IL-37b通過抑制樹突狀細胞相關的免疫應答緩解感染性休克

李夢媛，燕正強，韋榮飛，楊星九，朱瑞敏，高 苒*

(1.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021；2.定西市中醫(yī)院骨傷一科，甘肅 定西 743000)

IL-37b通過抑制樹突狀細胞相關的免疫應答緩解感染性休克

李夢媛1，燕正強2，韋榮飛1，楊星九1，朱瑞敏1，高 苒1*

(1.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021；2.定西市中醫(yī)院骨傷一科，甘肅 定西 743000)

目的表達IL-37b重組蛋白，研究其在調節(jié)機體免疫應答方面的作用機制。方法構建原核表達載體pET28/IL-37b，誘導表達的IL-37b重組蛋白由Ni2+-NTA凝膠進行純化。將IL-37b作用于C57BL/6 J小鼠，注射LPS誘導感染性休克，檢測小鼠血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ的表達水平。分離并培養(yǎng)小鼠樹突狀細胞，用IL-37b處理，經LPS誘導活化，檢測細胞表面CD40、CD80、MHCII等標志物分子表達情況，以及培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-10、IL-12、TNF-α的表達水平。分離小鼠CD4+T細胞，檢測IL-37b對LPS誘導的T細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、IL-10的抑制作用。結果IL-37b能夠降低感染性休克的小鼠血清中促炎性細胞因子的表達；并抑制小鼠樹突狀細胞共刺激分子和促炎性細胞因子的表達，以及CD4+T細胞表達促炎性細胞因子。結論純化的IL-37b具備生物學活性，能夠通過抑制樹突狀細胞活化及相關的T細胞免疫應答緩解機體感染性休克。

IL-37b；純化；樹突狀細胞；免疫應答；感染性休克

細胞因子IL-37屬IL-1家族成員，曾經被命名為IL-1F7[1]，其在人體多種組織、器官中都有表達[2-4]，但小鼠體內并沒有被發(fā)現有其同類細胞因子的表達[5]。IL-37的基因序列包含6個外顯子，外顯子1～3編碼IL-37前體蛋白的N末端，外顯子4～6編碼C末端IL-1樣細胞因子結構[6]。IL-37的編碼產物有a、b、c、d、e共5種亞型，其中IL-37b是五種亞型中序列最長的一個，共有218個氨基酸，含有外顯子1、2、4、5、6[7]。近年來，大量研究已證實IL-37b具有生物學活性，能夠作為炎癥抑制因子在多種炎癥性疾病中發(fā)揮功能，調節(jié)固有免疫應答[8-11]。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)表面具有豐富的抗原遞呈分子，是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞(antigen presenting cells，APC)，能夠高效地攝取、加工處理和遞呈抗原。成熟的DCs能夠激活初始型T細胞，啟動并調控免疫應答，是機體免疫反應的關鍵調控者[12]。

本實驗通過構建原核表達載體大量表達IL-37b重組蛋白，研究IL-37b對DCs活化及其相關的免疫應答的影響，并進一步研究IL-37b對機體炎癥反應發(fā)揮抑制作用的機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物與原核表達質粒

7～8周齡SPF級雌性C57BL/6 J小鼠18只購自北京華阜康生物科技股份有限公司 [SCXK (京) 2014-0004]，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所動物實驗室 [SYXK (京) 2014-002]。該實驗研究經由實驗動物使用與管理委員會批準(IACUC：GR16002)。

含有全長IL-37b基因的重組質粒pET28/IL-37b由本實驗室制備并保存。

1.2主要試劑與用品

酵母提取物、干粉蛋白胨、瓊脂粉購自Oxiod公司；質粒提取試劑盒購自Qiagen公司；Ni2+-NTA凝膠購自Novagen公司；尿素、Tris-HCl、NaH2PO4、考馬斯亮藍等化學試劑購自Amresco公司；PBS、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶等購自Gibco公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自Sigma公司；重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)購自Peprotech公司；無菌細胞篩網、紅細胞裂解液、流式CBA細胞因子檢測試劑盒購自BD公司；熒光標記的細胞表面標志分子檢測抗體購自eBioscience公司；預染蛋白分子量Marker、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo公司。引物合成及測序等服務由英濰捷基(上海)公司提供。

