益氣降濁顆粒對冠心?。ㄌ禎嵫鲂停┘彝醚iR-21及TGFβRⅡ表達的影響*

王瑩威 劉 蕾 張 瑤 魏明慧

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱 150036；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

益氣降濁顆粒對冠心?。ㄌ禎嵫鲂停┘彝醚iR-21及TGFβRⅡ表達的影響*

王瑩威1△劉 蕾2張 瑤2魏明慧3

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱 150036；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

目的觀察益氣降濁顆粒對冠心?。ㄌ禎嵫鲂停┘彝醚軆?nèi)microRNA-21（miR-21）和TGFβRⅡmRNA表達水平的影響。方法本實驗采用冠心?。ㄌ禎嵫鲂停┘彝媚Ｐ妥鳛檠芯繉ο?，運用熒光定量PCR技術觀察miR-21和TGFβRⅡ mRNA在家兔主動脈的表達情況。結果實驗中空白組、中藥組、模型組中TGFβRⅡ的表達與miR-21具有相關性（r=-0.564，P＜0.05），而中藥干預下的動脈硬化模型家兔TGFβRⅡ的表達水平較模型組顯著降低，同時可使血脂TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高（P<0.05）。結論益氣降濁顆?？梢燥@著降低血管中miR-21和TGFβRⅡ的表達，益氣降濁顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)miR-21和TGFβRⅡ的表達發(fā)揮其穩(wěn)定斑塊的作用。

冠心病 益氣降濁顆粒 miR-21 TGFβRⅡ

冠心?。–HD）是心血管疾病中極為常見一類炎性病變，冠狀動脈的粥樣硬化是其特征之一，嚴重威脅到人類的生命、健康、以及生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA（miRNAs）是一類非編碼的單鏈RNA，其中miR-21與心血管疾病關系密切，而TGFβRⅡ同時作為其靶基因，深受學者廣泛關注。多項研究證實，miR-21和TGFβRⅡ的表達與炎癥反應［1］及心血管疾?。?-3］方面存在一定的相關性，而炎癥與動脈斑塊的穩(wěn)定與否密切相關。近代研究中藥干預下對冠心病的治療取得一定的療效，前期的臨床研究中，益氣降濁湯在臨床上對于冠心病的治療已取得成效［4］。本實驗通過高脂飼料飲食喂養(yǎng)，構建冠心病痰濁血瘀型家兔，觀察血管中血脂、miR-21及TFGβRⅡ的變化情況，意在探究益氣降濁顆粒對冠心?。ㄌ禎嵫鲂停┘彝醚苤衜iR-21及TFGβRⅡ的影響，通過抑制miR-21及TFGβRⅡ的表達，明確中藥制劑對冠心病的療效，進一步探索益氣降濁顆粒是否有穩(wěn)定斑塊的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 常規(guī)喂養(yǎng)2周的4～5月齡健康新西蘭大白兔30只，雄性，清潔級，體質(zhì)量3.0～3.8 kg，平均（3.27±1.35）kg，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。 動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（2015）-0026。

1.2 試藥儀器 益氣降濁顆粒由黃芪、苦參、當歸、莪術、川芎藥物組成，由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院制劑室制備。miR-21和TGFβRⅡ的引物，來自上海生物工程有限公司；兔免疫組化試劑盒，（批號030403），來自北京博奧森公司；膽固醇（TC）、甘油三酯（TG），低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C） 測定試劑盒 （批號分別為111221，114751，110421，113753），由中北北控生物科技股份有限公司提供。

1.3 分組與給藥 將30只兔分為兩組，一組10只喂養(yǎng)普通飼料為空白組作對照；另一組20只持續(xù)喂養(yǎng)8周高脂飼料 （配方：膽固醇1%，蛋黃粉15%，豬油15%，基礎飼料79%），構建冠心病痰濁血瘀模型。造模過程中，1只兔死于感染。造模成功后，將19只兔隨機分為模型組9只、中藥組10只。中藥組以益氣降濁顆粒溶于150 mL生理鹽水灌胃2周，同時模型組以等容積的生理鹽水灌胃，實驗結束后氣體栓塞法處死動物。給藥過程中，1只兔（中藥組）意外猝死。

