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    氣相色譜法測(cè)定豬凝血酶凍干粉中磷酸三丁酯殘留量

    2017-11-27 08:54:33劉璐趙瑩瑩張軍東
    上海醫(yī)藥 2017年21期
    關(guān)鍵詞:氣相色譜

    劉璐+趙瑩瑩+張軍東

    摘 要 建立了氣相色譜法測(cè)定豬凝血酶中磷酸三丁酯殘留量,并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。采用聚乙二醇毛細(xì)管柱Agilent HP-INNOWAX(30 m × 250 mm × 0.25 mm),溶劑為正己烷;氣化室溫度190 ℃,分流比1∶1,進(jìn)樣量1 ml;FID檢測(cè)器溫度210 ℃;載氣為高純氮?dú)猓魉贋? ml/min;柱溫150 ℃,運(yùn)行時(shí)間13 min。結(jié)果顯示該方法專屬性強(qiáng);標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為2.406~19.25 mg/ml;低、中、高3個(gè)濃度水平的平均回收率分別為97.1%、101.1%和98.2%,總平均回收率為99.8%,總相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.37%;中間精密度總標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.01%;檢測(cè)限為0.762 mg/ml,定量限為2.54 mg/ml;3批樣品的磷酸三丁酯殘留量均低于《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版三部的限量要求(<10 mg/ml)。該方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性、耐用性良好,可用于豬凝血酶凍干粉中磷酸三丁酯殘留檢測(cè)。

    關(guān)鍵詞 氣相色譜 豬凝血酶 磷酸三丁酯 殘留

    中圖分類號(hào):O657.71; R926 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1006-1533(2017)21-0076-05

    Determination of the residual tri-n-butyl phosphate in porcine thrombin by gas chromatography

    LIU Lu*, ZHAO Yingying, ZHANG Jundong

    (Shanghai Haohai Biological Technology Co., Ltd, Shanghai 200052, China)

    ABSTRACT A gas chromatography method was established to determine the residual Tri-n-butyl phosphate in porcine thrombin and was completely evaluated. An Agilent HP-INNOWAX column (30 m×250 mm×0.25 mm) was adopted and the operation procedures were as follows: vaporizing chamber temperature 190 ℃, split ratio 1:1, sample volume 1 ml; FID detector temperature 210 ℃; carrier gas: highly pure nitrogen at 3 ml/min; column temperature 150 ℃ and running for13 min. The results showed that the method had strong specificity and the standard curve was linear over the range of 2.406~19.246 mg/ml. The average recoveries at low, medium and high levels were 97.1%, 101.1% and 98.2%, respectively and the overall average recovery was 99.8%, and the overall RSD value was 2.37% and RSD value of the mid-precision was 5.01%. The limit of detection was 0.762 mg/ml and the limit of quantitation was 2.54 mg/ml. The residual TNBP values from three batches of porcine thrombin were apparently lower than the limit value set by Chinese Pharmacopoeia (<10 mg/ml). The method was suitable for the determination of residual TNBP in porcine thrombin with good accuracy, reproducibility, stability and robustness.

    KEy WORDS gas chromatography; porcine thrombin; tri-n-butyl phosphate; residue

    豬源纖維蛋白黏合劑(含豬纖維蛋白原、豬凝血酶及相應(yīng)的溶解液)原為Ⅲ類醫(yī)療器械,臨床主要用于術(shù)中輔助止血。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局2006年發(fā)布《關(guān)于規(guī)范纖維蛋白膠類產(chǎn)品監(jiān)督管理有關(guān)事宜的公告》要求豬源纖維蛋白粘合劑類產(chǎn)品由醫(yī)療器械升級(jí)為藥品管理[1]。為提高產(chǎn)品臨床使用的安全性,本公司參照《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》[2]在豬凝血酶生產(chǎn)過(guò)程中采用有機(jī)溶劑/去污劑(S/D)處理法進(jìn)行病毒滅活,其中有機(jī)溶劑為磷酸三丁酯(tri-n-butyl phosphate,TNBP),研究表明TNBP對(duì)包膜病毒具有較好的滅活效果[3-4],但對(duì)人體有一定的毒性[5],故按《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版三部規(guī)定,磷酸三丁酯殘留量應(yīng)不高于10 mg/ml[6]。本研究采用氣相色譜法對(duì)本公司生產(chǎn)的豬凝血酶進(jìn)行TNBP殘留檢測(cè),并對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

    1 材料與方法

    1.1 樣品與試劑

    豬凝血酶凍干粉(2.5 ml規(guī)格,批號(hào):20161211、20170114、20170301)由本公司生產(chǎn)。endprint

    磷酸三丁酯(GC,純度>99.9%,批號(hào):BCBN5037V)購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;磷酸三丙酯(GC,純度>99%,批號(hào):38196TJV)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;正己烷(HPLC,批號(hào):68977223)購(gòu)自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司;高氯酸(AR,批號(hào):20141025)購(gòu)自永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司;水為純化水。

