HPLC法同時(shí)測(cè)定水梔子中梔子苷和西紅花苷-I的含量

趙江平 牛 忻,2 楊 群 李淑娟 韋鳳爽 郝麗莉 劉江云*

1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院中藥科，山東 菏澤 274000

HPLC法同時(shí)測(cè)定水梔子中梔子苷和西紅花苷-I的含量

趙江平1牛 忻1,2楊 群1李淑娟1韋鳳爽1郝麗莉1劉江云1*

1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院中藥科，山東 菏澤 274000

目的：建立水梔子中兩種主要組分的雙波長(zhǎng)同時(shí)含量測(cè)定方法。方法：采用Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ 色譜柱(250mm × 4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇- 0.1% 乙酸溶液梯度洗脫；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)238nm(1)和440nm(2)，測(cè)定水梔子中梔子苷(1)、西紅花苷-I(2)的含量。結(jié)果：兩種組分色譜分離良好，梔子苷、西紅花苷-I的線性范圍分別為50.16～501.6μg/mL(r=0.9999)、10.13～101.3μg/mL(r=0.9997)，加樣回收率分別為97.77%、97.39%。結(jié)論：該測(cè)定方法快速、準(zhǔn)確，可為水梔子的質(zhì)量分析方法提供參考。

水梔子；HPLC；梔子苷；西紅花苷-I

梔子為茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實(shí)，廣泛分布于長(zhǎng)江以南的江西、廣西、云南、浙江、福建、臺(tái)灣等地。梔子是我國(guó)藥食兩用的傳統(tǒng)中藥，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒等功效[1]，現(xiàn)已用于清開靈注射液、牛黃上清丸、龍膽瀉肝丸、清火梔麥片等多種中成藥。研究表明，梔子主要含有環(huán)烯醚萜、西紅花苷、綠原酸酯、果膠、油脂等類成分[2]。梔子苷是梔子清熱解毒的主要有效組分之一，其可通過和某些氨基酸結(jié)合轉(zhuǎn)化為食用色素梔子藍(lán)和梔子紅。梔子中的西紅花苷類成分(梔子黃)與西紅花中的藏紅花素組分的結(jié)構(gòu)和主成分組成均類同，具有抗氧化損傷、治療或預(yù)防心腦血管疾病及癌癥等藥理作用，受到國(guó)際關(guān)注。除藥用外，梔子黃、梔子藍(lán)均為我國(guó)習(xí)用的天然食品添加劑[3]，并已應(yīng)用到日本、美國(guó)等國(guó)際市場(chǎng)。

目前市售的商品梔子有梔子(又稱山梔子；黃梔子)與水梔子之分，其中水梔子為梔子的變型大花梔子(Gardeniajasminoidesvar.radicans)或長(zhǎng)果桅子(Gardeniajasminoidesf.longicarpa)，該品種樹形高大，結(jié)果率高，果實(shí)長(zhǎng)而大，因而栽培較廣泛。傳統(tǒng)習(xí)慣認(rèn)為入藥用山梔子，入染料用水梔子[4]。隨著水梔子栽培面積的擴(kuò)大和應(yīng)用，其與梔子相比較的化學(xué)成分[5-7]、藥理作用[8]研究受到關(guān)注，但二者之間成分異同、功效是否相似尚不明確[9]。課題組在前期梔子應(yīng)用基礎(chǔ)研究過程中[10-11]，進(jìn)一步調(diào)研發(fā)現(xiàn)梔子黃在工業(yè)生產(chǎn)中常選用水梔子。鑒于水梔子與梔子的成分定量分析報(bào)道少見，筆者參考相關(guān)研究，以梔子苷、西紅花苷-I為指標(biāo)成分，采用HPLC雙波長(zhǎng)法測(cè)定其含量，并與梔子進(jìn)行對(duì)比分析，為水梔子的質(zhì)量分析和后續(xù)深入開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)(包括1260 Infinity VL 型四元泵，1260 DAD VL 檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司)；ODS色譜柱(5C18- PAQ，4.6×250 mm，日本Cosmosil公司)；MP2002電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；ME215S電子天平(德國(guó)Starorious公司)；SB-5200DTDN超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 材料 水梔子鮮果(GR161001，4℃冰箱冷藏，產(chǎn)地四川大竹縣)由四川廣田嘉禾農(nóng)業(yè)開發(fā)公司提供；梔子(GJ160603，產(chǎn)地江西)購(gòu)自蘇州市天靈中藥飲片有限公司，經(jīng)蘇州大學(xué)藥學(xué)院陸葉博士鑒定依次為茜草科水梔子Gardeniajasminoidesvar.radicans(Thunb.) Makino、梔子GardeniajasminoidesEllis的果實(shí)。水梔子干品，采用水梔子鮮果在80℃烘箱干燥24h獲得。西紅花苷-I對(duì)照品為本實(shí)驗(yàn)室自制(按液相相對(duì)峰面積計(jì)，HPLC純度為90.6%)[10]；梔子苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。乙腈(色譜純，瑞士Oceanpak公司)；純凈水(杭州娃哈哈公司)；甲醇、冰乙酸等其他試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對(duì)照品50.16mg、西紅花苷-I對(duì)照品10.13mg，置同一50mL棕色容量瓶中，用甲醇超聲，定容，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，制成系列對(duì)照品混標(biāo)溶液。

