“動(dòng)物組織中DNA的分離提取及含量測(cè)定”實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革

趙玉紅， 李 欣， 李小菊， 周 浩， 李登文， 石建黨， 張金紅， 趙立青

(南開大學(xué) 生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心， 天津 300071)

“動(dòng)物組織中DNA的分離提取及含量測(cè)定”實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革

趙玉紅， 李 欣， 李小菊， 周 浩， 李登文， 石建黨， 張金紅， 趙立青

(南開大學(xué) 生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心， 天津 300071)

對(duì)經(jīng)典生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目“動(dòng)物組織中DNA的分離提取及含量測(cè)定”實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改革。在傳統(tǒng)濃鹽法提取基因組DNA、二苯胺法檢測(cè)DNA含量的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，新增試劑盒方法提取DNA以及超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA兩大現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)內(nèi)容，對(duì)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)進(jìn)行拓展、升級(jí)。此外，針對(duì)實(shí)驗(yàn)中比色杯污染影響檢測(cè)結(jié)果精密度和準(zhǔn)確性的困擾難題，提出2種簡(jiǎn)便易行的清洗方法，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性和有效性。

實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革； DNA提?。?DNA檢測(cè)

DNA的分離提取是分子生物學(xué)研究最基礎(chǔ)的技術(shù)，DNA的提取質(zhì)量直接影響到PCR擴(kuò)增基因片段、限制性酶切分析以及基因測(cè)序等下游實(shí)驗(yàn)的成敗[1]?！皠?dòng)物組織中DNA的分離提取及含量測(cè)定”是目前國(guó)內(nèi)高校普遍開設(shè)的經(jīng)典生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，在保留原有濃鹽法提取基因組DNA、二苯胺法檢測(cè)DNA含量的基礎(chǔ)上，新增目前廣泛使用的商品化試劑盒進(jìn)行DNA的提取、采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。此外，針對(duì)實(shí)驗(yàn)中比色杯污染嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果精密度和準(zhǔn)確性的難題，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)探索，提出2種簡(jiǎn)便易行的清洗解決方法。

1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革

“動(dòng)物組織中DNA的分離提取及含量測(cè)定”實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)教學(xué)中存在幾大問題：

(1) 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目獨(dú)立開設(shè)，學(xué)生的思維僅局限于本實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)的掌握，缺少對(duì)相關(guān)知識(shí)聯(lián)系和技術(shù)整合的意識(shí)和能力；

(2) DNA提取及含量檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，而傳統(tǒng)教學(xué)中采用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、手段相對(duì)落后，學(xué)生的學(xué)習(xí)積極主動(dòng)性不高；

(3) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)多為“正結(jié)果”，學(xué)生缺少反思的“原動(dòng)力”，不利于學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題能力的培養(yǎng)；

(4) DNA與二苯胺反應(yīng)產(chǎn)生的藍(lán)色不易退色，極易造成比色皿的污染，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性，不利于學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出科學(xué)的分析。

這些問題嚴(yán)重影響了實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果，亟須改革。

1.1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的拓展、升級(jí)

(1) 基因組DNA的提取。分別采用濃鹽法(根據(jù)參考書《生物化學(xué)習(xí)題及實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[2])、試劑盒法(參照Solarbio動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒說明書)2種方法，提取動(dòng)物肝臟組織中的基因組DNA。

(2) DNA濃度檢測(cè)。①采用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)濃鹽法和試劑盒法2種提取方法獲得的DNA樣品濃度，計(jì)算DNA的提取率。此外，根據(jù)A260/A280的比值，還可以判斷提取DNA的純度。②利用二苯胺法檢測(cè)DNA含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算DNA的提取率。

1.2 比色杯清洗方法的改進(jìn)

DNA在酸性條件下加熱，可與二苯胺反應(yīng)生成一種藍(lán)色的復(fù)合物，595 nm波長(zhǎng)下具有強(qiáng)烈的吸收。在一定濃度范圍內(nèi)，所成顏色的深淺與DNA的量之間有線性關(guān)系，可采用比色法測(cè)定樣品中DNA的含量，這是目前許多高校本科生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中檢測(cè)DNA含量常用的經(jīng)典二苯胺法。但是，DNA與二苯胺產(chǎn)生的藍(lán)色不易退色，極易造成比色皿的污染，導(dǎo)致嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性，以及大大降低比色杯的重復(fù)利用率，給正常的實(shí)驗(yàn)教學(xué)帶來很大的困擾。為有效解決DNA與二苯胺反應(yīng)物所污染比色杯的清洗難題，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性和有效性，提出2種簡(jiǎn)便易行的清洗方法。

