3 種應(yīng)用于正畸支抗的金屬材料的細(xì)胞毒性和遺傳毒性檢測(cè)

張清華 范紅

3種應(yīng)用于正畸支抗的金屬材料的細(xì)胞毒性和遺傳毒性檢測(cè)

張清華 范紅

目的初步評(píng)價(jià)應(yīng)用于口腔正畸支抗種植體的金屬材料：商業(yè)純鈦(cpTi)，鈦合金(Ti6Al4V),醫(yī)用316L不銹鋼的生物安全性。方法參考國(guó)標(biāo)GB/T16886.5-2003以及醫(yī)療行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T0127.2-2009所規(guī)定的方法，采用體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，體外遺傳毒性實(shí)驗(yàn)及急性全身毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)3 種材料進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果cpTi、 Ti6Al4V和平316L不銹鋼100%浸提液的細(xì)胞毒性分別為0 級(jí)、1 級(jí)、 2 級(jí)；DNA OTM分別為2.16±0.09， 9.84±1.78和10.79±0.39; 細(xì)胞尾部DNA分別為(0.43±0.01)%、 (0.92±0.43)%和(1.22±0.06)%。小鼠體內(nèi)急性毒實(shí)驗(yàn)3 種材料顯示毒性體征，未引起小鼠體重變化。結(jié)論cpTi生物安全性優(yōu)于Ti6Al4V和316L。

商業(yè)純鈦； 鈦合金； 不銹鋼； 生物安全性

隨著不同類型微型種植支抗釘?shù)牟粩嘤楷F(xiàn)，商業(yè)純鈦由于其合適的機(jī)械性能和出色的生物相容性廣泛應(yīng)用在種植體市場(chǎng)[1-2]， 然而商業(yè)純鈦(cpTi)的抗疲勞強(qiáng)度低于鈦合金(Ti6Al4V)[3]，Ti6Al4V一直是整形外科應(yīng)用較多的材料，其較純鈦具有更好的機(jī)械性能和抗腐蝕性能，并且具有比純鈦更低的彈性模量[4]。然而由于口腔環(huán)境存在腐蝕作用，Ti6Al4V釋放的金屬離子可能與臨床上種植體失敗以及一系列毒性反應(yīng)有關(guān)，所以本文將對(duì)目前應(yīng)用于臨床的3 種正畸支抗種植體材料通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)。目前，廣泛應(yīng)用于正畸領(lǐng)域的支抗種植體的材料主要有Ti6Al4V，商業(yè)純鈦，醫(yī)用316L不銹鋼[5],至今未見(jiàn)關(guān)于上述三者綜合的生物安全性評(píng)價(jià)文獻(xiàn)報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)3 種應(yīng)用于正畸支抗種植體的材料進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料及試樣的制備

試樣制備按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，將純鈦、鈦合金、不銹鋼(北京有色金屬研究院提供)采用機(jī)械加工的方法，分別制備成直徑15 mm，厚1 mm以及直徑10 mm、厚度為1 mm的圓片，金相砂紙打磨至3000目，各組取10 枚鈦片經(jīng)過(guò)丙酮，無(wú)水乙醇，去離子水各10 min超聲振蕩清洗。干燥，紫外線雙面照射30 min消毒備用。

1.2 材料浸提液的制備及所需試劑

按照標(biāo)準(zhǔn)CB/T16886.12中所描述的方法進(jìn)行浸提液的制備。將上述消毒后的樣品浸泡于含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中按照3 cm2/ml比例進(jìn)行浸提，置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜止浸提72 h，制得的浸提液按照實(shí)驗(yàn)需要稀釋成原始濃度的50%,作為實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照為0.1%的苯酚。置于4 ℃冰箱備用。

1.3 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人成骨樣細(xì)胞MG-63用0.25%的胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/ml,加入96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)孔200 μl培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后，待細(xì)胞數(shù)目達(dá)到80%以后空白對(duì)照組用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置換，實(shí)驗(yàn)組分別用100%，50%的浸提液置換，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)6復(fù)孔。培養(yǎng)后的第1、3、5天各取1 塊96孔板，加入CCK-8,培養(yǎng)1 h,檢測(cè)用紫外分光光度計(jì)(Muhiscan, Thermo,美國(guó))于450 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative growth rate, RGR)。

細(xì)胞相對(duì)增殖率應(yīng)用以下計(jì)算公式： RGR(%)=(A sample/A control)×100%(A sample：待測(cè)樣本的吸光光度值，A control：對(duì)照組的吸光光度值)

