犬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備及免疫效果觀察

李 敏，朱盛和，暢翊然，胡敏華，莫梅君，吳玉婷，張博越，劉運忠，譚業(yè)平，郭霄峰*

(1. 廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司，廣州 511300；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；3. 廣州醫(yī)藥研究總院有限公司(國家犬類實驗動物種子中心)，廣州 510240；4江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所, 南京210014)

犬細(xì)小病毒滅活疫苗的制備及免疫效果觀察

李 敏1，朱盛和2，暢翊然2，胡敏華3，莫梅君2，吳玉婷2，張博越2，劉運忠3，譚業(yè)平4，郭霄峰2*

(1. 廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司，廣州 511300；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；3. 廣州醫(yī)藥研究總院有限公司(國家犬類實驗動物種子中心)，廣州 510240；4江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所, 南京210014)

以新分離的兩種不同亞型CPV為毒種制備濃縮滅活苗和未濃縮滅活苗，通過與商品化弱毒苗的比較評價滅活疫苗的免疫效果。將CPV-S5(New CPV-2a)與CPV-1401(New CPV-2b)毒株擴大培養(yǎng)后濃縮滅活，制備了兩種濃縮與兩種未濃縮水溶劑滅活疫苗；將滅活疫苗和商品化二聯(lián)弱毒苗分別接種5周齡HI陰性幼犬，分別在免疫后7 d、14 d、21 d、28 d測定HI抗體效價；首免36 d后取其中4只犬二免，其他犬進(jìn)行攻毒。結(jié)果顯示，各免疫組在第7天HI均高于1∶80，濃縮組顯著高于未濃縮組，初步表明CPV滅活苗效果與抗原的濃度有直接的關(guān)系；滅活疫苗組與商品化弱毒苗組均差異顯著；免疫組的犬均存活，而HI陰性犬死亡，經(jīng)檢測死亡犬CPV為陽性，表明制備的CPV滅活苗產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答均能抵抗強毒的攻擊，對犬起到良好的免疫保護(hù)；二免后其HI抗體效價極顯著提高，有效抗體能維持5個月，更有效的對免疫犬群進(jìn)行保護(hù)。

犬細(xì)小病毒；滅活疫苗；免疫效果；血球凝集抑制試驗

犬細(xì)小病毒性腸炎是由犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus, CPV)感染導(dǎo)致的呈世界分布的高度接觸性傳染病，主要引起犬急性出血性腸炎或新生犬急性心肌炎，呈現(xiàn)較高的發(fā)病率和死亡率，對養(yǎng)犬業(yè)和經(jīng)濟(jì)動物的養(yǎng)殖造成了巨大的損失[1-2]，而且對野生動物的生存構(gòu)成極大的威脅。目前，尚未發(fā)現(xiàn)非常有效的防治方法，平時主要依靠同源性疫苗，發(fā)病后以高免血清緊急治療[3]。CPV只有一個抗原型，即CPV-2，但是CPV存在抗原漂移，其后出現(xiàn)了在宿主范圍、血凝性和抗原性上都發(fā)生了變化的不同亞型CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)和CPV-2c(b)[4-6]。我國的主要流行毒株為CPV-2a亞型 ，而在南方地區(qū)也出現(xiàn)了CPV-2b毒株的流行[7]。

CPV疫苗預(yù)防該病起了積極的作用，由于基因工程疫苗研制周期較長且不能較強的針對正在流行的毒株，弱毒苗存在毒株突變與毒力返強風(fēng)險，而滅活疫苗安全性高且不存在散毒的風(fēng)險。目前市場主要還是以CPV-2為基礎(chǔ)來制作CPV疫苗，這導(dǎo)致國內(nèi)流行毒株與疫苗毒株不匹配。本研究所使用的病毒為新分離的CPV-S5和CPV-1401分別屬于New CPV-2a、New CPV-2b，代表國內(nèi)最新的進(jìn)化趨勢，以其為毒種制備的濃縮滅活疫苗對控制目前國內(nèi)CPV的流行有較大的針對性作用，通過濃縮滅活苗、未濃縮滅活苗及商品化弱毒苗之間的比較，望得到一種較低成本、持久、安全有效的疫苗來針對性的防控當(dāng)前國內(nèi)CPV的感染。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、毒株、商品化疫苗和實驗動物 F81 cell由本實驗室保存；CPV-S5[7]、CPV-1401[8]由本實驗室分離、鑒定和保藏；寵必威商品化二聯(lián)疫苗(犬細(xì)小弱毒和犬瘟熱弱毒二聯(lián)苗，批號A122B01)購買于寵物醫(yī)院；5周齡CPV HI 抗體陰性健康幼土犬，購自廣州郊區(qū)。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清為gibco產(chǎn)品；β-丙內(nèi)酯購于北京百靈威科技有限公司；佐劑MONTANIDE GEL 01為廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司研發(fā)部實驗室饋贈。

