腎?、裉柗綄蝹?cè)輸尿管梗阻大鼠Wnt通路Wnt4和β-catenin表達的影響*

林文博 程錦國△ 陳建歐 武亞丹 李 曉

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院，浙江 溫州 325000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310005）

腎?、裉柗綄蝹?cè)輸尿管梗阻大鼠Wnt通路Wnt4和β-catenin表達的影響*

林文博1程錦國1△陳建歐1武亞丹1李 曉2

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院，浙江 溫州 325000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310005）

目的研究腎?、裉柗綄nt通路中Wnt4和β-catenin表達的影響及腎病Ⅰ號方抗腎纖維化的機理。方法雄性SPF級SD大鼠108只，隨機分為假手術(shù)組、模型組、西藥組（鹽酸貝那普利）、腎病Ⅰ號方高、中、低劑量組，每組18只。假手術(shù)組僅游離左側(cè)輸尿管，其余5組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，于術(shù)后第2天灌胃。各組分別于灌胃后第7、14、21天隨機選取6只大鼠留取24 h尿液，檢測24 h尿蛋白（24 h UP）；心臟取血，檢測血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）；處死大鼠，取腎臟組織行Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理改變；免疫組化方法觀察Wnt4和β-catenin在腎間質(zhì)的陽性表達情況。結(jié)果模型組和給藥組大鼠血Scr和BUN較假手術(shù)組顯著升高 （P＜0.05），24 h UP無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞0.05），Masson染色示藍色膠原組織增多，Wnt4和β-catenin表達增加（P＜0.05）。西藥組和腎?、裉柗礁摺⒅?、低劑量組大鼠血Scr和BUN較模型組顯著降低 （P＜0.05），24 h UP差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），Masson染色示藍色膠原組織減少，Wnt4和 βcatenin表達降低（P＜0.05）。與西藥組比較，腎?、裉柗礁?、中、低劑量組大鼠各檢測指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論腎?、裉柗娇杀Ｗo腎小管，并可能通過降低腎小管上皮細胞中Wnt4和β-catenin的表達，減少細胞外基質(zhì)堆積，從而達到抗腎纖維化的作用。

腎?、裉柗?單側(cè)輸尿管梗阻 腎纖維化 Wnt4 β-catenin

近年來，慢性腎臟?。–KD）患病率和死亡率不斷升高，嚴(yán)重威脅人類生命和健康。最新研究表明，高收入國家的CKD患病率一直在11%左右［1］，我國CKD患病率為10.8%［2］，并且逐年增高。大多數(shù)CKD最終都發(fā)展為腎臟纖維化［1］，腎纖維化以腎間質(zhì)中炎性細胞浸潤和細胞外基質(zhì)（ECM）積聚為主要特點，伴腎小球硬化、腎小管萎縮和擴張，腎單位進行性破壞等病變。中醫(yī)藥在預(yù)防和治療腎纖維化上具有明顯優(yōu)勢。腎?、裉柗綖闇刂菔兄嗅t(yī)院自擬方，具有疏利三焦，祛三焦邪濁之功效。臨床實踐證明，腎?、裉柗娇鼓I纖維化體現(xiàn)較好的療效［3］。本研究以單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）大鼠為研究對象，探究腎?、裉柗綄UO模型大鼠腎纖維化的改善作用，觀察其對Wnt通路中Wnt4和β-catenin表達的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 108只清潔級雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 藥物與試劑 腎病Ⅰ號方（柴胡、黃芩、半夏、白芍、土茯苓、半枝蓮、菝葜、漏蘆等）經(jīng)常規(guī)煎煮、過濾、水浴蒸發(fā)等步驟，濃縮至生藥含量分別為0.75、1.5、3 g/mL規(guī)格，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠炮制中心提供；鹽酸貝那普利片（產(chǎn)品批號：X2342，北京諾華制藥有限公司）；抗 Wnt4 抗體（abcam）；抗 β-catenin 抗體（Cell Signaling Technology）；Masson 染色試劑盒（北京索萊寶生物科技公司）；DAB顯色試劑盒、超敏二步法免疫組化檢測試劑盒 （北京中杉金橋公司）。BX51光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；微量加樣槍，德國Eppendorf公司；Coulter AU5800全自動生化分析儀，美國Beckman公司。