1.4 標本采集與檢測 血漿中血脂指標（TC，TG，LDLC，HDL-C），從實驗開始進行檢測，第8周再測一次，發(fā)現(xiàn)模型組相關血脂水平平均達到正常組的6～10倍，預測造模成功，實驗第10周，對3組兔頸動脈插管進行取血，觀察血脂、miR-21及TGFβRⅡ的表達。取血成功后，繼續(xù)抽血待兔血液抽盡，剖腹，取出定位并分離主動脈弓，取主動脈弓3、4、5段行miR-21及TGFβRⅡ的熒光定量PCR檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用成組 t檢驗，PCR 數(shù)據(jù)以Pearson法進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 空白組與模型組第8周血脂水平比較 見表1。與空白組比較，模型組TC、TG、LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平明顯降低 （P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義，提示造模成功。

表1 空白組與模型組第8周血脂水平比較（mEq/L，±s）

表1 空白組與模型組第8周血脂水平比較（mEq/L，±s）

與空白組比較，△P<0.05。

組別 n TC TG HDL-C LDL-C空白組 10 2.57±2.15 0.67±0.41 1.75±0.49 1.62±1.21模型組 19 30.17±6.31△ 1.73±1.15△ 0.71±0.61△ 18.65±5.08△

2.2 各組治療2周后血脂變化及miR-21、TGFβRⅡ表達水平比較 見表2。與空白組比較，模型組TC、TG、LDL-C的指標明顯升高，HDL-C明顯降低 （P＜0.05）；與模型組比較，中藥組 TC、TG、LDL-C 水平明顯降低，HDL-C 水平明顯升高（P＜0.05）。

表2 各組治療2周后血脂變化及miR-21、TGFβRⅡ表達水平比較（±s）

與空白組比較，△P＜0.05；與中藥組比較，▲P＜0.05。

組 別 n TC（mEq/L） TG（mEq/L） HDL-C（mEq/L）LDL-C（mEq/L）miR-21 TGFβRⅡ空白組 10中藥組 9 2.79±1.96 0.87±0.62 1.93±0.54 22.16±5.24 1.47±1.26 1.08±0.69 1.49±1.37 15.36±5.74 20.15±10.52 0.08±0.05 51.21±15.48 0.13±0.04模型組 9 32.59±8.58 1.93±1.31 0.57±0.59 27.28±8.45 80.42±32.21 0.20±0.08

2.3 各組miR-21及TGFβRⅡ的表達水平比較 見表2。與空白組比較，模型組miR-21、TGFβRⅡ的表達水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組miR-21、TGFβRⅡ的表達水平明顯降低（P＜0.05）。 miR-21和TGFβRⅡ的相關性研究：行Pearson相關分析，統(tǒng)計結果為r=-0.564，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。

3 討 論

冠心病在中醫(yī)范疇屬“胸痹”，屬于本虛標實之證，主要病機為心脈瘀阻，其痰濁血瘀證型逐漸占領冠心病致病因素的主導，成為臨床重要證型之一［5-6］。近年越來越多的中藥制劑對動脈粥樣硬化的療效顯著［7-9］。筆者曾運用益氣降濁湯改善冠心病的心肌缺血癥狀［10］，尤其是痰瘀互結的胸痹心痛取得較好療效。益氣降濁顆粒由益氣降濁湯變換劑型而來。此顆粒制作簡單，易于服用，價格低廉。益氣降濁顆粒由黃芪、苦參、當歸、莪術、川芎組成，其中黃芪補脾益氣為君，氣行則營衛(wèi)和，莪術破血行氣，苦參清利痰濕，川芎辛散溫通，燥濕行氣，與苦參相合，活血祛瘀止痛共為臣藥，再佐以當歸養(yǎng)血活血，亦有防莪術破血伐氣之力太過之功效。諸藥配伍，使痰飲化，瘀血散，脈道暢，胸陽展，從而能夠明顯改善冠心病 （痰濁血瘀型）所引起的心臟不適癥狀?，F(xiàn)代藥理研究顯示，黃芪具有抗氧化作用，抑制炎癥反應［11］；苦參能夠明顯改善高脂血癥的水平［12］；川芎具有抑制炎癥反應，改善脂質(zhì)代謝，穩(wěn)定斑塊等作用［13］；莪術具有抗炎抗氧化、抗動脈硬化的作用［14］。

