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    BHK-21細(xì)胞不同處理方式對裸鼠致瘤性的影響

    2017-11-27 05:40:53于義娟閔娟娟漆世華靖志強(qiáng)李晶梅廖園園舒銀輝謝紅玲
    中國獸藥雜志 2017年11期
    關(guān)鍵詞:凍融甲醛腫塊

    于義娟,秦 濤,閔娟娟,漆世華,靖志強(qiáng),付 婭,李晶梅,廖園園,舒銀輝,朱 薇,徐 松,謝紅玲

    (武漢中博生物股份有限公司,武漢 430070)

    BHK-21細(xì)胞不同處理方式對裸鼠致瘤性的影響

    于義娟,秦 濤,閔娟娟,漆世華,靖志強(qiáng),付 婭,李晶梅,廖園園,舒銀輝,朱 薇,徐 松,謝紅玲*

    (武漢中博生物股份有限公司,武漢 430070)

    為分析BHK-21細(xì)胞不同處理方式對裸鼠致瘤性的影響,分別用甲醛、二乙烯亞胺(BEI)、β-丙內(nèi)酯(BPL)進(jìn)行滅活和在-20 ℃進(jìn)行凍融處理的BHK-21細(xì)胞接種裸鼠,通過病理組織形態(tài)學(xué)觀察判定其是否存在致腫瘤的特性。結(jié)果顯示,甲醛、BEI、BPL、凍融2次或3次分別處理的BHK-21細(xì)胞接種裸鼠,對裸鼠致瘤率為零。凍融1次的BHK-21細(xì)胞和107、105和103個BHK-21細(xì)胞分別接種裸鼠,致瘤率為100%。10個BHK-21細(xì)胞接種裸鼠,未見成瘤。試驗表明,裸鼠檢測BHK-21細(xì)胞致瘤性敏感性為103個細(xì)胞;凍融2次、甲醛、BEI、BPL處理,BHK-21細(xì)胞均喪失致瘤性;凍融1次不能使BHK-21細(xì)胞喪失致瘤性。

    BHK-21細(xì)胞;裸鼠;致瘤性

    BHK-21細(xì)胞為地鼠腎傳代細(xì)胞系,具有致瘤性,其完整活細(xì)胞具有較高的致癌、致瘤性,不能用于活疫苗的制備[1]。BHK-21細(xì)胞滅活后不具有致瘤性,是世界衛(wèi)生組織推薦的生產(chǎn)獸用疫苗細(xì)胞,現(xiàn)已在規(guī)模化生產(chǎn)中應(yīng)用,主要用于口蹄疫滅活疫苗的生產(chǎn)[2]。本研究以《中國獸藥典》所載的致瘤性檢驗方法,對滅活劑、凍融處理的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行檢驗,從中選擇能夠使BHK-21細(xì)胞喪失致瘤性的處理方法,用于獸用生物制品的研發(fā)和生產(chǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動物 BALB/c-nu/nu裸鼠,雌性,4~6周齡,購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

    1.1.2 飼料 裸鼠料,購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

    1.1.3 細(xì)胞 BHK-21細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞系(HELA)細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF),均由武漢中博生物股份有限公司技術(shù)中心提供。

    1.1.4 試劑 2-溴乙胺氫溴酸鹽(BEA)、甲醛、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、氫氧化鈉(NaOH)均為國產(chǎn)分析純。取0.4 mol/L的BEA和0.4 mol/L的NaOH等體積混合,37 ℃孵育1 h制成0.2 mol/L的二乙烯亞胺(BEI)。DMEM培養(yǎng)液為HYCLONE公司產(chǎn)品。

    1.1.5 儀器 S8智能型獨立通氣籠IVC(蘇州市蘇杭科技器材有限公司)、LEICA RM2235石蠟切片機(jī)、JK-6 生物組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)、水浴鍋、離心機(jī)、超凈臺、冰箱、電磁爐。

    1.1.6 分組 將裸鼠分為13組,每組10只,見表1。

    表1 試驗動物分組Tab 1 Experimental animal grouping

    1.2 方法

    1.2.1 各組接種物的制備

    1.2.1.1 細(xì)胞懸液的制備 取懸浮培養(yǎng)的對數(shù)生長期的BHK-21細(xì)胞,1000 r/min離心8 min,棄上清,用DMEM培養(yǎng)液重懸稀釋細(xì)胞,使細(xì)胞濃度為107/0.5 mL、105/0.5 mL、103/0.5 mL、10/0.5 mL。

    1.2.1.2 甲醛滅活組細(xì)胞的制備 取107/0.5 mL的BHK-21細(xì)胞,加入甲醛溶液使終濃度為0.1%,37 ℃滅活72 h。

    1.2.1.3 BEI滅活組細(xì)胞的制備 取107/0.5 mL的BHK-21細(xì)胞,加入BEI溶液使終濃度為0.005 mol/L,37 ℃滅活48 h,加入硫代硫酸鈉(Na2S2O3)溶液使終濃度為0.005 mol/L。

    1.2.1.4 BPL滅活組細(xì)胞的制備 取107/0.5 mL的BHK-21細(xì)胞,按1/4000比例加入BPL,2~8 ℃滅活24 h,37 ℃水解2 h。

    1.2.1.5 凍融組細(xì)胞的制備 取107/0.5 mL的BHK-21細(xì)胞,-20 ℃分別凍融1次、2次和3次。

    1.2.1.6 HELA細(xì)胞和CEF細(xì)胞懸液制備 分別取靜置培養(yǎng)的對數(shù)生長期的HELA細(xì)胞和CEF細(xì)胞,胰酶溶液消化使細(xì)胞分散,離心收集細(xì)胞,DMEM培養(yǎng)液重懸,使細(xì)胞濃度為106/0.5 mL。