1.2 方法

1.2.1 病毒的濃縮 將在F81細(xì)胞上培養(yǎng)的CPV病毒液與20%PEG 8000/2.5 mol/L NaCl的比例為2∶1混合，4 ℃過夜(濃縮效果更好)，接著冰浴1 h。4 ℃ 11000 r/min離心30 min，去掉上清液，接著以原病毒液量的1/10的PBS緩沖液洗脫離心管底部的白色沉淀，對病毒液進(jìn)行10倍濃縮，將濃縮液收集于新的50 mL無菌離心管中，并用直徑為0.45 μm的濾膜過濾。測定濃縮病毒的HA效價，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒滴度的測定 在V型血凝板中參照《獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)》進(jìn)行[9]，實驗過程中使用新鮮配備的1%豬紅細(xì)胞懸液。

1.2.3 疫苗的制備及檢驗 參照葉蘋蘋的方法[8]和文獻(xiàn)報道[10]的同類疫苗的制備方法進(jìn)行病毒的滅活和疫苗的制備。按照β-丙內(nèi)脂∶病毒液 =1∶2000 的比例混合均勻，4 ℃滅活24 h，37 ℃水解2 h。取滅活后的病毒液，以終濃度為5%同步接種于 F81 細(xì)胞上，參照培養(yǎng)病毒方法進(jìn)行檢測，并連續(xù)盲傳代三次，于顯微鏡下觀察，以細(xì)胞是否發(fā)生病變?yōu)椴《緶缁畹臉?biāo)準(zhǔn)，同時設(shè)接種病毒液的陽性對照組和不加病毒液的空白對照組。參考Liu Xiaohui[11]的方法將佐劑MONTANIDE GEL 01和滅活病毒按 1∶9 比例混合，攪拌均勻，制成疫苗。然后進(jìn)行無菌檢驗。

1.2.4 CPV滅活苗免疫 將幼犬分為七組，其免疫程序見表1。按免疫程序皮下接種疫苗。免疫后第0、7、14、21、28天采血檢測HI抗體效價，觀察犬產(chǎn)生抗體水平及抗體消長規(guī)律。首免36 d后選取C組的4只犬進(jìn)行二免，免疫濃縮CPV-S5滅活苗+濃縮CPV-1401滅活苗，各1 mL。二免后第7天采血測HI抗體效價，以后每隔一個月采血測HI抗體效價，觀察犬抗體水平及抗體消長規(guī)律。

表1 免疫程序Tab 1 Immunization program

1.2.5 血清的處理和HI試驗 將血清56 ℃ 30 min滅活，然后取60 μL滅活血清、60 μL 0.2 mol/L pH 7.3 PBS與 120 μL 25%的高嶺土混勻(4倍稀釋)，置室溫20 min，其間振動搖勻2～3次使血清充分吸附，4 ℃ 3500 r/min離心10 min，取上清再加入豬紅細(xì)胞泥20 μL，充分搖勻但要避免發(fā)生溶血，置于37 ℃水浴30 min，其間搖動數(shù)次，4 ℃ 2400 r/min離心10 min，取上清待檢。根據(jù) HA結(jié)果配制4單位抗原，再參照《獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)》[9]測定血清中的HI效價。