2.2 供試品溶液的制備 參照中國(guó)藥典2015版梔子含測(cè)項(xiàng)進(jìn)行[1]。精密稱取樣品粉末約0.1g，置25mL容量瓶中，加20mL甲醇超聲(功率250 W，頻率40kHz)提取30min，放冷至室溫后定容，經(jīng)0.45μm濾膜濾過，即得。

2.3 色譜條件[5-6]色譜柱：Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ 色譜柱(250mm × 4.6mm，i.d. 5μm)；以0.1%乙酸溶液(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相梯度洗脫(0～4min，20% B；4～40min，20%～90% B)；流速1.0mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)238nm(梔子苷)、440nm(西紅花苷-I)；進(jìn)樣量20μL。在該色譜條件下，對(duì)照品及供試品中的各色譜峰分離良好，分離度大于1.5。如圖1所示。

2.4 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品混標(biāo)溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。得到梔子苷的線性方程為y=2964.8x+156.35，r=0.9999，線性范圍50.16～501.6μg/mL；西紅花苷-I的線性方程為y=5659.8x+44.591，r=0.9997，線性范圍10.13～101.3 μg/mL。結(jié)果表明,各成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度考察 精密吸取水梔子供試品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積指標(biāo)計(jì)算RSD(n=6)，考察方法的精密度。結(jié)果測(cè)得成分1和2的RSD分別為1.68%和1.02%，表明儀器的精密度符合分析要求。

2.6 重復(fù)性考察 按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份水梔子供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件測(cè)定2種成分的含量。以含量為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察方法的重復(fù)性。結(jié)果測(cè)得成分1和2的含量依次為39.23、9.801mg/g，RSD依次為1.20%、1.13%，表明本法重復(fù)性符合分析要求。

2.7 穩(wěn)定性考察 取水梔子供試品溶液，分別于0、4、8、12、16和24h進(jìn)樣分析，測(cè)定2種成分峰面積，以峰面積值為指標(biāo)計(jì)算RSD(n=6)。結(jié)果測(cè)得成分1和2的RSD依次為3.01%、4.56%，表明本法供試品24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的水梔子樣品50mg，共稱取6份，分別加入精密對(duì)照品混合溶液(其中含對(duì)照品1和2依次為1.962、0.4742mg/mL)1mL，按照2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備。成分1和2的平均回收率分別為97.77%、97.39%，詳見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9 樣品測(cè)定 按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算供試品中2個(gè)成分的含量(按干燥品計(jì))。照中國(guó)藥典2015年版水分測(cè)定法第二法，檢測(cè)供試品中水分含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

梔子果實(shí)中富含梔子苷、西紅花苷、綠原酸酯、果膠、油脂等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，相關(guān)成分分析報(bào)道較多，但水梔子的含量測(cè)定報(bào)道少見。本文參考前期研究相關(guān)文獻(xiàn)[1,10-11]，采用雙波長(zhǎng)法同時(shí)定量分析梔子苷和西紅花苷-I含量，方法學(xué)研究結(jié)果表明該法靈敏度高、簡(jiǎn)便快捷，可為水梔子的質(zhì)量分析方法提供參考。

水梔子傳統(tǒng)習(xí)用為染色用品，其主要有效成分與梔子相似[5-7]，但二者主成分的具體含量差異尚不明確，目前中國(guó)藥典僅收載梔子為中藥材正品[1]。本研究表明，本批次樣品中水梔子與梔子的梔子苷含量差異不大，而西紅花苷-I含量有較大差異，推測(cè)主要與西紅花苷熱穩(wěn)定性差、容易降解有關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的梔子炮制過程中西紅花苷含量明顯降低現(xiàn)象相一致[12-13]。研究結(jié)果表明，水梔子的主成分與梔子相似，在梔子藥材加工、梔子黃制備過程中應(yīng)注意防止高溫高熱引起的西紅花苷類成分降解。水梔子的藥理作用與梔子是否相似，應(yīng)在測(cè)定主要有效成分(梔子苷；西紅花苷)含量基礎(chǔ)上進(jìn)行比較研究。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015: 248.