1.3實驗方法

1.3.1 蛋白純化

將制備好的能夠穩(wěn)定表達重組質粒pET28/IL-37b的大腸桿菌甘油菌凍存液均勻涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板表面，于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜，復蘇菌種。次日，挑取單個菌落接種至3～4 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振搖培養(yǎng)8 h。將培養(yǎng)的菌液按1∶500的體積比接種到1 L LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)37℃，200 r/min振搖，擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)至菌液A600值達到0.5～0.6時，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導菌體表達蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)。16～18 h后，以4℃、4000 r/min條件離心30 min，收集菌體沉淀。用PBS溶液重懸沉淀，超聲破碎菌體，12 000 r/min再次離心20 min，分別取裂解產物的上清與沉淀進行SDS-PAGE電泳，電泳結果顯示菌體裂解產物的上清和沉淀中都有外源性重組蛋白表達的條帶，表明重組IL-37b具有可溶性和包涵體兩種表達形式，其中沉淀中的目的重組蛋白較多，故收集菌體沉淀進行純化[13]。

因重組IL-37b蛋白帶有6個His標簽，故采用Ni2+-NTA凝膠進行變性條件下的親和層析純化。變性結合緩沖液為8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0；變性漂洗緩沖液為8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 6.3；變性洗脫緩沖液為8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 4.5。純化完成后，對收集到的重組蛋白溶液進行透析復性，并除去其中的尿素，于4℃環(huán)境透析24 h，每2～3 h更換一次透析液。

將蛋白純化過程中收集的各組分溶液樣品進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，小心地將有條帶的分離膠部分切下來，用考馬斯亮藍染色30 min～1 h，至能明顯觀察到marker與蛋白條帶后，將其放入乙酸脫色液中洗滌脫色至蛋白條帶清晰。在紫外顯影儀下觀察蛋白條帶大小位置并拍照記錄。

1.3.2 IL-37b重組蛋白對LPS誘導的機體感染性休克的抑制作用

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁外表層的內毒素脂多糖，能夠引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、感染性休克等癥狀[14]。將C57BL/6 J小鼠分為實驗組與對照組兩組，每組6只；實驗組按照體重腹腔注射10 mg/kg的IL-37b重組蛋白溶液，對照組注射相同體積的PBS溶液；2 h后按體重給每只小鼠腹腔注射10 mg/kg的LPS。注射18～20 h后，進行眼眶取血，將全血室溫靜置1～2 h，待血凝后離心收集血清。采用CBA細胞因子檢測試劑盒檢測小鼠血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ的表達水平。按照試劑盒說明書進行操作，配制含有上述3種細胞因子對應的捕獲微球混合溶液，每個血清樣品取50 μL，與同體積的微球混合液混勻，室溫作用1 h；配制含有上述3種細胞因子對應的PE標記的熒光抗體混合溶液，取50 μL，逐一加入上一步的樣品中并混勻，室溫避光繼續(xù)作用1 h；1500 r/min離心5 min，洗滌一次，將樣品重懸后通過流式細胞儀檢測血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ 3種細胞因子的表達量。

1.3.3 小鼠骨髓樹突狀細胞的分離與培養(yǎng)

取3只C57BL/6 J小鼠，頸椎脫臼處死后，浸入75%乙醇中滅菌，在生物安全柜中解剖分離股骨與脛骨，用注射器抽取PBS溶液吹洗骨髓腔得到骨髓懸液；將骨髓懸液流過70 μm孔徑的細胞篩網，收集細胞懸液，以1500 r/min離心5 min，棄去上清溶液；加入5 mL配制好的紅細胞裂解液，重懸細胞，4℃靜置5 min，去除紅細胞；隨后1500 r/min離心5 min，棄去上清溶液，用PBS溶液以相同的條件離心洗滌細胞，再次棄去上清溶液；用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，接種于無菌培養(yǎng)皿中；DCs半貼壁生長，用工作濃度20 ng/mL的GM-CSF與10 ng/mL IL-4共同誘導培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)6 d，每3 d更換一次培養(yǎng)基，補充細胞因子。GM-CSF能夠誘導DCs擴增分化，并在體外環(huán)境下維持其生存；IL-4可抑制巨噬細胞克隆形成，誘導DCs生長成熟。該方法得到的DCs可達到細胞總數的90%以上[15]。