1.2.6 攻毒 參照1.2.5結(jié)果，挑選上述1只HI陰性犬和免疫36 d后的19只犬，編號為1-20，其中1號犬為HI陰性犬，2-4號犬為免疫濃縮CPV-S5疫苗組，5號犬為免疫濃縮CPV-1401疫苗組，6號犬為免疫濃縮CPV-S5組+濃縮CPV-1401疫苗組，7、8、14、15號犬為免疫未濃縮CPV-1401疫苗組，9-13號犬為免疫未濃縮CPV-S5疫苗組，16-18號犬為免疫未濃縮CPV-S5組+未濃縮CPV-1401疫苗組，19、20號犬為免疫商品化疫苗組。以CPV-S5(2a)細(xì)胞培養(yǎng)液為攻毒液，其血凝效價為28，攻毒劑量為每只犬口腔2 mL/kg[12]，攻毒前斷水1 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的濃縮 結(jié)果見表2。

表2 濃縮病毒與未濃縮病毒的HATab 2 HA of concentrated virus andnon concentrated virus

培養(yǎng)的CPV-S5、CPV-1401通過PEG和高濃度鹽進(jìn)行10倍離心濃縮，其HA效價并沒有呈現(xiàn)10倍，而是約8倍。因為在離心濃縮過程中容易造成病毒損失，所以不能達(dá)到理論值。

2.2 疫苗檢驗 滅活檢驗中陽性對照細(xì)胞發(fā)生明顯的CPE，樣品及陰性細(xì)胞未見CPE，且盲傳三代后還是均無CPE，表明CPV滅活疫苗均滅活成功。樣品經(jīng)需氧及厭氧性、霉菌、腐生菌和真菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)均無細(xì)菌生長，表明滅活疫苗無菌檢驗合格。

2.3 抗體消長規(guī)律 免疫前對31只幼犬采血檢測HI，結(jié)果均為1∶20，表明所有幼犬免疫前抗CPV的HI抗體均為陰性。疫苗免疫犬7 d后，濃縮CPV-S5滅活苗組的HI抗體效價極顯著大于濃縮CPV-1401滅活疫苗組、未濃縮CPV-S5滅活苗組和未濃縮CPV-1401滅活疫苗組(Plt;0.01)；顯著大于未濃縮CPV-S5+未濃縮CPV-1401滅活苗組(Plt;0.05)；極顯著小于商品化弱毒疫苗(Plt;0.01)；與濃縮CPV-S5+濃縮CPV-1401滅活苗組無顯著性差異。濃縮CPV-1401滅活苗組顯著小于濃縮CPV-S5+濃縮CPV-1401滅活苗組(Plt;0.05)；極顯著小于商品化弱毒疫苗(Plt;0.01)；與其他組無顯著性差異。濃縮CPV-S5+濃縮CPV-1401滅活苗組顯著大于未濃縮CPV-S5滅活苗組和未濃縮CPV-1401滅活苗組(Plt;0.05)；顯著小于商品化弱毒苗(Plt;0.05)。未濃縮CPV-S5滅活苗組、未濃縮CPV-1401滅活苗組與未濃縮CPV-S5+未濃縮CPV-1401滅活苗組之間均無顯著性差異；未濃縮CPV-S5滅活苗組與未濃縮CPV-1401滅活苗組都極顯著小于商品化弱毒苗(Plt;0.01)；未濃縮CPV-S5+未濃縮CPV-1401滅活苗組顯著小于商品化弱毒苗(Plt;0.05)。見圖1。

圖1 免疫犬7 d HI抗體效價Fig 1 Antibody titer of HI 7 d in immunized dogs

疫苗免疫犬14 d HI抗體效價為濃縮CPV-S5滅活苗組、濃縮CPV-1401滅活苗組、濃縮CPV-S5+濃縮CPV-1401滅活苗組、未濃縮CPV-S5滅活苗組、未濃縮CPV-1401滅活苗組和未濃縮CPV-S5+未濃縮CPV-1401滅活苗組之間均無顯著性差異；但都極顯著小于商品化弱毒苗(Plt;0.01)。見圖2。

疫苗免疫犬21 d HI抗體效價為濃縮CPV-S5+濃縮CPV-1401滅活苗組極顯著大于未濃縮CPV-S5+未濃縮CPV-1401滅活苗組(Plt;0.01)；顯著大于濃縮CPV-1401滅活苗組、未濃縮CPV-S5滅活苗組和未濃縮CPV-1401滅活苗組(Plt;0.05)；顯著小于商品化弱毒苗(Plt;0.05)；與濃縮CPV-S5滅活苗組無顯著性差異。其他組之間均無顯著性差異，但均極顯著小于商品化弱毒苗(Plt;0.01)。見圖3。