[2]于洋，高昊，戴毅，等. 梔子屬植物化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].中草藥, 2010, 41(1): 148-153.

[3]中國(guó)質(zhì)檢出版社.GB2760-2011食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[M].北京：中國(guó)質(zhì)檢出版社.2011.

[4]謝宗萬(wàn). 水梔子的品種考證及品質(zhì)評(píng)價(jià)芻議[J]. 中藥材，1991, 14(7): 45-47.

[5]劉素娟，張現(xiàn)濤，王文明，等. 水梔子化學(xué)成分的研究[J]. 中草藥, 2012, 43(2): 238-241.

[6]覃芳敏，孟令杰，袁紅娥，等. 水梔子化學(xué)成分的研究[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2014, 49(4): 275-278.

[7]侯志飛, 王剛, 孫國(guó)祥. 水梔子與梔子高效液相色譜指紋圖譜比較研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2010, 21(11): 2943-2945.

[8]付小梅，葛菲，褚小蘭，等. 梔子和水梔子利膽抗炎作用的對(duì)比研究[J]. 江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2001, 13(4): 165-166.

[9]劉知遠(yuǎn)，吳安. 淺析梔子與水梔子的異同點(diǎn)[J]. 海峽藥學(xué)，2012, 24(9): 31-33.

[10]劉慧璐，馮建勇，王增尚，等. 高色價(jià)梔子黃的精制工藝研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013, 30(12): 1315-1319.

[11]Jianyong Feng, Xihui He, Sheng Zhou, et al. Preparative separation of crocins and geniposide simultaneously from gardenia fruits using macroporous resin and reversed-phase chromatography[J]. Journal of Separation Science, 2014, 37(3): 314-322.

[12]杜偉鋒，梁小娟，吳晶宇，等. 梔子炮制前后綠原酸、梔子苷和西紅花苷-Ⅰ的比較[J]. 中草藥, 2011, 42(10): 2008-2010.

[13]孫娜，徐鋼，趙遠(yuǎn)，等. HPLC測(cè)定梔子不同炮制品中梔子苷、綠原酸和西紅花苷-Ⅰ含量[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014, 20(19): 50-53.

Simultaneous Determination of Geniposide and Crocin-Ⅰ in the Fruits of Gardenia jasminoides var. radicans by HPLC

ZHAO Jiangping1NIU Xin1,2YANG Qun1LI Shujuan1WEI Fengshuang1HAO Lili1LIU Jiangyun1*

1. College of Pharmaceutical Sciences, SooChow University, Suzhou 215123, China；2. Heze City Food and Drug Inspection and Research Institute, Heze 274000, China

Objective To establish an dual-wavelength HPLC method for the simultaneous determination of two compounds in the fruits ofGardeniajasminoidesvar.radicans. Methods The chromatographic separation was performed on a Cosmosil - 5C18-AR-Ⅱ column (250mm × 4.6mm, 5μm) with a gradient elution of methanol and 0.1% acetic acid solution, at a flow rate of 1.0mL/min, and detected at both 238nm (for geniposide, 1) and 440nm (for crocin-Ⅰ, 2). Results The two compounds were separated with satisfaction, with linearity ranges between 50.16～501.6μg/mL (r=0.9999,1) and 10.13～101.3μg/mL (r=0.9997, 2), and average recovery rates to be 97.77% and 97.39%, respectively. Conclusion The method is accurate and selective, which could be applied for the quality analysis of the fruits ofGardeniagenus.

Gardeniajasminoidesvar.radicans; HPLC; Geniposide;Crocin-Ⅰ

R285

A

1007-8517(2017)20-0035-04

全國(guó)藥學(xué)專業(yè)學(xué)位研究生優(yōu)秀教學(xué)案例項(xiàng)目(2016工業(yè)藥學(xué))；蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部學(xué)生課外科研項(xiàng)目(2016-29)。

趙江平(1986-)，男，漢族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與開發(fā)。E-mail:178309373@qq.com

劉江云(1972-)，男，漢族，博士研究生，副教授，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與開發(fā)。E-mail:liujiangyun@suda.edu.cn

2017-09-02 編輯：穆麗華)