王文靜
河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院第一藥劑科,河南 鄭州 450000
HPLC法測(cè)定濕迪膠囊中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量
王文靜
河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院第一藥劑科,河南 鄭州 450000
目的:采用HPLC法測(cè)定濕迪膠囊中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量。方法:采用Wondasil C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱,以乙腈-0.033moL·L-1KH2PO4(磷酸調(diào)pH3.0,25∶75) 為流動(dòng)相;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm;柱溫30℃。結(jié)果:黃芩苷、鹽酸小檗堿分別在4.50~226.31μg/mL、1.14~57.12μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.999;精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果良好;黃芩苷和鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為100.04%、99.80%,RSD分別為1.74%、2.01%。結(jié)論:HPLC測(cè)定濕迪膠囊中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量,其靈敏、準(zhǔn)確,分離效果較好,可作為濕迪膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。
濕迪膠囊;黃芩苷;鹽酸小檗堿;高效液相色譜法
濕迪處方是臨床常用的中藥經(jīng)驗(yàn)方,對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及各種神經(jīng)痛有顯著療效[1-2]。濕迪膠囊是對(duì)該驗(yàn)方進(jìn)行二次開(kāi)發(fā)后研制的新劑型,由黃柏、黃芩、蜈蚣3味中藥組成,為硬膠囊,內(nèi)容物為棕褐色顆粒,味微苦[3-4]。為確保用藥的安全有效,必須對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格控制,使嚴(yán)格按照處方及工藝要求生產(chǎn)。本研究采用高效液相色譜法對(duì)制劑的指標(biāo)性成分鹽酸小檗堿和黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定,為濕迪膠囊質(zhì)量控制方法的建立提供依據(jù)。
1.1 儀器 Shimadzu LC2010- HT高效液相色譜儀(日本島津科技有限公司);SartriusA210P天平(德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);AE240電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);EPED-20TF實(shí)驗(yàn)室級(jí)純水機(jī)(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司);真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。
1.2 試藥 鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào):110713-201326,中國(guó)食品藥品檢定研究院);黃芩苷對(duì)照品(批號(hào):110715-201318,中國(guó)食品藥品檢定研究院);濕迪膠囊(由黃柏、黃芩、蜈蚣3味中藥材組成,中國(guó)藥科大學(xué)中藥制劑教研室制)。甲醇、乙腈為色譜純,水為超純水,其余均為分析純。
2.1 色譜條件Wondasil C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);以乙腈-0.033moL/LKH2PO4(磷酸調(diào)pH3.0,25∶75) 為流動(dòng)相;流速為1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)270nm;柱溫30℃。
2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取黃芩苷對(duì)照品30.32mg和鹽酸小檗堿對(duì)照品(在五氧化二磷干燥器中減壓干燥12h)7.14mg,置于50mL容量瓶中,加入甲醇適量使超聲溶解30min,定容,搖勻,制成含黃芩苷606.4μg/mL和鹽酸小檗堿142.8μg/mL混合對(duì)照品溶液,即得。
2.3 供試品溶液的制備 精密稱取0.1g 膠囊內(nèi)容物,研細(xì),置于100mL容量瓶中,加適量甲醇,超聲30min,放冷,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,靜置,過(guò)0.45μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。
2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例,分別稱取除黃芩之外的2味藥材,按制備工藝制成缺黃芩陰性對(duì)照樣品,按“2.3”項(xiàng)下同法制備陰性對(duì)照溶液;按處方比例分別稱取除黃柏之外的2味藥材,按制備工藝制成缺黃柏陰性對(duì)照樣品,按供試品溶液制備項(xiàng)下同法制備陰性對(duì)照溶液。
2.5 方法學(xué)考察
2.5.1 專屬性和系統(tǒng)適用性 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液,按項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖,考察在該色譜條件下的鹽酸小檗堿和黃芩苷的分離度、理論塔板數(shù)、峰對(duì)稱性等指標(biāo)。分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液,按項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖。以黃芩苷峰計(jì),理論塔板數(shù)均不低于7000,色譜峰分離度良好。結(jié)果如圖1。
