基于大孔樹脂的黃芪中黃芪甲苷提取液純化工藝研究*

陳 開 周 靜 李 敏 張宇燕 金偉鋒 李曉紅 虞 立

（浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053）

·研究報告·

基于大孔樹脂的黃芪中黃芪甲苷提取液純化工藝研究*

陳 開 周 靜 李 敏 張宇燕 金偉鋒 李曉紅 虞 立△

（浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053）

目的從3種大孔樹脂中篩選出最適合黃芪甲苷提取液中黃芪甲苷純化的大孔樹脂，并對其進行靜態(tài)、動態(tài)吸附-解吸工藝條件優(yōu)化。方法以吸附及解吸附能力為指標，比較D101、D201及AB-8 3種大孔樹脂對黃芪甲苷的吸附效率，通過單因素實驗考察吸附流速、上樣樣品pH值、靜態(tài)吸附時間、洗脫溶劑濃度及洗脫流速對提取黃芪甲苷含量的影響，優(yōu)選樹脂的動態(tài)吸附及解吸附條件，并評價純化后得到黃芪甲苷的純度。結(jié)果黃芪甲苷采用AB-8大孔樹脂進行吸附，最佳吸附pH值為5，最佳吸附速率為1 BV/h，靜態(tài)吸附8 h，采用50%的乙醇洗脫，最佳洗脫速度為1 BV/h。結(jié)論上述所建立的大孔樹脂純化黃芪甲苷的吸附和解吸附效果最好，得到的黃芪甲苷含量較高。

黃芪 黃芪甲苷 大孔樹脂 純化

黃芪分為蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholi-cus （Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補氣升陽，固表止汗，利水消腫，行滯通弊等功效［1-2］。黃芪主要成分包括了皂苷類、黃酮類、多糖等［3-5］。黃芪甲苷在黃芪藥材中含量較高［6］，活性較強［7］。 黃芪甲苷對治療心腦血管疾病［8-10］具有顯著療效。本課題在前期通過醇提法優(yōu)化提取黃芪甲苷的基礎(chǔ)上，利用不同型號大孔樹脂對醇提后的黃芪甲苷進行純化工藝參數(shù) （吸附流速、上樣樣品pH值、靜態(tài)吸附時間、洗脫溶劑濃度及洗脫流速）研究，為黃芪甲苷的工業(yè)生產(chǎn)進一步開發(fā)和利用提供了一定的理論和實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 試藥與儀器

黃芪藥材：購自浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片有限公司，批號：140401，經(jīng)鑒定為蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholi-cus（Bge.）Hsiao 的根，符合2015年版《中國藥典》（一部）“黃芪”項下有關(guān)規(guī)定［11］；黃芪甲苷對照品：購自上海源葉生物科技有限公司，批號：CJ0101QA14；大孔樹脂D201、大孔樹脂AB-8大孔樹脂D101：均購自天津市海光化工有限公司；其余均為分析純。電子天平：XS205，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；紫外可見分光光度計：UV-2800/2802/2802S，上海恒科儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋：HWS26型，上海恒科儀器有限公司。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 黃芪甲苷含量測定 1）對照品溶液制備。黃芪甲苷對照品干燥至恒重，稱取2.36 mg。將其完全轉(zhuǎn)移到25 mL容量瓶中，加入75%甲醇溶解，定容到刻度線。得到黃芪甲苷含量為0.0944 mg/mL的溶液，作為貯備液。2）標準曲線與線性范圍［12］。分別吸取黃芪甲苷對照品貯備液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL， 分裝入 10 mL的具塞試管中。將試管放在水浴鍋中蒸干，保證完全蒸干。分別向試管中加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸，再小心加入高氯酸溶液0.8 mL，輕微振蕩混勻，水浴，70℃，15 min。保持試管在冰浴中，分別向樣品中緩慢加入5 mL純的冰醋酸溶液，取出，搖勻，冷卻至室溫檢測。將檢測波長設(shè)定為585 nm（見圖1，黃芪甲苷在585 nm波長處有最大吸收），依次按質(zhì)量濃度進行檢測，記錄實驗結(jié)果，計算得回歸方程：y＝0.2701x+0.0209（r2＝0.9997）， 在 0.0472～0.236 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 黃芪甲苷最大吸收UV圖

1.2.2 樣品溶液的制備 采用前期優(yōu)化提取條件：85%的乙醇提取黃芪甲苷，料液比為1∶5，回流2 h提取2次。提取液過濾，去除殘渣，濃縮至一定體積，測定黃芪甲苷的含量，其質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL，4℃冷藏備用。