(1) 新使用比色杯的清洗。①盛放DNA與二苯胺反應(yīng)物的比色杯使用完畢后，立即清水沖洗；②放在盛有雙氧水的器皿中浸泡至少1小時(shí)；③依次用清水、蒸餾水沖洗干凈，自然晾干。

(2) 已污染比色杯的清洗。①用雙氧水和氨水，以1∶1的比例，反復(fù)浸泡3～4次，浸泡時(shí)間以雙氧水和氨水反應(yīng)完畢為準(zhǔn)；②污染嚴(yán)重的，用雙氧水和氨水浸泡3～4次以后，用雙氧水浸泡3～4天，繼續(xù)用雙氧水和氨水(比例1∶1)浸泡至污染完全消逝；③依次用清水、蒸餾水沖洗干凈，自然晾干。

2 教學(xué)改革探討

2.1 合理構(gòu)建實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

雖然濃鹽法提取DNA技術(shù)手段上相對(duì)傳統(tǒng)，而二苯胺法檢測(cè)DNA含量靈敏度不高，兩者目前在科研實(shí)踐中都應(yīng)用較少，但是建議保留這2部分傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，理由如下：

(1) 試劑盒法提取DNA雖然簡(jiǎn)便、快速，提取的DNA純度高、應(yīng)用廣泛，但是就實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果而言，有待商榷。因?yàn)槭軐＠Ｗo(hù)等因素，試劑盒中的許多試劑僅以溶液A、溶液B、漂洗液、洗脫液等字眼來標(biāo)記，并不給出每種試劑的具體成分。對(duì)于學(xué)生來講，試劑盒方法對(duì)于實(shí)驗(yàn)原理、研究思路的掌握收效甚微，即使教師指出每種溶液可能的成分及其作用，但是在具體實(shí)驗(yàn)過程中學(xué)生關(guān)注的重點(diǎn)更多的是操作，不利于學(xué)生對(duì)原理知識(shí)以及研究思路的掌握。而濃鹽法提取DNA對(duì)于學(xué)生掌握DNA提取的基本原理和基本研究思路非常有“教科書”意義，因此很有必要保留這一經(jīng)典、傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容。

(2) 二苯胺法檢測(cè)DNA含量的實(shí)質(zhì)是利用了標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，而標(biāo)準(zhǔn)曲線法是一種簡(jiǎn)便、快速的定量分析方法。很多生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中均需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]，譬如酶聯(lián)免疫法檢測(cè)黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合分析[4]、CYP4F2和β—action基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建[5]、構(gòu)建cRNA為標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測(cè)柑橘碎葉病毒的方法[6]、柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定狗尾草種子氨基酸含量[7]等都是標(biāo)準(zhǔn)曲線法在生命科學(xué)研究中的具體應(yīng)用。因此有必要保留二苯胺法檢測(cè)DNA含量的實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生熟練掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線法這一重要的基本科研方法。

考慮到基礎(chǔ)課的課時(shí)限制并結(jié)合實(shí)驗(yàn)課目標(biāo)，可以在保留原有濃鹽法提取基因組DNA、二苯胺法檢測(cè)DNA含量的基礎(chǔ)上，新增目前廣泛使用的商品化試劑盒進(jìn)行DNA的提取，采用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，這是對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行創(chuàng)新改革的最佳方案。

改革后的實(shí)驗(yàn)教學(xué)體現(xiàn)學(xué)科發(fā)展前沿，內(nèi)容更為豐富，涉及的實(shí)驗(yàn)技能更多。學(xué)生通過課程學(xué)習(xí)，能夠深入理解、掌握并運(yùn)用DNA提取及含量測(cè)定的相關(guān)理論和技術(shù)，能夠分析和處理實(shí)際問題[8]。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析是科研工作中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，但許多學(xué)生往往重結(jié)果而輕分析，通常，數(shù)據(jù)不好就羅列出一系列可能的操作失誤，至于哪一個(gè)起決定性作用、是如何影響數(shù)據(jù)結(jié)果的、理論上為何如此，一概不想[9]。為加強(qiáng)學(xué)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析能力培養(yǎng)，鍛煉學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出更有針對(duì)性地、深入地分析討論，充分利用改革后的實(shí)驗(yàn)教學(xué)優(yōu)勢(shì)進(jìn)行適當(dāng)引導(dǎo)，要求學(xué)生在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中包含、體現(xiàn)以下2大實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析的內(nèi)容：

(1) 濃鹽法和試劑盒法2種方法提取的基因組DNA效果比較。設(shè)計(jì)表格見表1(空白表)，對(duì)濃鹽法和試劑盒法2種方法提取的基因組DNA效果進(jìn)行比較，并總結(jié)2種提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