1.3 分組與造模 實驗大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為假手術(shù)組18例和造模組90例。實驗采取單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)建立實驗動物模型［4］：稱體質(zhì)量，10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，取右側(cè)臥位，手術(shù)區(qū)備皮。從背部脊柱距離左側(cè)肋脊角1.5 cm處做切口，開腹暴露左側(cè)腎臟，游離輸尿管，于約腎盂處和輸尿管上1/3處雙重結(jié)扎，回納腎臟并逐層縫合。造模組隨機分為模型組，西藥組，腎病Ⅰ號方高、中、低劑量組，每組9只。

1.4 給藥方法 造模后第2日開始灌胃，假手術(shù)組、模型組給予10 mL/kg 0.9%氯化鈉注射液。腎?、裉柗浇o藥體積為10 mL/kg。腎病I號方高、中、低劑量分別按照體質(zhì)量為60 kg的成人每日生藥劑量的20、10、5倍（灌胃生藥劑量分別為3、1.5、0.75 g/mL的濃縮液）計算。西藥組給予鹽酸貝那普利 0.8 mg/kg（0.08 mg/mL）［5］。每日早晚灌胃各1次。

1.5 標(biāo)本采集 每組大鼠分別于灌胃第7、14、21日后隨機選取6只處死。處死前放入代謝籠中收集24 h尿液，記錄尿量，離心沉淀后取上清液檢測24 h尿蛋白。采用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，采血針心臟取血3 mL，離心后取血清保存于-20℃冰箱。摘取大鼠梗阻腎，去包膜，分切腎組織，一部分于4%多聚甲醛溶液中固定，其余腎臟組織置于液氮速凍保存。

1.6 標(biāo)本檢測 1）血尿生化指標(biāo)。將收集的24 h尿液采用免疫比濁法測24 h尿蛋白。心臟取血收集的血液送檢至溫州市中醫(yī)院檢驗科，檢測血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）。2）腎臟病理學(xué)檢測方法。腎組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成3 μm石蠟切片，按常規(guī)方法行Masson染色，光鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變。3）免疫組化檢測方法。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，雙氧水室溫靜置10 min后高壓熱修復(fù)，滴加山羊血清封閉液（室溫封閉20 min），滴加一抗，抗 Wnt4（1∶400）、β-catenin（1∶200），4℃過夜。根據(jù)超敏二步法免疫組化檢測系統(tǒng)滴加二抗，室溫靜置15 min。DAB顯色水洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。400倍光鏡下觀察，每張切片隨機選取5個非重疊視野，拍照；采用Image Pro Plus 6.0軟件對采集圖像進行平均累積光密度值（IOD值）分析，以反映Wnt4和β-catenin表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法（LSD），方差不齊時采用Dunnett T3檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血、尿生化檢測結(jié)果比較 見表1，表2。模型組和各處理組大鼠血清Scr和BUN濃度明顯高于假手術(shù)組 （P<0.05）。西藥組和中藥組大鼠血清Scr和BUN濃度顯著低于模型組（P<0.05）。腎?、裉柗礁?、中、低劑量組之間比較，血清Scr和BUN差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。24 h尿蛋白各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清Scr和BUN水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清Scr和BUN水平比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）組 別7 d 14 d 21 d 7 d 14 d 21 d假手術(shù)組 17.67±2.08 19.67±2.52 19.33±3.21 5.38±0.61 5.08±0.49 5.78±0.42模型組 38.00±3.61*西藥組 27.00±5.66*△40.00±1.41*42.67±6.43*29.00±3.61*△ 30.33±4.04*△8.42±0.74*6.61±0.68*△10.89±0.53* 11.73±0.62*7.07±0.24*△ 9.00±0.37*△中藥高劑量組 28.33±4.73*△ 29.00±6.93*△ 30.67±2.08*△ 7.38±0.46*△ 8.54±1.25*△ 9.42±0.75*△中藥中劑量組 27.33±4.16*△ 28.33±1.53*△ 31.33±2.08*△ 7.34±0.29*△ 8.79±1.12*△ 9.51±0.34*△中藥低劑量組 28.67±2.08*△ 29.67±2.08*△ 32.33±1.53*△ 6.61±0.31*△ 8.05±1.23*△ 9.85±0.26*△