1.3.4 IL-37b重組蛋白對小鼠樹突狀細胞活化的抑制作用

將培養(yǎng)6 d的DCs制成濃度為2 × 106個/mL的細胞懸液，接種于24孔細胞培養(yǎng)板，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。LPS能夠促進DCs活化或進一步成熟，實驗組細胞先采用工作濃度500 ng/mL的IL-37b單獨作用，2 h后加入工作濃度為500 ng/mL的LPS，與重組蛋白共同作用于細胞；對照組細胞則采用與重組蛋白溶液同體積的PBS溶液與500 ng/mL的LPS共同作用。37℃培養(yǎng)18～20 h后，分別收集細胞與培養(yǎng)上清。

1.3.5 流式細胞術檢測樹突狀細胞表面的標志物分子表達情況

通過流式細胞儀檢測DCs表面標志分子CD40、CD80、MHCII的表達情況。配制含有不同熒光標記的CD40(PE)、CD80(PE-Cyanine5)、MHCII(FITC)抗體混合溶液，加入離心收集到的細胞沉淀中并將其重懸，4℃避光反應30 min；1500 r/min離心5 min，棄去上清，加入PBS溶液離心洗滌細胞一次，再將細胞重懸；用200目篩網過濾細胞，通過流式細胞儀檢測DCs表面CD40、CD80、MHCII的表達水平。

1.3.6 流式細胞術檢測樹突狀細胞培養(yǎng)上清中的細胞因子表達水平

采用CBA細胞因子檢測試劑盒檢測1.3.4中收集的DCs培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-10、IL-12、TNF-α的表達量。按照試劑盒說明書進行操作，步驟同1.3.2。

1.3.7 分離小鼠脾臟CD4+ T細胞

取3只C57BL/6 J小鼠，頸椎脫臼處死后，浸入75%乙醇中滅菌，在生物安全柜中解剖取脾臟，浸入PBS溶液。用無菌注射器活塞研磨至細胞釋出，將細胞懸液流過70 μm孔徑的細胞篩網，收集細胞懸液，以1500 r/min離心5 min，棄去上清溶液；加入紅細胞裂解液去除紅細胞，步驟同1.3.3。配制CD4+(FITC)抗體溶液，加入離心后的細胞沉淀中并將其重懸，避光反應30 min；反應結束后離心去除上清，并加入PBS溶液離心洗滌細胞一次，再將細胞重懸；用200目篩網過濾細胞，通過流式細胞儀對細胞懸液中的CD4+ T細胞進行分選。

1.3.8 IL-37b重組蛋白對小鼠CD4+T細胞活化的抑制作用

將分選后的小鼠CD4+T細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板，實驗組與對照組分別采用工作濃度500 ng/mL的IL-37b與同體積的PBS溶液單獨作用，2 h后加入工作濃度為500 ng/mL的LPS，共同孵育培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)18 h后，離心收集細胞培養(yǎng)上清，采用CBA細胞因子檢測試劑盒檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、IL-10的表達量。按照試劑盒說明書進行操作，步驟同1.3.2。

1.4統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1蛋白純化

SDS-PAGE電泳結果如圖1所示，在25 × 103左右處有一條高表達的外源性蛋白條帶，與預期IL-37b重組蛋白的分子量相符合；并且純化后的蛋白溶液中除該目的條帶外未見其他條帶。

2.2小鼠血清中促炎性細胞因子的表達

通過流式細胞儀檢測經LPS誘導感染性休克的小鼠血清中細胞因子表達水平。與PBS對照組比較，經IL-37b重組蛋白預處理后，小鼠血清中的IL-1β、IL-6與IFN-γ的表達水平均顯著下降，如圖2所示。表明純化的重組IL-37b蛋白具備生物學活性，能夠抑制LPS引起的機體炎癥反應。