表1 濃鹽法和試劑盒法2種方法提取的基因組DNA效果比較

(2) 超微量分光光度計(jì)和二苯胺法檢測(cè)DNA質(zhì)量的效果比較。設(shè)計(jì)幾個(gè)問題：超微量分光光度計(jì)和二苯胺法檢測(cè)DNA含量的結(jié)果是否一致？導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不一致的因素可能有哪些？2種檢測(cè)方法各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？影響DNA提取質(zhì)量的因素有哪些？如何對(duì)DNA進(jìn)行純度鑒定？

2.3 課程組織

(1) 尊重和滿足不同學(xué)生的學(xué)習(xí)需求，新增內(nèi)容為選修部分。學(xué)生可自主選擇做，還是不做，選擇結(jié)果提前2周告知教師，方便實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。

(2) 按照教學(xué)計(jì)劃，本實(shí)驗(yàn)為8學(xué)時(shí)。為了在盡量不增加課時(shí)的情況下實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的拓展，采取了充分利用實(shí)驗(yàn)間隙穿插進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的策略。首先采用試劑盒方法提取基因組DNA，在用酶消化的近2 h里，用濃鹽法進(jìn)行DNA的制備，此后由學(xué)生按照進(jìn)度來自主安排實(shí)驗(yàn)；其次DNA提取完畢后，學(xué)生先用二苯胺法檢測(cè)濃鹽法提取的DNA含量，再用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)2種方法提取的DNA濃度和純度。

3 改革成效

相比于傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，改革后的實(shí)驗(yàn)教學(xué)取得了良好的教學(xué)效果。

3.1 引入對(duì)比教學(xué)法，提高教學(xué)效果

(1) 將濃鹽法與試劑盒法2種方法提取的基因組DNA效果以及二苯胺法與超微量分光光度法2種方法測(cè)得的DNA數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)和比較，要得到科學(xué)、可靠的結(jié)論需要學(xué)生查閱數(shù)量不少的相關(guān)文獻(xiàn)資料，有利于引導(dǎo)學(xué)生跳出課本思維，促進(jìn)學(xué)生多角度、深入地思考問題，并有助于培養(yǎng)學(xué)生在不同知識(shí)的關(guān)聯(lián)和比較中發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力。

(2) 不同物種、不同材料的DNA提取方法不一樣[10]，通過對(duì)比學(xué)習(xí)，學(xué)生對(duì)于實(shí)驗(yàn)原理掌握得更為透徹，對(duì)于不同提取方法提取的DNA濃度、純度、穩(wěn)定性及其影響因素等方面有了更為清晰的認(rèn)識(shí)，并形成舉一反三、融會(huì)貫通的科學(xué)思維方式，為今后從事科研工作奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

(3)以往實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，學(xué)生只要按部就班，操作上即使不是非常規(guī)范也會(huì)得到“正結(jié)果”。而改革后，通過對(duì)2種提取方法所得結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，學(xué)生會(huì)深刻意識(shí)到規(guī)范操作是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素之一，進(jìn)而樹立進(jìn)一步規(guī)范操作的意識(shí)。

3.2 教學(xué)聯(lián)系科研，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣

以往DNA提取結(jié)束后，即用二苯胺法檢測(cè)DNA含量，實(shí)驗(yàn)相對(duì)孤立，學(xué)生大多認(rèn)為只要提取到DNA即可，至于提取的純度和濃度如何無關(guān)緊要，因而實(shí)驗(yàn)的積極性不是很高。但是改革后，利用超微量分光光度計(jì)，不僅可以檢測(cè)DNA含量，還可以鑒定DNA的純度，一個(gè)相對(duì)孤立的實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化成了生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)之間的銜接橋梁。DNA的提取質(zhì)量對(duì)于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有重要影響[7，11-12]，學(xué)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不再是微不足道，而是變得非常有意義，這大大激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情。此外，改革后采用了試劑盒、超微量分光光度計(jì)等與科研實(shí)際接軌的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、手段，學(xué)生參與的興趣明顯提高。

3.3拓展和延伸內(nèi)容單薄、孤立的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

改革后的實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有更多的“點(diǎn)”，譬如：①濃鹽法和試劑盒法提取DNA的原理各是什么？分別有什么優(yōu)缺點(diǎn)？②二苯胺法和超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量的結(jié)果是否一致？導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不一致的因素可能有哪些？2種檢測(cè)方法各有什么優(yōu)劣？③2種提取方法中，影響DNA提取純度的因素各有哪些？學(xué)生通過對(duì)這些“點(diǎn)”進(jìn)行剖析，對(duì)“點(diǎn)-點(diǎn)”間的相關(guān)知識(shí)進(jìn)行整合、類比和歸納，利于以點(diǎn)帶面構(gòu)建起豐富的知識(shí)體系。