    1.2 主要儀器

    安捷倫7890B氣相色譜儀含氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)(美國(guó)安捷倫科技有限公司);ME104型電子天平(梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司);H1650型高速臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);DKS24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

    1.3 溶液配制

    高氯酸溶液(1.5 mol/L):量取70%高氯酸溶液12 ml加入裝有約80 ml超純水的100 ml量瓶中,待其溫度降至室溫后,加超純水定容至刻度并混勻。

    內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱取磷酸三丙酯0.25 g,加正己烷定容至25 ml,即為內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(10 mg/ml)。臨用前取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液0.50 ml于25 ml量瓶中,用正己烷定容即得內(nèi)標(biāo)溶液(200 mg/ml)。

    對(duì)照品溶液(STD):精密稱取磷酸三丁酯0.25 g,加正己烷定容至25 ml,即為對(duì)照品母液(10 mg/ml)。臨用前取對(duì)照品母液0.75 ml于25 ml量瓶中,用正己烷定容即得對(duì)照品溶液(300 mg/ml)。

    樣品溶液:每瓶豬凝血酶凍干粉加2.5 ml純化水,待其完全溶解后,即得樣品溶液。

    1.4 樣品處理

    精密量取樣品溶液1.25 ml于玻璃離心管中,精密加內(nèi)標(biāo)溶液50 ml和1.5 mol/L高氯酸溶液0.375 ml,混勻,置37 ℃水浴保溫10 min后,加入正己烷2 ml,混勻,靜置10 min,3 000 r/min離心20 min,吸取上層清液進(jìn)樣。

    1.5 氣相色譜條件

    聚乙二醇毛細(xì)管柱Agilent HP-INNOWAX(30 m ×250 mm × 0.25 mm);溶劑為正己烷;氣化室溫度190 ℃,分流比1∶1,進(jìn)樣量1 ml;FID檢測(cè)器溫度210 ℃;載氣為高純氮?dú)猓魉贋? ml/min;柱溫150 ℃,運(yùn)行時(shí)間13 min。

    1.6 方法驗(yàn)證

    1.6.1 專屬性驗(yàn)證

    分別取適量?jī)?nèi)標(biāo)(磷酸三丙酯)和對(duì)照品(磷酸三丁酯)用正己烷配制成濃度為5.0 mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液和對(duì)照品溶液,按1.5項(xiàng)進(jìn)樣分析,考察方法的專屬性。

    1.6.2 線性范圍確定

    精密量取對(duì)照品溶液10、20、40、60、80 ml(25%、50%、100%、150%、200%水平),分別置已加1.25 ml水的離心管中,再向各對(duì)照品管精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 ml,混勻,置于37 ℃水浴保溫10 min后,放冷,再加入正己烷2 ml,混勻,靜置10 min后,3 000 r/min離心20 min,吸取上層清液,分別進(jìn)樣上述溶液各一次。以對(duì)照品磷酸三丁酯濃度為x軸,以磷酸三丁酯和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比(As/Ai)為y軸,進(jìn)行線性回歸。

    1.6.3 檢測(cè)限與定量限確定

    檢測(cè)限確定:精密量取對(duì)照品母液3 ml置10 ml容量瓶中,正己烷定容至刻度,搖勻,再精密量取該溶液10 ml于加有1.25 ml水的離心管中,再加入50 ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,混勻,置于37 ℃水浴保溫10 min后,放冷,再加入正己烷2 ml,混勻,靜置10 min后,3 000 r/min離心20 min,小心吸取上層正己烷層即得檢測(cè)限樣品,按1.5項(xiàng)進(jìn)樣檢測(cè)。

    定量限確定:精密量取對(duì)照品母液10.0 ml于加有1.25 ml水的離心管中,再加入50 ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,混勻,置于37 ℃水浴保溫10 min后,放冷,再加入正己烷2 ml,混勻,靜置10 min后,3 000 r/min離心20 min,小心吸取上層正己烷層即得定量限樣品,按1.5項(xiàng)進(jìn)樣檢測(cè)。

    1.6.4 準(zhǔn)確度、精密度(中間精密度)、穩(wěn)定性試驗(yàn)

    準(zhǔn)確度驗(yàn)證:分別取對(duì)照品母液20、40 和60 ml于加有1.25 ml樣品溶液的離心管中,按1.4項(xiàng)樣品處理后即得濃度水平為50%、100%、125%的準(zhǔn)確度樣品溶液,每一濃度水平平行配制3份,進(jìn)樣檢測(cè)。

    精密度驗(yàn)證:采用準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為操作人員甲的精密度(中間精密度)數(shù)據(jù),操作人員乙在不同的日期、使用不同色譜柱、不同的系列溶液,平行配制6份100%水平準(zhǔn)確度樣品以及2份控制樣品溶液,進(jìn)樣檢測(cè)。

    穩(wěn)定性試驗(yàn):取對(duì)照品溶液和樣品溶液(100%水平準(zhǔn)確度樣品),分別放置在室溫條件0、12、24和48 h,進(jìn)樣檢測(cè)考察溶液穩(wěn)定性。

    1.6.5 耐用性試驗(yàn)

