated group and control group at all time points(Pgt;0.05).ConclusionVGCC is involved in facial nerve injury and down-regulation of N-type and L-type calcium channels may be one of the role.

Voltage-gatedcalciumchannels(VGCC);Facialnerve;Nerveinjury;Motoneuron;Nerveregeneration

510632 廣州， 暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院[曹鸝儷(現(xiàn)在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院) 胡榮城 樸正根]

樸正根 E-mail： pzg430@126.com

R782.4

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.005