3.4 比色杯清洗

對(duì)比色杯，尤其是已污染比色杯的清洗(見圖1)，有效解決了因DNA與二苯胺反應(yīng)物污染所造成的測(cè)量誤差，提高了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性、有效性，有助于學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的合理性進(jìn)行分析，提高教學(xué)效果。

圖1 已污染比色杯的清洗

4 結(jié)語

“動(dòng)物組織中DNA的分離提取及含量測(cè)定”實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革，在生物伯苓班小班授課中已成功運(yùn)行2輪，教學(xué)效果良好，目前正在向普通班推廣實(shí)施。改革后的實(shí)驗(yàn)教學(xué)優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在：(1) 理論聯(lián)系實(shí)際，有利于學(xué)生加深理論知識(shí)的理解和學(xué)以致用；

(2) 引入生物化學(xué)新技術(shù)、新方法，有利于學(xué)生了解學(xué)科前沿；

(3) 以人為本，尊重和滿足不同學(xué)生的學(xué)習(xí)需求。

改革后的實(shí)驗(yàn)課整體教學(xué)水平得到顯著提升，更有利于學(xué)生科研能力和綜合素養(yǎng)的培養(yǎng)。

References)

[1] 王丹，鄧春青，趙龍鳳.兩種外周血 DNA提取方法的比較[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，15(6):1138-1140.

[2] 于自然，黃熙泰，李翠風(fēng).生物化學(xué)習(xí)題及實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2003:258-261.

[3] 趙永攀，石磊，李晉,等.CYP4F2 和 β-actin 基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建[J].2016，26(1):98-100.

[4] 劉科宏，宋震，李中安,等.構(gòu)建cRNA為標(biāo)準(zhǔn)曲線定量檢測(cè)柑橘碎葉病毒的方法[G]//中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2012年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集.2012:240-243.

[5] 趙巖，唐國(guó)勝，侯瑩瑩,等. 柱前衍生RP-HPLC法測(cè)定狗尾草種子氨基酸含量[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)：2015，43(9):185-189.

[6] 李莉，張英，李占軍,等.將克隆豬先進(jìn)技術(shù)應(yīng)用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2014，33(10):222-224.

[7] 鮑毅新，孫波，張龍龍.對(duì)動(dòng)物組織DNA提取方法的改進(jìn)及PCR檢測(cè)[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，32(3):317-321.

[8] 蔡峰，薛安家，黃植.安全工程專業(yè)本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革與實(shí)踐[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2015，32(10):171-174.

[9] 郭婷，孟濤，方伊,等.理論 實(shí)踐與科研三位一體物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2015，34(5):138-140.

[10] 徐宗昌，王萌，孔英珍.煙草堿法提取基因組 DNA 的改進(jìn)[J].生物技術(shù)通報(bào)，2017，33(2):59-65.

[11] 呂曉巖，肖苒.一種提取全血基因組DNA的改良方法[J].生物技術(shù)通訊，2015，26(6)：852-853.

[12] 田春艷，李富生，何麗蓮,等.割手密葉綠體DNA的高效提取方法[J].分子植物育種，2016,14(1):86-91.

Experimental teaching reform on “Isolation, Extraction and Content Determination of DNA in Animal Tissues”

Zhao Yuhong, Li Xin, Li Xiaoju, Zhou Hao, Li Dengwen, Shi Jiandang, Zhang Jinhong, Zhao Liqing

(Biological Experimental Teaching Center， Nankai University， Tianjin 300071， China)

The reform is carried out on the classical biochemical experiment, i.e., Isolation, Extraction and Content Determination of DNA in Animal Tissues. On the basis of the traditional concentrated salt method of extracting genomic DNA and the diphenylamine method of detecting the DNA content, the two major modern experimental technical contents are newly added, i.e., the reagent kit method is used to extract DNA and the ultra micro spectrophotometer is used to detect DNA, which has expanded and upgraded the classical experiment. In addition, in view of the problem in the experiment that the colorimetric cup contamination affects the precision and accuracy of the detection results, two simple and convenient cleaning methods are put forward to improve the authenticity and validity of the experimental data.

experimental teaching reform; DNA extraction; DNA detection

10.16791/j.cnki.sjg.2017.11.053

Q5-33；G642.423

A

1002-4956(2017)11-0214-03

2017-04-11

國(guó)家基礎(chǔ)學(xué)科人才培養(yǎng)基金“條件建設(shè)項(xiàng)目”(J1310003)；南開大學(xué)2014年教學(xué)改革項(xiàng)目

趙玉紅(1981—)，女，山東青島，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作

E-mailzyh@mail.nankai.edu.cn

趙立青(1962—)，女，云南洱源，博士，教授，從事蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究以及基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的工程應(yīng)用.

E-maillqzhao@nankai.edu.cn