根據(jù)5 級(jí)毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)(cytotoxicity grade, CTG)，對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)(表 1)。

表 1 RGR和CTG之間的關(guān)系

1.4 遺傳毒性的檢測(cè)

單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(SCGE)主要參考Singh等[10]所描述的方法并加以改進(jìn)。

1.4.1 單細(xì)胞懸液的制備 細(xì)胞暴露于合金浸提液后，消化細(xì)胞，經(jīng)1 000 r/min離心洗滌后，懸浮于預(yù)冷的PBS中，使細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度約為1×106個(gè)/ml，同時(shí)用臺(tái)盼蘭染色技術(shù)細(xì)胞的存活率，以保證細(xì)胞存活率大于95%。

1.4.2 制片 取100 μl 1%正常熔點(diǎn)瓊脂糖鋪在潔凈的黏附載玻片置于4 ℃冰箱中,待瓊脂糖凝固,將10 μl單細(xì)胞懸液，約含1×104個(gè)細(xì)胞，與75 μl 0.65%低熔點(diǎn)瓊脂糖混合均勻,鋪于第一層瓊脂糖上，置于4 ℃冰箱10 min待瓊脂糖凝固。每個(gè)樣本制備2 個(gè)平行樣本。

1.4.3 細(xì)胞的裂解 將載玻片浸入新配置的預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中4 ℃冰箱放置1 h。

1.4.4 電泳 取出載玻片，在蒸餾水中漂洗3 次，去除殘留的細(xì)胞消化液，放置于水平電泳槽中，加入新配置的電泳緩沖溶液(pH=13)避光作用20 min，使DNA解旋，在300 mA、20 V條件下電泳20 min(1 V/cm)。

1.4.5 中和染色 用預(yù)冷的Tris中和緩沖液浸洗3 次，每次晾干，用溴化乙錠EB(20 μl，25 mg/L)染色，再蓋上蓋玻片，放置于熒光顯微鏡下讀片。

所有步驟黃光下進(jìn)行，避免額外的DNA損傷。

1.4.6 讀片分析 400 倍熒光顯微鏡(OLYMPUS-BX51)下觀察(熒光激發(fā)波長(zhǎng)為590 nm),數(shù)碼相機(jī)(OLYMPUS-DP50)拍攝，每個(gè)樣本取200 個(gè)細(xì)胞，使用CASP軟件分析細(xì)胞尾部DNA百分含量(percentage of DNA in the tail,%tail DNA)和Olive尾相(olive tail moment,OTM)作為DNA損傷的指標(biāo)。

1.5 急性全身毒性實(shí)驗(yàn)

1.5.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年白化小白鼠35 只，體重150～280 g(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料隨機(jī)分成7 組(n=5)。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)方法 按照標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993-11,2006所描述的全身毒性試驗(yàn)方法進(jìn)行(表 2)。

表 2 急性全身毒性分級(jí)

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

第1天實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組細(xì)胞貼壁，隨著時(shí)間的增加，DMEM對(duì)照組，純鈦組，鈦合金組觀察到鏡下觀察細(xì)胞充分伸展，呈長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)飽滿。316L不銹鋼組細(xì)胞貼壁不完全，視野下細(xì)胞數(shù)量少(圖 1)。采用CCK-8法檢測(cè)各組金屬浸提液是否具有細(xì)胞毒性，分別應(yīng)用試劑盒培養(yǎng)1、3、5 d檢測(cè)細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示不銹鋼組3 d和5 d與對(duì)照組DMEM組相比吸光度值較低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。純鈦組細(xì)胞毒性級(jí)別為0 級(jí)，合金組毒性均為1 級(jí)，在第5天時(shí)不銹鋼組細(xì)胞毒性為2 級(jí)，參考表 1純鈦和鈦合金組無(wú)毒性，不銹鋼組具有輕度細(xì)胞毒性(表 3)。

A: 對(duì)照組； B: cpTi組; C: Ti6Al4V組; D: 316 L不銹鋼組

圖 1 細(xì)胞一般形態(tài)觀察(×400)

A: Control group; B: cpTi group; C: Ti6Al4V group; D: 316L stainless steel group

Fig 1 Cell morphology observed by optical microscope(×400)

Tab 3 The absorbance value and RGR of MG-63 cells and the cytotoxicity grade of the samples (n=6，±s，%)

注： ①Plt;0.05, 與空白組相比較

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)

彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陽(yáng)性苯酚組及316L不銹鋼組均有彗尾，純鈦組，陰性對(duì)照組及鈦合金組均未見(jiàn)明顯彗尾(圖 2)。表 4中結(jié)果顯示，316L不銹鋼浸提液組的尾部DNA百分量高于陰性對(duì)照組，但低于陽(yáng)性對(duì)照組，差異均具有顯著性，由此說(shuō)明316L不銹鋼組具有輕微的遺傳毒性。

2.3 急性全身毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

經(jīng)觀察各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般狀態(tài)，肉眼觀察未見(jiàn)明顯的毒性表現(xiàn)，動(dòng)物活躍，反應(yīng)敏捷，毛色光亮，進(jìn)食正常，無(wú)動(dòng)物死亡顯像，但各組動(dòng)物的體重變化顯示不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)小鼠的體重?zé)o一定的影響(表 5)。

A： cpTi組； B： 陽(yáng)性苯酚組； C： 316L不銹鋼組； D： 空白對(duì)照組； E： Ti6Al4V組

圖 2 單細(xì)胞凝膠電泳(彗星)實(shí)驗(yàn)(×400)

A： cpTi； B： Phenol； C： 316L stainless steel； D： Blank； E： Ti6Al4V

Fig 2 Single-cell gel(comet) assay(×400)

Tab 4 Olive tail moment and percentage of DNA in the OTM tail of the different extracts (n=3, ±s)

注： OTM(Olive tail moment)： 尾部DNA占總DNA的百分比與頭、尾部中心間距的乘積； %tail DNA: 尾部DNA百分量，尾部和總彗星熒光百分比

表 5 小鼠實(shí)驗(yàn)前后體重(g,n=5)

Tab 5 Weights of the mice before and after test (g, n=5)

3 討 論

不同材料組成的正畸材料將會(huì)在口腔環(huán)境中釋放不同的金屬離子[6]，材料的這種性能可能與其生物安全性有關(guān)，這種生物安全性是一種相對(duì)的、實(shí)用意義上的安全概念，指在一定接觸水平下，其伴隨的毒性很低或其危險(xiǎn)程度在人們能接受的范圍內(nèi)。種植體失敗的原因很多，已經(jīng)有大量文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行了報(bào)道，因此種植體材料組成是否與種植體失敗有關(guān)還具有爭(zhēng)論。

3.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

研究生物材料的細(xì)胞毒性及對(duì)成骨細(xì)胞形態(tài)、黏附能力的影響是檢測(cè)生物材料相容性的重要指標(biāo)[7-8]。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)作為一種快速，簡(jiǎn)便，重復(fù)性好的方法，廣泛應(yīng)用于生物安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，目前很多方法應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞毒性，其中CCK-8法可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析[9]。因CCK-8法具有簡(jiǎn)單易操作靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用此法對(duì)3 種金屬的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 骨肉瘤細(xì)胞系MG-63被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)材料以及藥物研究中[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中選擇了人成骨細(xì)胞系MG-63作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)制作3 種金屬的浸提液，按照100%、50%的濃度進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，同時(shí)以添加血清的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組。各個(gè)樣本的細(xì)胞相對(duì)增殖率可通過(guò)公式得出。從檢測(cè)結(jié)果看，純鈦浸提液組和陰性對(duì)照組對(duì)細(xì)胞的毒性為0 級(jí)，兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Pgt;0.05)，各個(gè)樣本的細(xì)胞相對(duì)增殖率可通過(guò)公式得出。從時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果和計(jì)算所得的RGR得到純鈦組細(xì)胞毒性等級(jí)為0 級(jí)，隨著時(shí)間增長(zhǎng)，細(xì)胞的相對(duì)增殖率升高。不銹鋼組隨時(shí)間增長(zhǎng)細(xì)胞的增殖率增長(zhǎng)不明顯，第5天有降低的趨勢(shì)，計(jì)算所得第5天100%不銹鋼浸提液對(duì)細(xì)胞毒性等級(jí)為2級(jí)，表明對(duì)細(xì)胞有輕微毒性,鈦合金組結(jié)果表明隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率升高，但其相對(duì)增殖率結(jié)果顯示其細(xì)胞毒性為1 級(jí)，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，但細(xì)胞活性低于純鈦和陰性組，這可能和鈦合金浸提液中析出的Al離子和V離子的濃度有關(guān)[12-13]。以上結(jié)果說(shuō)明316L不銹鋼具有輕微的細(xì)胞毒性，而純鈦及鈦合金對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，其中純鈦的生物相容性較好。這一結(jié)果為臨床選擇支抗種植體的材料提供了參考，應(yīng)盡量選擇無(wú)細(xì)胞毒性的材料。

3.2 遺傳毒性實(shí)驗(yàn)