1.2.3 大孔樹脂的預處理［13］取大孔吸附樹脂，浸泡24 h（95%乙醇），除去懸浮物及雜質(zhì)。采用濕法裝柱，用95%乙醇洗滌，洗脫液與水按照1∶2混合，不產(chǎn)生渾濁，則洗滌完成。再用水洗至無醇味，備用。

1.2.4 大孔吸附樹脂型號的篩選［14-16］見表1。 取預處理好的 D101，AB-8，DA201大孔吸附樹脂各 10 mL，分別裝于同一規(guī)格的層析柱中。取樣品溶液40 mL，以3 BV/h流速進行動態(tài)吸附，完全吸附后靜置2 h。用水洗后，再用100 mL 70%的乙醇進行洗脫，收集乙醇洗脫液，按照紫外分光光度法測定黃芪甲苷的含量，計算轉(zhuǎn)移率：轉(zhuǎn)移率 （%）＝100%×醇洗脫液中黃芪甲苷的量/樣液中黃芪甲苷的量。

表1 各型號大孔吸附樹脂的轉(zhuǎn)移率（%）

1.2.5 上樣量的確定 見表2和圖2。取預處理好的樹脂裝柱，將體積為 200 mL 的“1.2.2”項中的樣品溶液，以3 BV/h的流速進行動態(tài)吸附，收集流出液，每20 mL收集1份，測定每份中黃芪甲苷的含量。計算黃芪甲苷的泄露百分率，繪制泄露曲線。結(jié)果確定1 mL樹脂上樣量為5 mL樣品。

表2 泄露百分率分析表

圖2 泄露百分率分析圖

1.2.6 大孔樹脂吸附黃芪甲苷最佳工藝的建立 1）吸附流速的考察。取預處理好的大孔吸附樹脂5份，每份10 mL 裝柱，樣品溶液 50 mL，分別按 1、2、3、4、5 BV/h進行動態(tài)吸附，完全吸附后靜置2 h。收集吸附后的原液，測定黃芪甲苷的含量，計算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明最佳吸附流速為1 BV/h，見圖3。2）上樣樣品pH值考察。取預處理好的大孔吸附樹脂5份，每份10 mL裝柱，樣品溶液 50 mL，將原液分別調(diào)成 pH 為 3、4、5、6、7、8進行吸附，完全吸附后靜置2 h。收集吸附后的原液，測定黃芪甲苷的含量。結(jié)果表明最佳吸附pH值為5，見圖4。3）靜態(tài)吸附時間的考察。取預處理好的大孔吸附樹脂5份，每份10 mL裝柱，樣品溶液50 mL，按3 BV/h 進行動態(tài)吸附， 吸附時間分別為 2、3、4、5、6、7、8、9、10 h。收集吸附后的原液，測定其含量，計算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明最佳吸附時間為8 h，見圖5。4）洗脫溶劑濃度的考察。取預處理好的大孔吸附樹脂5份，按優(yōu)化的動態(tài)吸附條件完全吸附，靜置2 h。先用水洗，再分別依次用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇各100 mL進行洗脫，洗脫流速為3 BV/h，收集各洗脫液，測定黃芪甲苷的含量，計算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明最佳洗脫溶劑濃度為50%，見圖6。5）洗脫流速的考察。取預處理好的大孔吸附樹脂5份，按優(yōu)化的動態(tài)吸附條件完全吸附，靜置2 h。先用200 mL水洗脫，100 mL 20%乙醇除雜，再用100 mL 70%乙醇進行洗脫，洗脫流速分別為1、2、3、4、5 BV/h，收集醇洗脫液，測定黃芪甲苷的量，計算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明最佳洗脫流速為1 BV/h，見圖7。

圖3 吸附流速對吸附的影響

圖4 上樣樣品pH對吸附的影響

圖5 上樣時間對吸附的影響

圖6 洗脫濃度對解吸的影響

圖7 洗脫流速對解吸的影響

1.2.7 最佳純化工藝驗證 見表3。按照上述最佳工藝條件（上樣流速1 BV/h，上樣pH 5，靜態(tài)吸附8 h，乙醇濃度50%，洗脫速度1 BV/h）進行純化，得到黃芪甲苷，按照含量測定的上述方法測定其得率，平均轉(zhuǎn)移率為76.38%。

表3 黃芪甲苷得率

3 結(jié) 論

黃芪甲苷純化采用AB-8樹脂進行純化，采用單因素實驗，考察了上樣pH值、流速和靜態(tài)吸附時間等5個單因素。考慮實驗的時間和節(jié)約能源，最終選擇上樣流速為1 BV/h，上樣pH為5，靜態(tài)吸附8 h，乙醇濃度為50%，洗脫速度為1 BV/h的純化條件，得到高得率、高含量的黃芪甲苷。

本文利用黃芪甲苷與顯色劑結(jié)合在特定的波長下具有吸收光波的特性，采用紫外分光光度法對其進行檢測。相對于高效液相法，其操作時間短，流程簡便，更適用于大規(guī)模工業(yè)化檢測。

［1］左軍，張文釗，胡曉陽，等.黃芪現(xiàn)代藥理及臨床研究進展［J］.中醫(yī)藥信息，2014，31（1）：111-112.