    在其他色譜條件不變的條件下,方法發(fā)生微小變動(dòng),分別調(diào)整離心轉(zhuǎn)速至方法規(guī)定的±200 r/min、調(diào)整載氣流速至方法規(guī)定的±0.2 ml/min、調(diào)整柱溫至方法規(guī)定的±2 ℃,考察其系統(tǒng)適應(yīng)性。

    2 結(jié)果

    2.1 系統(tǒng)適用性

    分別取空白溶劑和對(duì)照品溶液(STD)注入氣相色譜儀中分析。結(jié)果表明對(duì)照溶液(STD)中理論板數(shù)按磷酸三丁酯峰計(jì)算均高于5 000;磷酸三丁酯峰與內(nèi)標(biāo)峰的分離度均大于1.5;起始5針對(duì)照溶液(STD)中磷酸三丁酯與內(nèi)標(biāo)峰面積比的RSD均≤5.0%。所有間插進(jìn)樣的對(duì)照品溶液中磷酸三丁酯與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比與起始5針對(duì)照品溶液的平均峰面積的比值在95.99%~102.7%之間。

    2.2 專屬性試驗(yàn)

    正己烷對(duì)內(nèi)標(biāo)物和對(duì)照品的保留時(shí)間沒(méi)有干擾,專屬性結(jié)果符合接受標(biāo)準(zhǔn)(圖1)。endprint

    2.3 線性試驗(yàn)

    線性方程為y = 0.137 4x + 0.015 4,線性范圍為2.406~19.25 mg/ml,相關(guān)系數(shù)r = 0.999 7,符合接受標(biāo)準(zhǔn)(≥0.990)。

    2.4 檢測(cè)限與定量限確定

    檢測(cè)限樣品測(cè)得的信噪比(S/N)為5.2,滿足接受標(biāo)準(zhǔn)(S/N≥3),該方法的檢測(cè)限為0. 762 mg/ml。定量限樣品6次測(cè)得的信噪比(S/N)為15.2~16.8,6份樣品中主成分含量測(cè)定結(jié)果的RSD(n=6)為3.56%,滿足接受標(biāo)準(zhǔn)(S/N≥10,RSD 5.0%),該方法的定量限為2.54 mg/ml(表 1)。

    2.5 準(zhǔn)確度、精密度(中間精密度)、穩(wěn)定性試驗(yàn)

    不同濃度準(zhǔn)確度樣品測(cè)得主成分總平均回收率為99.8%,RSD為2.37%(表2)。

    精密度樣品檢測(cè)結(jié)果顯示兩位操作人員制備的樣品中主成分回收率測(cè)定結(jié)果的RSD為5.01%(n=18),結(jié)果滿足接受標(biāo)準(zhǔn)(15.00%)(表3)。

    穩(wěn)定性試驗(yàn)樣品檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照品溶液和樣品溶液在不同時(shí)間內(nèi)回收率比值均在 95.0%~105.0%之間(表4)。

    2.6 耐用性試驗(yàn)

    正常方法與改變參數(shù)方法所得回收率之比應(yīng)在95.0%~105.0%之間。結(jié)果顯示方法發(fā)生微小變動(dòng)后主成分回收率在95.9%~100.9%(表5)。

    2.7 樣品檢測(cè)

    取3批豬凝血酶樣品(20161211、20170114、20170301)按1.4項(xiàng)進(jìn)行樣品處理,進(jìn)樣測(cè)定磷酸三丁酯殘留量,檢測(cè)結(jié)果分別為0.97、1.46和1.32 mg/ml,均小于方法的定量限(2.54 mg/ml),明顯低于《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版三部規(guī)定不高于10 mg/ml,磷酸三丁酯殘留量合格。

    3 討論

    本法所用樣品為每瓶豬凝血酶凍干粉加2.5 ml純化水溶解后所得溶液。因樣品處理步驟較多、用量較大易導(dǎo)致?lián)]發(fā)損失,從而引起較大誤差,因此將樣品取用量減至1.25 ml,同時(shí)將對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)的濃度減半,將高氯酸溶液、正己烷和純化水的體積相應(yīng)減半,使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。

    氣相色譜法已用于多種生物制品中磷酸三丁酯殘留量檢測(cè)[5-10]。在樣品處理過(guò)程中存在一定的乳化現(xiàn)象,且離心難以完全消除[5,8],為使樣品離心更完全,本法將樣品混勻后靜置10 min再進(jìn)行離心,有效降低了乳化可能導(dǎo)致對(duì)檢測(cè)的不利影響,提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    在樣品處理過(guò)程中,藥典方法[6]以及多項(xiàng)研究[5,9]均采用吸取上層正己烷,用氮吹儀吹掃濃縮再取樣檢測(cè)的方法,不僅過(guò)程繁瑣且過(guò)程難以控制。本研究將空氣流濃縮步驟省略,改為增加進(jìn)樣量直接進(jìn)樣,可簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟而不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)本法參考藥典方法并根據(jù)實(shí)際情況對(duì)色譜條件做了相應(yīng)調(diào)整,以得到更好的峰形和分離度。

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