表2 各組大鼠24 h尿蛋白水平比較（mg/L，±s）

表2 各組大鼠24 h尿蛋白水平比較（mg/L，±s）

組 別 7 d 14 d 21 d假手術(shù)組 277.6±136.57 493.67±55.37 624.67±78.65模型組 581.3±131.80 638.50±139.30 881.33±131.80西藥組 326.00±69.30 541.33±335.40 607.67±131.61中藥高劑量組 448.6±215.23 277.33±260.77 478.67±209.48中藥中劑量組 460.0±238.43 338.00±178.55 457.33±223.72中藥低劑量組 338.6±235.77 489.00±346.00 526.33±368.80

2.2 各組大鼠腎臟組織病理變化 見圖1。Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腎組織僅有微量藍染膠原組織；織藍色膠原纖維減少，說明腎纖維化程度減少。而造模組腎組織可見大量藍染膠原組織，且梗阻時間越長，藍染組織越多，提示腎纖維化進行性加重。與假手術(shù)組比較，西藥組和腎?、裉柗浇M腎臟藍染膠原組織增加；而與模型組比較，西藥組和腎?、裉柗浇M腎組

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變（Masson染色，400倍）

2.3 各組腎臟組織Wnt4陽性表達水平比較 見圖2，表3。假手術(shù)組，Wnt4在腎組織內(nèi)不表達或有微量表達。與假手術(shù)組比較，各造模組在腎小管上皮細胞胞質(zhì)和腎小球內(nèi)Wnt4陽性表達量顯著升高（P<0.05），且梗阻3周內(nèi)，梗阻時間與陽性表達量呈正相關(guān)。與模型組相比，腎?、裉柗礁鹘M和西藥組Wnt4表達量均有降低（P<0.05）。

表3 各組大鼠腎臟組織Wnt4和β-catenin蛋白在不同時間表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠腎臟組織Wnt4和β-catenin蛋白在不同時間表達水平比較（±s）

與中藥低劑量組比較，＃P＜0.05。

Wnt4 β-catenin組 別7 d 14 d 21 d 7 d 14 d 21 d假手術(shù)組 18.99±2.60 25.01±3.49 31.97±5.71 11.66±2.73 20.32±8.57 28.79±9.21模型組 117.37±5.60*西藥組 36.07±4.98*△＃152.35±21.43*227.94±18.53*59.30±9.03*△ 89.90±19.53*△107.71±16.17*31.97±3.48*△＃136.85±12.36*181.70±9.51*52.42±9.73*△ 74.90±6.64*△中藥高劑量組 40.94±7.98*△＃ 67.20±5.53*△ 95.68±16.52*△ 32.23±9.10*△ 47.19±13.37*△ 77.48±6.71*△中藥中劑量組 47.19±4.96*△ 73.58±12.39*△ 90.35±13.18*△ 32.81±9.91*△ 53.43±9.20*△ 76.49±10.06*△中藥低劑量組 52.83±9.39*△ 76.08±11.30*△ 112.71±12.03*△ 39.07±6.78*△ 60.33±7.45*△ 85.34±10.10*△

2.4 各組腎臟組織β-catenin陽性表達變化比較 見圖3，表3。假手術(shù)組腎組織中可見β-catenin的微量表達。與假手術(shù)組比較，各造模組在腎小管上皮細胞胞質(zhì)和細胞核內(nèi)β-catenin表達量明顯升高（P<0.05），且梗阻時間越長，β-catenin表達量越多。與模型組相比，腎?、裉柗礁鹘M和西藥組β-catenin表達量均有降低（P<0.05）。

3 討 論

腎纖維化是CKD進展至終末期腎臟病的主要病理特征和共同通路。其由多種細胞因子介導(dǎo)、多種信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致ECM在腎間質(zhì)大量堆積、腎臟組織結(jié)構(gòu)破壞及功能喪失的病理過程［6］。近年來研究證實，Wnt信號通路在纖維化疾病過程中發(fā)揮著重要作用［7-8］。Wnt/β-catenin通路是Wnt信號通路中的經(jīng)典通路。該通路由分泌蛋白Wnt家族、胞膜受體卷曲蛋白（FZD）家族、胞漿內(nèi)β-catenin（連環(huán)鏈蛋白）等多種蛋白分子和細胞核內(nèi)T細胞因子（TCF）/淋巴樣增強因子（LEF）轉(zhuǎn)錄因子家族等組成［7］。