圖2 免疫犬14 d HI抗體效價Fig 2 Antibody titer of HI 14 d in immunized dogs

圖3 免疫犬21 d HI抗體效價Fig 3 Antibody titer of HI 21 d in immunized dogs

疫苗免疫犬28 d HI抗體效價為濃縮CPV-S5滅活苗組、濃縮CPV-1401滅活苗組、濃縮CPV-S5+濃縮CPV-1401滅活苗組、未濃縮CPV-S5滅活苗組、未濃縮CPV-1401滅活苗組和未濃縮CPV-S5+未濃縮CPV-1401滅活苗組之間均無顯著性差異；但都極顯著小于商品化弱毒苗(Plt;0.01)。見圖4。

免疫犬HI抗體效價總情況為免疫組在第7天達(dá)到最高，而其HI抗體效價隨著時間的推移各組均呈現(xiàn)下降的趨勢，但是濃縮組滅活苗組HI抗體效價下降的趨勢要比未濃縮的滅活疫苗組要緩。在濃縮組中，濃縮CPV-S5+濃縮CPV-1401滅活苗組下降趨勢比濃縮CPV-S5滅活苗組和濃縮CPV-1401滅活苗組均要緩慢。見圖5。

圖4 免疫犬28 d HI抗體效價Fig 4 Antibody titer of HI 28 d in immunized dogs

圖5 免疫犬HI抗體效價Fig 5 Antibody titer of HI in immunized dogs

二免后7 d 的HI抗體效價迅速增長，HI平均值達(dá)到1∶2304；28 d的HI抗體效價有所下降，HI平均值為1∶768；56 d HI平均值為1∶469；84 d HI平均值為1∶448；120 d HI平均值為1∶104；二免后第2、3個月HI抗體效價基本上維持平穩(wěn)；第4個月HI抗體水平又下降，抗體水平能維持5個月。如圖6。

圖6 二免HI抗體效價Fig 6 Antibody titer of HI in second immunized dogs

2.4 CPV疫苗免疫效果 攻病毒后，其中5號、10號犬3 d左右出現(xiàn)厭食嘔吐現(xiàn)象，眼睛凹陷，精神較萎靡并伴有輕度腹瀉等臨床癥狀，但7 d左右犬漸漸恢復(fù)，最終耐過；而1號HI陰性犬第4d開始出現(xiàn)發(fā)燒、嘔吐、精神沉郁、厭食、拉黃色稀便等癥狀，第6天精神高度沉郁、站立不安、喜伏臥、排具有腥臭味番茄汁樣稀糞，第8天犬死亡，其他幼犬未見明顯臨床癥狀且全部存活。對病死犬進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)腸系膜被染黃、腹股溝淋巴結(jié)腫大、肝臟腫大出血；小腸一小段潰爛、腸壁出血。對病死犬腸內(nèi)容物進(jìn)行病毒的DNA提取及PCR的檢測，結(jié)果顯示CPV為陽性。根據(jù)臨床癥狀和病理解剖及實驗室PCR檢測結(jié)果可知，HI陰性犬為攻CPV強毒致死。表明滅活疫苗誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答能夠抵抗CPV強毒的攻擊。