［2］范穎，喬鐵，滕飛.黃芪功效主治的衍化及其應(yīng)用與發(fā)展［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（8）：1164-1167.

［3］張薔，高文遠，滿淑麗.黃芪中有效成分藥理活性的研究進展［J］.中國中藥雜志，2012，37（21）：3203-3207.

［4］段亞麗，謝梅冬.黃芪化學成分及其有效成分黃芪甲苷含量測定的研究現(xiàn)狀［J］.中國獸藥雜志，2005，39（3）：35-38.

［5］李銳，付鐵軍，及元喬，等.膜莢黃芪與蒙古黃芪化學成分的高效液相色譜-質(zhì)譜研究［J］.分析化學，2005，33（12）：1676-1680.

［6］李歡欣，郝桂明，趙春杰，等.反相高效液相色譜法測定黃芪中黃芪甲苷的含量［J］.中國藥學雜志，2003，38（3）：212-213.

［7］孫豪棟，龐曉斌，李繼揚.黃芪甲苷生物活性研究進展［J］.中國藥房，2011，22（7）：657-661.

［8］楊龍，韓冬.黃芪甲苷對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2016，25（5）：799-803.

［9］Wang WT，Zhao HY，Han YM，et al.Effects of astragalosideⅣ derivative on heart failure in rats［J］.Chinese Herbal Medicine，2012，2（1）： 48-53.

［10］劉天一，何觀虹，姚麗.黃芪甲苷治療心血管疾病研究進展［J］.中醫(yī)藥信息，2013，30（2）：117-120.

［11］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2015：302.

［12］蔡君.紫外分光光度法測定黃芪總皂苷口腔黏附緩釋片中總皂苷的含量［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2012，18（7）：786-790.

［13］李源君，姜成忠，吳寶財.中藥純化過程中大孔樹脂的預處理與再生［J］.黑龍江科技信息，2004，8（11）：200.

［14］賈存勤，李陽春，屠鵬飛，等.D-101型大孔吸附樹脂預處理方法的研究［J］.中草藥，2006，37（2）：193-196.

［15］張華，冉黃橋，楊玲，等.大孔吸附樹脂的不同預處理對貝母多糖純化效果影響［J］.2017，42（7）：195-199.

［16］何珺，何照范，張勇民，等.DA201型大孔吸附樹脂分離銀杏葉提取物中銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯的研究［J］.中草藥，2004，35（12）：1359-1360.

Study on Purification Process of Astragaloside IV in Astragalus Membranaceus Based on Macroporous Resin

CHEN Kai，ZHOU Jing，LI Min，et al. Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

Objective：To select the most suitable macroporous resin for the purification of astragaloside in astragaloside extract from three kinds of macroporous resins，and optimize it by static and dynamic adsorption-desorption process.Methods：Static adsorption and desorption performance of three kinds of macroporous adsorption resins（D101，D201 and AB-8） for astragalosideⅣ from astragaloside extract were investigated to screen the op timal resin.The adsorption flow rate，sample pH value，adsorption time，elution solvent concentration and elution flow rate were tested by single factor experiment to enrich the content of astragalosideⅣ.The dynamic adsorption and desorption condition of resin were optimized，and the purity of astragaloside Ⅳ was evaluated in the end.Results：AB-8 macroporous resin was chosen as the optimal resin.As a result，adsorption pH of 5，adsorption time of 8 h，ethanol elution of 50%，adsorption rate of 1 BV/h and elution speed of 1 BV/h were derived as optimal conditions.Conclusion：The process about adsorption and desorption of astragalosideⅣ mentioned above was the best method.And it can get a higher content of astragalosideⅣ.

Astragalus membranaceus；Astragaloside Ⅳ；Macroporous resin；Purification

R289.5

A

1004-745X（2017）11-1881-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.001

國家自然科學基金項目（81473587）；浙江省自然科學基金項目（LR16H270001）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2017ZB024）；浙江省教育廳科研項目（Y201534584）

△通信作者（電子郵箱：yuli9119@126.com）

2017-06-15）