圖2 Wnt4免疫組化結(jié)果（400倍）

圖3 β-catenin免疫組化結(jié)果（400倍）

目前，在多種動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了包括Wnt4在內(nèi)的19種 Wnt蛋白［9］。Wnt信號通路激活使得 Wnt蛋白異常表達［10］。 Nguyen 等［11］首次在 UUO 大鼠模型中發(fā)現(xiàn)Wnt4的表達，并且Wnt4與腎纖維化程度呈正相關(guān)。同樣在UUO模型中，Surendran等［12］發(fā)現(xiàn)在腎臟組織集合管中有Wnt4的陽性表達，并且隨著纖維化的出現(xiàn)，間質(zhì)成纖維細胞中Wnt4呈現(xiàn)高水平陽性表達，梗阻期間可持續(xù)升高4周。由此可以推斷，腎纖維化的發(fā)生和進行性發(fā)展可能與Wnt4異常表達有關(guān)。在Wnt途經(jīng)中，β-catenin-TCF/LEF復(fù)合體是Wnt途經(jīng)的樞紐。Wnt信號激活后，Dishevelled蛋白通過抑制糖原合成激酶3β（GSK-3β）等蛋白形成的β-catenin降解復(fù)合物的降解活性，使細胞質(zhì)中游離的β-catenin蛋白增多。胞漿中積累的β-catenin進入細胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［13-15］，激活纖維化相關(guān)基因的表達，促進腎纖維化的發(fā)生。

腎纖維化可歸屬于中醫(yī)學(xué)“水腫”“腰痛”“溺毒”等范疇，其病因錯綜復(fù)雜，但根本病機為本虛標(biāo)實，虛實夾雜。《難經(jīng)》云“三焦者，水谷之道路”并“主持諸氣”；《內(nèi)經(jīng)》云，三焦可通調(diào)水道，為人體決瀆之官。脾腎虛損和濕熱、瘀血、濁毒等阻礙三焦通行諸氣、運化水液，使三焦樞機不利；反過來，三焦樞機不利又會損耗人體正氣，加重濕熱、瘀血等病邪，故以疏利三焦，祛三焦邪濁立腎?、裉柗剑?6］。腎?、裉柗綖闇刂菔兄嗅t(yī)院自擬方，以小柴胡湯主藥柴胡、半夏、黃芩為君，主入三焦，疏利三焦，調(diào)暢三焦氣血水液，配以土茯苓、半枝蓮清熱除濕解毒，菝葜解毒散瘀，白芍扶正補虛，共奏暢三焦樞機、祛三焦邪濁、扶正補虛之功。課題組前期研究表明，腎病Ⅰ號方可下調(diào)IL-6 mRNA表達，抑制腎小球系膜細胞增殖，進而減少ECM（主要是FN）的產(chǎn)生，從而達到抗腎纖維化的作用［3］。

本研究結(jié)果表明，腎?、裉柗娇山档湍I纖維化大鼠Scr和BUN，降低腎小管上皮細胞中Wnt4和βcatenin的表達，一定程度上改善大鼠腎臟組織的病理表現(xiàn)，保護腎小管，減少ECM堆積，從而達到抗腎纖維化的作用。但腎纖維化的信號通路較多，發(fā)生發(fā)展的機制復(fù)雜，腎?、裉柗綄ζ渌盘柾芳皺C制的影響需要進一步探索。

［1］Webster AC，Nagler EV，Morton RL，et al.Chron ic kidney disease［J］.Lancet，2017，389（10075）：1238-1252.

［2］Zhang L X，Wang F，Wang L，et al.Prevalence of chronic kidney disease in China：a cross-sectional survey［J］.Lancet，2012，379（9818）：815-822.

［3］胡振奮，程錦國，董飛俠，等.腎?、裉柗綄Υ笫笙的ぜ毎鲋臣癐L-6和FN表達的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2010，11（1）：21-24.

［4］Yuan XP，Liu LS，F(xiàn)u Q，et al.Effects of ligustrazine on ureteral obstruction-induced renal tubulointerstitial fibrosis［J］.Phytother Res，2012，26（5）：697-703.

［5］羅婷，程錦國，簡怡娟，等.清化固腎排毒方對UUO大鼠上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2015，49（11）：71-78.

［6］李明亮，杜潔，戴英波.腎纖維化信號通路的研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（18）：3275-3278.