3 討 論

CPV能引起犬較高的致病率和死亡率，且存在抗原漂浮性，導(dǎo)致防御難度加大了，因此根據(jù)CPV的流行和抗原特異性來制備相應(yīng)的滅活苗，針對性的預(yù)防目前國內(nèi)CPV的流行。本實驗室分離的CPV-S5與CPV-1401毒株分別屬于New CPV-2a、New CPV-2b，代表了國內(nèi)最新的進(jìn)化趨勢，以其為毒種研制的濃縮滅活苗對于當(dāng)前國內(nèi)CPV病的防控會有較大的針對性。疫苗接種犬后，結(jié)果顯示濃縮CPV-S5滅活苗與濃縮CPV-1401滅活苗以及未濃縮的兩種CPV滅活苗在相同的時間都能產(chǎn)生高于1∶80的抗體水平。據(jù)文獻(xiàn)報道，犬血清中HI抗體效價低于1∶80 時則可能會發(fā)生CPV的感染[13]。濃縮組的HI抗體水平要明顯高于未濃縮組的HI抗體水平，表明CPV滅活苗的免疫效果跟抗原的濃度有直接的關(guān)系。 CPV-S5滅活苗組與CPV-1401滅活苗疫苗組的免疫效果的總體趨勢一樣，可能與CPV只有一種血清型有關(guān)[6]。本研究試制的CPV滅活苗誘導(dǎo)的抗體水平均比商品化弱毒苗低，這也許由于商品化弱毒苗的活病毒在犬中大量繁殖，同一時間內(nèi)產(chǎn)生了更多的病毒抗原。免疫后攻毒試驗，HI陰性犬發(fā)病死亡，而免疫犬獲得很好的保護(hù)，與其他研究者的結(jié)果一致[12, 14]。因此，CPV滅活疫苗也能保護(hù)犬只免受強毒的攻擊。至于攻毒后部分犬出現(xiàn)隨糞便排毒現(xiàn)象，主要由于滅活苗不能有效的刺激犬的胃腸道產(chǎn)生足夠局部的抗體來清除病毒[15]。

一次免疫滅活苗的犬所產(chǎn)生的有效抗體(HI≥80)可持續(xù)一個月，如作加強免疫，短時間內(nèi)可達(dá)1∶2304，并且持續(xù)時間能夠維持約五個月。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，幼犬出生后約60日齡以滅活疫苗首免，半個月后進(jìn)行二免，之后每隔半年免疫一次，則其保護(hù)率為100%[16]。因此，好的疫苗也需要有合理的免疫程序。

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(編輯：李文平)

ImmuneEffectofCanineParvovirusInactivatedVaccine

LI Min1, ZHU Sheng-he2, CHANG Yi-ran2, HU Min-hua3, MO Mei-jun2, WU Yu-ting2, ZHANG Bo-yue2, LIU Yun-zhong3, TAN Ye-ping4,GUO Xiao-feng2*

(1.GuangzhouSouthChinaAgriculturalUniversityBiologicalPharmaceuticalCo.,Ltd.,Guangzhou511300,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,China;3.GuangzhouGeneralPharmaceuticalResearchInstituteCo.,Ltd.,(NationalSeedCenterofExperimentalDog),Guangzhou510240,China;4.InstituteofVeterinaryMedicine,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014,China)

GUOXiao-feng,E-mail:xfguo@scau.edu.cn

To evaluate the immune effect of inactivated vaccine prepared with two different subtypes canine parvovirus strains, and to observe the relationship between the CPV concentration and non-concentrated inactivated vaccine and commercial two attenuated vaccine. The CPV-S5(New cpv-2a)and CPV-1401(New cpv-2b)strains were cultured in cells, and then was concentrated and inactivated. Two kinds of inactivated vaccine were prepared, one with concentrated virus and another non-concentrated virus. The aqueous solvent inactivated vaccines and two commercial attenuated vaccine were inoculated to 5 weeks old hemagglutination inhibition (HI) negative puppies respectively. At 7 d, 14 d, 21 d and 28 d the blood was collected and HI antibody titer were determined post-immunization. At 36d after the first immune, another four dogs were boosted one time. The other dogs were challenged with the virulent CPV. The result showed the HI antibody of the immuned groups was higher than 1∶80 at 7 d, and concentrated virus group was significantly higher than non-concentrated virus group. The HI titers were significantly different during the groups with inactivated vaccine and commercial attenuated vaccine. The immuned dogs still lived until the end, but HI negative dogs died. CPV can be isolated from the dead dogs, which suggested that the specific immune response induced by the CPV inactivated vaccine could resist the virulent attack, and it had a good immune protection to the canines. After second immunization the HI antibody titer significantly increased and the effective antibody can last five months.

canine parvovirus; inactivated vaccine; immune effect; hemagglutination inhibition test

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.11.01

2017-05-02

A

1002-1280 (2017) 11-0001-08

S852.65

廣州市海珠區(qū)產(chǎn)學(xué)研重大專項(2014-CG-10)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20130705)

李 敏，獸醫(yī)師，從事動物用生物制品的生產(chǎn)和研發(fā)；朱盛和，碩士研究生，從事動物用生物制品的研發(fā), 為共同第一作者。

郭霄峰。E-mail: xfguo@scau.edu.cn