2.3小鼠樹突狀細胞表面標志物分子的表達

通過流式細胞儀檢測經LPS作用后的小鼠DCs表面CD40、CD80、MHCII等表面標志物分子的表達水平。實驗結果顯示，在相同數量的細胞中，經IL-37b預處理的DCs表面CD40、CD80與MHCII所占的百分比低于未經蛋白作用的組別，其中CD40、CD80的下降趨勢差異有顯著性，如圖3所示。

圖1 IL-37b純化的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of IL-37b purification and identification

注：n=6；與PBS對照組比較，* P< 0.05。圖2 血清中促炎性細胞因子的表達 Note. n=6; Compared with the PBS control group,*P< 0.05.Fig.2 Expression levels of proinflammatory cytokines in the serum of mice with LPS-induced septic shock

注：n=3；* P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。圖3 樹突細胞表面抗原的表達Note. n=3;*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.Fig.3 Surface antigen expression on dendritic cells

2.4小鼠樹突狀細胞培養(yǎng)上清中促炎性細胞因子的表達

通過流式細胞儀檢測經LPS作用后小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-10、IL-12、TNF-α的表達水平。實驗結果顯示，與未經蛋白預處理的對照組相比，經IL-37b作用的細胞培養(yǎng)上清中，上述4種細胞因子的表達量全部降低，其中IL-1β、IL-12與TNF-α顯著下降，如圖4所示。

2.5小鼠CD4+T細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的表達

通過流式細胞儀檢測經LPS作用后小鼠脾臟CD4+T細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、IL-10的表達水平。實驗結果顯示，與未經IL-37b預處理的對照組相比，經IL-37b作用的細胞培養(yǎng)上清中，上述3種細胞因子的表達量明顯下降，如圖5所示。

3 討論

人DCs起源于造血干細胞，DCs表面具有豐富的抗原遞呈分子，如組織相容性復合物MHCI與MHCII，共刺激因子CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40/CD40L，以及粘附因子ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3等。未成熟的DCs具有較強的遷移能力與抗原吞噬能力，而成熟的DCs表面高表達共刺激分子與粘附因子，處于啟動、調控、維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)[12]。DCs使T細胞活化需要三個信號：第一個信號是DCs表面高表達MHCI或MHCII分子，其與被捕獲并加工處理后的抗原肽結合后，共同遞呈給T細胞；第二個信號是DCs表面高表達的共刺激分子CD80、CD86、CD40等，能夠促進T細胞活化，啟動免疫應答；第三個信號即活化的DCs大量分泌的IL-1β、IL-12、TNF-α、IL-10和IL-6等細胞因子，這些細胞因子能夠激活T細胞分化增殖并影響其分化方向[16]，故DCs能夠介導T細胞免疫應答。

Nold[17]等用IL-37轉基因小鼠進行實驗，證實IL-37能夠抑制LPS引起的機體感染性休克；并且，IL-37也能夠在體外抑制LPS刺激引起的人外周血單核細胞和上皮細胞促炎性細胞因子的表達。本實驗采用IL-37b重組蛋白對野生型(wild type，WT)小鼠進行預處理，隨后通過LPS誘導其感染性休克，證實IL-37b重組蛋白能夠明顯抑制血清中的IL-1β、IL-6與IFN-γ等促炎性細胞因子的表達，說明原核表達的IL-37b具備生物學活性，能夠抑制機體感染性休克。

注：n=3；*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。圖4 樹突細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的表達Note. n=3;*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.Fig.4 Expression of cytokines in culture supernatants of dendritic cells

注：n=3；*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。圖5 CD4+ T細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的表達Note. n=3;*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.Fig.5 Expression of cytokines in culture supernatants of CD4+ T cells