正畸支抗釘?shù)倪z傳毒性研究少見(jiàn)報(bào)道， Piozzi等[14]將純鈦的微種植體植入大鼠的脛骨內(nèi)，分別于30、60、180 d取大鼠的腎臟，肝臟，肺臟組織，對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)分析以及遺傳毒理學(xué)研究，得出結(jié)論純鈦微種植體不會(huì)引起大鼠組織學(xué)改變以及DNA的損傷，為Ni-Ti合金、商業(yè)純鈦和316L不銹鋼的遺傳毒性通過(guò)電子顯微鏡原位末端標(biāo)記法(EM-ISEL)對(duì)不同試樣制備的浸提液引起的外周血淋細(xì)胞DNA損傷進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ni-Ti合金和商業(yè)純鈦無(wú)遺傳毒性，而316L不銹鋼有遺傳毒性。應(yīng)用彗星實(shí)驗(yàn)進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)具有操作簡(jiǎn)便，精確度高可以從分子水平對(duì)遺傳毒性進(jìn)行分析，明顯優(yōu)于微核試驗(yàn)，染色體畸變實(shí)驗(yàn)[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)3 種金屬浸提液對(duì)MG-63細(xì)胞的DNA損傷來(lái)評(píng)價(jià)其遺傳毒性，從圖中可見(jiàn)過(guò)氧化氫陽(yáng)性組有較為明顯的彗尾，通過(guò)比較尾部DNA含量(%tail DNA)與尾相(OTM)與陰性對(duì)照組比較[15]，純鈦浸提液組，鈦合金組與陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯差別(Pgt;0.05)，而從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，316L不銹鋼浸提液組尾部DNA百分量明顯高于陰性對(duì)照組，但低于陽(yáng)性對(duì)照組，說(shuō)明其對(duì)細(xì)胞的DNA具有一定的損傷，由此我們可以推斷316L不銹鋼組具有輕微的遺傳毒性。

3.3 急性全身毒性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)YY/T0127口腔行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)3 種材料進(jìn)行急性全身毒性評(píng)價(jià)，采用靜脈注射途徑給藥，陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組小鼠均未見(jiàn)死亡及毒性反應(yīng)，3 種金屬浸提液注射的小鼠其體重前后變化進(jìn)行比較分析，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析注射前后體重?zé)o明顯差異(Pgt;0.05)。

對(duì)生物材料的生物相容和遺傳毒性的研究與評(píng)價(jià)，不僅要從整體水平去觀察材料對(duì)生物體的影響，從細(xì)胞水平去觀察對(duì)細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)能力的影響，還要深入到分子水平從DNA的改變來(lái)評(píng)價(jià)這種生物材料的生物相容性，本實(shí)驗(yàn)綜合體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，通過(guò)細(xì)胞水平和分子水平觀察，系統(tǒng)的評(píng)價(jià)了3 種應(yīng)用于正畸支抗種植體領(lǐng)域的金屬材料的生物安全性，為臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)得出316L不銹鋼具有輕微的細(xì)胞毒性及遺傳毒性，而純鈦和鈦合金的生物相容性好，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)均無(wú)毒，為以后這3 種金屬的臨床應(yīng)用提供參考。

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(收稿： 2016-09-23 修回： 2016-12-08)

Comparisonofthebiologicalsafetyofthreemetaldentalmaterials

ZHANGQinghua,FANHong.

030012Taiyuan,ShanxiProvincialPeople'sHospital,China

Objective: To evaluate the biological safety of commercial pure Ti(cpTi), Ti alloy Ti6Al4V and stainless steel 316L.MethodsAccording to the GB/T16886.5-2003 and YY/T0127.2-2009 standards, the extraction of the 3 materials was respectively prepared, cck-8 assay was used to test their cytotoxicity，single cell gel electrophoresis was used to test their genotoxicity，andinvivotest was used to test their acute systemic toxicity.ResultsThe cytotoxicity of 100% extractions of 316L, Ti6Al4V and cpTi was graded to 2, 1 and 0, the olive tal moment(OTM) 10.79±0.39, 9.84±1.78 and 0.92±1.43, the percentage of tail DNA (1.22±0.06)%, (0.92±0.43)% and (0.43±0.01)% respectively. No systemic toxicity and no body weight change was observed in the acute systemic toxicity test in mice.ConclusioncpTi has better biologic safety than Ti6Al4V and 316L.

PureTi;Tialloy;Stainlesssteel;Biologicalsafety

030012 太原， 山西省人民醫(yī)院

張清華 E-mail: 861828704@qq.com

R783.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.008