多項研究顯示，冠心病的發(fā)病機制為動脈粥樣硬化，動脈粥樣硬化與 miR-21、TGFβRⅡ息息相關［15-16］，miR-21具有調(diào)控基因的表達，改善動脈的粥樣硬化，而miR-21和TGFβRⅡ同時參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化、增殖、凋亡等變化過程，與心血管疾病的演變密切相關［17］，在炎癥和免疫反應調(diào)節(jié)等方面也被認為發(fā)揮了重要作用［18］，同時冠心病又是一種炎癥病變，在其演變過程中，miR-21和TGFβRⅡ分子水平出現(xiàn)了異常的升高。相關資料顯示，通過抑制miR-21和TGFβRⅡ的表達，可糾正炎性病變，調(diào)控心肌細胞，從而改善冠心病冠脈的病變程度［19］。經(jīng)調(diào)查得知，miRNA與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關，但在中醫(yī)證候類型上卻少有研究［20］。本實驗從冠心病（痰濁血瘀型）家兔模型著手，建立其近似于臨床冠心病的病理學改變。研究表明，miR-21和TGFβRⅡ參與了動脈粥樣硬化的過程，在炎性細胞、心肌細胞中存在不同程度的表達。本實驗數(shù)據(jù)顯示，中藥組與模型組比較，miR-21和TGFβRⅡ表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），從而證明益氣降濁顆粒能顯著降低兔血漿中miR-21、TGFβRⅡ的水平。

因此，益氣降濁顆粒對于冠心病家兔血管中miR-21和TGFβRⅡ表達有顯著的降低作用，尤其是對痰濁血瘀型冠狀動脈病變有明顯的療效。同時益氣降濁顆粒能夠改善冠心病斑塊中的脂質(zhì)水平，調(diào)控炎癥反應過程，進而對穩(wěn)定斑塊有一定的作用。然而當代對血管中miR-21和TGFβRⅡ的表達抑制，采用中醫(yī)藥治療方案卻少有報道，這很有可能成為未來臨床治療冠心病的又一研究方向。

［1］SCHROEN B，HEYMANS S.Small but smart-mi-crornas in the centre of inflammatory processes during cardiovascular diseases， the metabolic syndrome，and ageing［J］.Cardiovasc Rcs，2012，93：605-613.

［2］SCHOBFR A，THUM T，ZERNECKE A.Micror-nas in vascular biology-metabolism and atherosclero-sis［J］.Thromb Hacmost，2012，107：603-604.

［3］劉詠梅，虞桂，王階.microRNA與心血管疾病［J］.中國分子心臟病學雜志，2011，11（6）：380-384.

［4］王瑩威，張瑤，魏明慧，等.益氣降濁湯對冠心病不穩(wěn)定型心絞痛患者MMP-3與TIMP-1的影響［J］.云南中醫(yī)中藥雜志，2015，36（10）：19-21.

［5］李崢，楊關林.蔞香丹通心顆粒對冠心病穩(wěn)定型心絞痛痰濁血瘀證患者生活質(zhì)量的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2016，（2）：437-440.

［6］劉建勛，林成仁，任建勛，等.痰瘀同治方對痰瘀互結證冠心病小型豬心肌組織的保護作用［J］.中國中藥雜志，2014，（4）：726-731.

［7］張璐，孫晴，郭書文，等.調(diào)脂通脈中藥對動脈粥樣硬化兔模型炎癥因子表達的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，2014，（3）：171-174，189，3.