［7］羅婷，董飛俠.Wnt信號通路在腎纖維化中作用的研究進展［J］.國際泌尿系統(tǒng)雜志，2015，35（2）：301-305.

［8］He W，Dai C，Li Y，et al.Wnt/beta-catenin signaling promotes renal interstitial fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2009，20（4）：765-776.

［9］Chien AJ，Conrad WH，Moon R.A Wnt survival guide： from fliesto human disease ［J］.J Invest Dermatol，2009，129（7）：1614-1627.

［10］Polakis P.Wnt signaling and cancer［J］.Genes Dev，2000，14（15）：1837-1851.

［11］Nguyen HT，Thomson AA，Kogan BA，et al.Expression of the Wnt gene family during late nephrogenesis and complete ureteral obstruction［J］.Lab Invest，1999，79（6）：647-658.

［12］Surendran K，McCaul SP，Simon TC.A role for Wnt4 in renal fibrosis［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2002，282（3）：431-441.

［13］Hung H，He X.Wnt/beta-catenin signaling：new （and old）players and new insights ［J］.Curr Opin Cell Biol，2008，20：119-125.

［14］Hertig A，Vefine J，Mougenot B，et al.factors for early epithelial to mesenchymal transition in renal grafts［J］.Am J Transplant，2006，6（12）：2937-2946.

［15］He W，Tan R，Dai C，et al.Plasminogen activator inhibitor-1 is a transcriptional target of the canonical pathway of Wnt/beta-catenin signaling［J］.J Biol Chem，2010，285（32）：24665-24675.

［16］王亞輝.腎?、裉柗娇傇碥諏蝹?cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎纖維化的影響［D］.杭州：浙江中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

Effect of Nephropathy 1st Decoction on Expression of Wnt4 and β-catenin in Wnt Signaling Pathway of Unilateral Ureteral Obstruction Rats

LIN Wenbo，CHENG Jinguo，CHEN Jianou，et al. Affiliated Wenzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Zhejiang，Wenzhou 325000，China.

Objective：To study the effect of Nephropathy 1st Decoction on the expression of Wnt4 and βcatenin in Wnt pathway and the mechanism.Methods：The male Sprague-Dawley （SD） rats （108 cases） were randomly divided into the sham-operated group，the model group，benazepril hydrochloride group，high-，med-，low-dose Nephropathy 1st Decoction groups （HN，MN，and LN groups），18 in each group.In the sham operation group，only the left ureter was free；the remaining 5 groups underwent left ureteral ligation，and the gastric lavage was performed on the second day after operation.On days 7，14，21，6 rats in each group were randomly sacrificed.24 h urine protein（24 h UP），serum blood urea nitrogen（BUN） and serum creatitine（Scr） were tested.Also their left surgery renal tissues were collected for pathological examination.The pathological changes of the obstruction renal tissue were examined by Masson staining.The protein expression of Wnt4 and β-catenin was detected by immunohistochemical staining.Results：Compared with the sham-operated group，serum levels of BUN and Scr in other groups were increased（P＜0.05）；there was no significant difference in 24 h UP（P>0.05）.Masson staining showed that the number of blue collagen increased，and protein expression level of Wnt4 and βcatenin increased（P＜0.05）.Compared with the model group，after the treatment，serum levels of SCr and BUN in rats decreased significantly in other groups （P＜0.05）；there was no significant difference in 24 h UP （P>0.05）.Masson staining showed that blue collagen was decreased，and the expression of Wnt4 and β-catenin was decreased（P＜0.05）.Compared with benazepril hydrochloride group，there were no significant differences in the in-dexes of high，medium and low dose groups of Nephropathy 1st Decoction （P>0.05）.Conclusion：Nephropathy 1st Decoction may protect renal tubules，and may reduce the accumulation of extracellular matrix by reducing the expression of Wnt4 and β-catenin in renal tubular epithelial cells，so as to achieve the role of anti-renal fibrosis.

Nephropathy 1st Decoction；Unilateral ureteral obstruction；Renal interstitial fibrosis；Wnt4；β -catenin

R285.5

A

1004-745X（2017）11-1938-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.016

浙江省藥學(xué)重中之重一級學(xué)科開放基金（YKFJ005）；2015年溫州市中醫(yī)藥建設(shè)資助項目

△通信作者（電子郵箱：wsjcjg@126.com）

2017-05-23）