LPS能夠促進DCs進一步活化并分泌大量促炎性細胞因子，從而促進T細胞免疫應答[18]。Nold[17]等通過流式細胞術檢測了感染性休克小鼠脾臟DCs中CD86和MHCII分子雙陽性細胞所占的比例，這些表面分子的大量表達可以引發(fā)T細胞免疫應答。實驗中，WT小鼠CD86和MHCII分子雙陽性細胞所占的比例是73%，而IL-37轉基因小鼠CD86和MHCII分子雙陽性細胞所占的比例僅為47%，表明IL-37能夠抑制LPS引起的DCs活化。CD4+T細胞是免疫調節(jié)的核心細胞群體，不同的CD4+T細胞通過分泌不同的細胞因子，對免疫系統(tǒng)的整體功能具有重要的調控作用[19]。成熟的DCs是IL-1β的重要來源，在某些情況下，DCs可通過分泌以IL-1β為主的細胞因子，促進T細胞活化。IL-12和TNF-α是促進輔助性T細胞(T helper cells，Th)向Th1分化的主要細胞因子，IL-6和IL-10則促進Th向Th2分化，這些細胞因子表達量的變化對Th0的分化起著重要作用[12, 20]。Th1與Th2同屬于CD4+T細胞亞群，Th1能夠分泌TNF-α、IFN-γ等細胞因子，促進炎癥介質的進一步合成；而Th2可產生IL-10等細胞因子，這些細胞因子的適量表達有利于控制、阻斷急性炎癥的發(fā)展，因而對體內的炎癥反應起下調作用[21]。本實驗中，經IL-37b預處理的小鼠DCs培養(yǎng)上清中的IL-1β、IL-10、IL-12、TNF-α表達量全部降低，DCs表面的共刺激分子表達下降，證實IL-37b能夠抑制DCs活化，且抑制其傳達使T細胞活化的信號；并且，IL-37b能夠降低CD4+T細胞表達的IFN-γ、TNF-α、IL-10等細胞因子，抑制T細胞免疫應答反應的進程。

綜上，IL-37b能夠抑制T細胞的活化與其向Th1、Th2分化的進程，從而抑制T細胞免疫應答。證實IL-37b能夠通過抑制DCs活化及相關的T細胞免疫應答反應緩解LPS引起的機體感染性休克。

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IL-37balleviatessepticshockthroughinhibitionofimmuneresponsesrelatedtodendriticcells

LI Meng-yuan1， YAN Zheng-qiang2, WEI Rong-fei1， YANG Xing-jiu1， ZHU Rui-min1， GAO Ran1*

(1.Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Comparative Medicine Center, Peking Union Medical College (PUMC), Beijing 100021, China; 2.Department of Orthopedics,Dingxi Hospital of Traditional Chinese Medicine,Dingxi 743000,China)

ObjectiveTo express the recombinant IL-37b protein and to investigate its role in the regulation of immune responses.MethodsThe prokaryotic expression vector pET28/IL-37b was constructed. The recombinant IL-37b protein was induced to be expressed and was purified using Ni2+-NTA gel column. C57BL/6 J mice were treated with IL-37b and injected with lipopolysaccharide (LPS) to induce septic shock, and the expression levels of IL-1β, IL-6, IFN-γ in the serum of the mice were detected. Dendritic cells from bone marrow of the mice were isolated and cultured, and were treated with IL-37b. After LPS-induced activation, the expression levels of marker molecules such as CD40, CD80 and MHCII on the cell surface, and cytokines such as IL-1β, IL-10, IL-12 and TNF-α in the culture supernatants were detected by flow cytometry. The CD4+T cells from mice were isolated and the inhibitory effects of IL-37b on the expression of IFN-γ, TNF-α and IL-10 in the culture supernatants of T cells after induction by LPS were detected.ResultsIL-37b reduced the expression levels of proinflammatory cytokines in the serum of septic shock mice. IL-37b also inhibited the expression of co-stimulatory molecules and proinflammatory cytokines of the mouse dendritic cells, and suppress the activation of CD4+T cellsinvitro.ConclusionsPurified recombinant IL-37b protein has high bioactivity, and can alleviate septic shock in organisms through inhibiting the activation of dendritic cells and related T cell immune responses.

IL-37b; Purification; Dendritic cells; Immune responses; Septic shock

中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程-重大協(xié)同創(chuàng)新項目-協(xié)同創(chuàng)新團隊資助(編號：2016-I2M-3-019)。

李夢媛(1988-)，女，研究方向：免疫學。E-mail: limengyuan767@126.com

高苒(1980 -)，女，研究方向：腫瘤學、免疫學。E-mail: gaoran26@hotmail.com

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1671-7856(2017) 11-0044-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.11.009

2017-03-23