2.5.2 線性關(guān)系 分別精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.8、2、4、8、10mL,甲醇定容于25mL容量瓶中,搖勻,在上述色譜條件下進(jìn)樣,分別測(cè)定黃芩苷和鹽酸小檗堿的峰面積,以峰面積(Y)、對(duì)照品濃度(X)進(jìn)行線性回歸。以峰面積(Y),與對(duì)照品濃度(X)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果線性關(guān)系方程:黃芩苷為Y1=19190X1+12567,R2=0.9999,在4.50~226.31μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;鹽酸小檗堿為Y2=28373X2+1834.3,R2=1,在1.14~57.12μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.5.3 精密度 精密吸取混合對(duì)照品溶液(黃芩苷90.52μg/mL、鹽酸小檗堿22.85μg/mL)10μL,連續(xù)進(jìn)樣6次。黃芩苷、鹽酸小檗堿面積的RSD分別為0.19%、0.30%,精密度良好。
2.5.4 重復(fù)性 取同一批次膠囊內(nèi)容物(批號(hào)20140423)6份,制成供試品溶液,精密吸取10μL,在上述色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品含量。黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的RSD分別是2.96%、2.00%,重復(fù)性良好。
2.5.5 穩(wěn)定性 精密稱取0.1g膠囊內(nèi)容物(研細(xì)),分別于放置0、2、4、6、8h后進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)樣10μL,記錄色譜峰面積。黃芩苷和鹽酸小檗堿的峰面積RSD分別是2.53%和1.05%,穩(wěn)定性良好。
2.5.6 加樣回收率 取已知含量的膠囊內(nèi)容物0.05g,置于100mL容量瓶中,取己知含量的浸膏粉樣品0.03g,置于25mL容量瓶中,精密加入混合對(duì)照品(黃芩苷606.4μg/mL,鹽酸小檗堿142.8μg/mL),按供試品溶液制備方法項(xiàng)下操作,平行6份,按供試品溶液制備方法項(xiàng)下操作,平行6份,測(cè)定黃芩苷和鹽酸小檗堿的峰面積,計(jì)算回收率。黃芩苷和鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為100.04%、99.80%,RSD分別為1.74%、2.01%,表明本實(shí)驗(yàn)回收率良好,該方法能較好地滿足含量測(cè)定要求。見(jiàn)表1。
表1 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)
表2 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)
2.6 含量測(cè)定 分別稱取三批次樣品(批號(hào):20140421、20140421、2014042),按上述方法制備供試品溶液,精密吸取10μL,進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,采用外標(biāo)法計(jì)算含量,并計(jì)算平均值,每個(gè)批號(hào)分別測(cè)定3次。3批號(hào)制劑樣品,如含量測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定,由外標(biāo)法計(jì)算含量,見(jiàn)表3。結(jié)果表明3批濕迪膠囊中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量差異符合質(zhì)量要求。
表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果
濕迪處方的有效成分及有效部位尚不明確,因此選用多個(gè)指標(biāo)成分的含量對(duì)膠囊質(zhì)量進(jìn)行控制。實(shí)驗(yàn)分別以黃柏中的鹽酸小檗堿[5-6]、黃芩中的黃芩苷[7-8]作為指標(biāo)性成分,通過(guò)對(duì)流動(dòng)相種類、比例的優(yōu)化,建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量,并進(jìn)行了方法學(xué)考察。在對(duì)波長(zhǎng)選擇中,黃芩苷最大吸收波長(zhǎng)為275nm,鹽酸小檗堿最大吸收波長(zhǎng)為265nm,兩者在270nm處有等吸收點(diǎn),實(shí)驗(yàn)選擇270nm作為檢測(cè)波長(zhǎng),兩者峰分離度較好、基線平直、靈敏度較高。在流動(dòng)相系統(tǒng)的考察中,通過(guò)對(duì)比各流動(dòng)相系統(tǒng)發(fā)現(xiàn),乙腈-水系統(tǒng)效果較為理想。采用等度洗脫時(shí),既能有效地分離黃芩苷和鹽酸小檗堿峰與其他峰,洗脫操作簡(jiǎn)單,可保證樣品組分達(dá)到基線分離,能較好對(duì)黃芩苷和鹽酸小檗堿進(jìn)行定性和定量,系統(tǒng)適用性較好。在流動(dòng)相乙腈-水系統(tǒng)中,各峰形不是很好,對(duì)稱因子未全部達(dá)到要求,故考察了流動(dòng)相pH的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用KH2PO4(磷酸調(diào)pH 3.0)溶液,分離效果較好,且各峰的對(duì)稱因子均在0.95~1.05之間,因此,確定乙腈-0.033moL/LKH2PO4(磷酸調(diào)pH 3.0,25∶75) 為流動(dòng)相。該測(cè)定方法專屬性強(qiáng),重現(xiàn)性好,陰性對(duì)照無(wú)干擾,可以作為新制劑質(zhì)量控制的方法。
本研究以黃芩苷和鹽酸小檗堿為指標(biāo),建立了HPLC測(cè)定濕迪膠囊中黃芩苷和鹽酸小檗堿的方法。結(jié)果表明,濕迪膠囊中黃芩苷含量不得少于5.0mg/粒,鹽酸小檗堿含量不得少于9.0mg/粒。本方法方法合理準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、靈敏度高,數(shù)據(jù)真實(shí)可靠,符合藥典HPLC法的含量測(cè)定要求,有效保證了制劑質(zhì)量,可作為濕迪膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)提供依據(jù)。
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1007-8517(2017)20-0021-03
王文靜(1989-),女,漢族,碩士研究生,中藥調(diào)劑員,研究方向?yàn)橹兴幖爸兴幹苿┭芯俊-mail: wangwenjing8949@163.com
2017-08-29 編輯:穆麗華)