［8］高瑩，楊積武.栝蔞薤白半夏湯合丹參飲對痰濁血瘀型冠心病患者血脂及血小板功能的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011，（2）：307-308.

［9］都基莎，何小麗，顧寧.益氣活血方寧心痛顆粒治療冠心病心絞痛的研究思路初探［J］.時珍國醫(yī)國藥，2013，24（1）：180-181.

［10］王瑩威，楊光，林林，等.益氣降濁湯對于冠心病不穩(wěn)定型心絞痛患者MMP-1、MMP-2的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2014，41（2）：230-231.

［11］孫萍.甘溫與苦寒藥對冠心病炎癥反應干預作用的臨床研究［D］.濟南：山東大學，2009.

［12］王登科，田興倉，王小萍.苦參堿對高脂血癥大鼠血脂代謝和抗氧化能力的影響［J］.青海醫(yī)學院學報，2008，29（4）：260-262.

［13］文川，徐浩，黃啟福，等.活血中藥對ApoE基因缺陷小鼠血脂及動脈粥樣硬化斑塊炎癥反應的影響［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2005，25（4）：345-349.

［14］覃歡.醋溫莪術的化學成分及抗氧化活性研究［D］.長春：長春中醫(yī)藥大學，2010.

［15］黃楦檳，陳金水，吳天敏，等.蘇子油對兔勁動脈粥樣硬化模型的微小RNA21和基質(zhì)金屬蛋白酶9基因表達的影響［J］.中國臨床藥理學雜志，2016，32（15）：1414-1417.

［16］羅程，吉慶偉，劉伶，等.冠心病患者血漿白細胞介素-35、白細胞介素-10及轉化生長因子-β_1水平的變化和意義［J］.臨床心血管病雜志，2012，28（12）：919-921.

［17］阮志敏，武力勇，朱國富，等.microRNA-21與冠心病的相關性研究［J］.臨床心血管病雜志，2015，31（1）：50-53.

［18］汪南平，郝廣華.微小RNA及其心血管病理生理學作用［J］.西安交通大學學報：醫(yī)學版，2010，74（4）：391-397

［19］劉媛圓，楊新春，蔡軍.microRNA在心血管系統(tǒng)中的表達和功能［J］.國際心血管病雜志，2010，37（2）：101-104.

［20］王階，虞桂.microRNA與冠心病中醫(yī)證候研究［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2012，31（11）：1562-1565.

Effect of Yiqi Jiangzhuo Granule on Expression of miR-21 and TGFβRⅡ in Coronary Heart Disease Rabbits with Phlegm and Blood Stasis Type

WANG Yingwei，LIU Lei，ZHANG Yao，et al. The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150040，China.

Objective：To investigate the effect of Yiqi Jiangzhuo Granule on the expression of microRNA-21（miR-21） and TGFβRⅡ mRNA in coronary heart disease rabbits with phlegm and blood stasis type.Methods：The rabbit model of coronary heart disease with phlegm and blood stasis was selected as the study objects.The expression of miR-21 and TGFβRⅡ mRNA in the blood vessels was observed by fluorescence quantitative PCR.Results：The expression of TGFβRⅡ was significantly correlated with miR-21 in the blank group，Chinese medicine group and the model group （r=-0.564P＜0.05），and the expression of TGFβRⅡ in the atherosclerosis model group reduced more significantly than that in the model group.The levels of TC，TG and LDL-C were decreased and HDL-C was increased （P<0.05）.Conclusion：Yiqi Jiangzhuo Granule can significantly reduce the expression of miR-21 and TGFβRⅡ in the blood vessel，and Yiqi Jiangzhuo Granule may play its role as a stable plaque by regulating the expression of miR-21 and TGFβRⅡ.

CHD；Yiqi Jiangzhuo Granule；miR-21；TGFβRⅡ

R285.5

A

1004-745X（2017）11-1919-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.11.011

黑龍江省自然科學基金（H201460）；黑龍江中醫(yī)藥大學研究生創(chuàng)新科研項目

△通信作者（電子郵箱：13836113901@163.com）

2017-08-09）