    1.2.1.7 陰性對照2組細(xì)胞的制備 取107/0.5 mL的BHK-21細(xì)胞,置于沸水中煮10 min。

    1.2.2 裸鼠接種與觀察測量

    1.2.2.1 裸鼠接種 按表1選擇接種物。在裸鼠頸背部和背部前1/3處,皮下注射,0.5 mL/只。

    1.2.2.2 試驗觀察 觀察14 d,檢查有無結(jié)節(jié)或腫瘤形成。如果有結(jié)節(jié)或可疑病灶,繼續(xù)觀察至少1周,解剖,進(jìn)行病理組織學(xué)檢查,檢查內(nèi)臟器官(心、肝、脾、肺、腎、腦)有無異常病變。對未發(fā)生結(jié)節(jié)的動物,取其中半數(shù),觀察21d,對另外半數(shù)動物觀察12周,對接種部位進(jìn)行解剖和病理學(xué)檢查,觀察各淋巴結(jié)和各器官中有無結(jié)節(jié)形成,如果可疑,進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。陽性對照組和陰性對照組觀察21 d[3-4]。

    1.2.2.3 腫瘤組織切片制備和病理形態(tài)學(xué)觀察 斷頸處死裸鼠,取出裸鼠皮下腫瘤結(jié)節(jié),用中性福爾馬林作常規(guī)組織固定,制備石蠟包埋切片,HE染色,顯微鏡下觀察。

    1.2.2.4 判定標(biāo)準(zhǔn) 在陽性對照組裸鼠成瘤率為100%,陰性對照組裸鼠成瘤率為零時,實驗成立。實驗組裸鼠無腫物生長或者雖有隆突狀腫物生長但卻是非腫瘤的,接種物無致瘤性;若有隆突狀腫物生長,經(jīng)病理形態(tài)學(xué)觀察證實為腫瘤的,接種物有致瘤性。

    2 結(jié) 果

    記錄各實驗組裸鼠精神、飲食、排便、接種部位腫塊情況,并對成瘤情況進(jìn)行統(tǒng)計,見表2。

    表2 試驗各組成瘤數(shù)統(tǒng)計Tab 2 Tumor formation statistics for all groups

    2.1 陰、陽性對照組 CEF細(xì)胞接種后觀察21 d,裸鼠均未見腫塊,精神良好,飲食、排便正常(圖1)。煮沸10 min的BHK-21細(xì)胞接種裸鼠,均未出現(xiàn)腫塊,且精神、飲食、排便均沒出現(xiàn)異常表現(xiàn)。接種后21 d剖檢5只裸鼠,接種后12周剖檢5只裸鼠,觀察各淋巴結(jié)和各器官,均無結(jié)節(jié)形成(圖2)。HELA細(xì)胞接種后一周,裸鼠接種部位有腫塊形成,腫塊直徑8 mm左右,具有腫瘤的病理形態(tài)(圖3)。107個BHK-21細(xì)胞接種裸鼠,接種后一周接種部位有腫塊形成,腫塊數(shù)量3個以上,且在背部后方皮下也有腫塊形成。腫塊直徑10~20 mm,腫塊質(zhì)地較軟,含血量豐富,具有腫瘤的病理形態(tài)。所有裸鼠接種12~14 d全部死亡(圖4)。

    2.2 凍融組 凍融1組裸鼠在接種后第2周陸續(xù)出現(xiàn)腫塊,腫塊1到2個,腫塊直徑8 mm左右,具有腫瘤的病理形態(tài),部分腫瘤組織表皮出現(xiàn)破潰,剖檢腫塊含血量較高,質(zhì)地較軟(圖5)。凍融2組均未出現(xiàn)腫塊,且精神、飲食、排便均沒出現(xiàn)異常表現(xiàn)。接種后21 d剖檢5只裸鼠,接種后12周剖檢5只裸鼠,觀察各淋巴結(jié)和各器官,均無結(jié)節(jié)形成(圖6)。凍融3組裸鼠均未出現(xiàn)腫塊,且精神、飲食、排便均沒出現(xiàn)異常表現(xiàn)。接種后21 d剖檢5只裸鼠,接種后12周剖檢5只裸鼠,觀察各淋巴結(jié)和各器官,均無結(jié)節(jié)形成(圖7)。

    2.3 滅活劑處理組 甲醛組:1周內(nèi)有4只裸鼠接種部位有腫塊形成,2周腫塊消失,21 d剖檢,經(jīng)病理形態(tài)學(xué)檢查,無腫瘤組織。另6只裸鼠沒有出現(xiàn)腫塊,且精神、飲食、排便均沒出現(xiàn)異常表現(xiàn),21 d剖檢3只裸鼠,12周剖檢3只裸鼠,觀察各淋巴結(jié)和各器官,均無結(jié)節(jié)形成(圖8)。BEI、BPL組:裸鼠均未出現(xiàn)腫塊,且精神、飲食、排便均沒出現(xiàn)異常表現(xiàn)。BEI、BPL組接種后21 d分別剖檢5只裸鼠,接種后12周分別剖檢5只裸鼠,觀察各淋巴結(jié)和各器官,均無結(jié)節(jié)形成(圖9、圖10)。

    2.4 梯度組 梯度1組:接種后一周接種部位有腫塊形成,腫塊數(shù)量2個以上,且在背部后方皮下也有腫塊形成。腫塊直徑8~16 mm,腫塊質(zhì)地較軟,含血量豐富,具有腫瘤的病理形態(tài),觀察期內(nèi)沒有死亡(圖11)。梯度2組:接種后一周均未出現(xiàn)腫塊,在接種后2周有8只裸鼠接種部位有腫塊形成,在接種3周有2只裸鼠接種部位有腫塊形成,腫塊直徑在4 mm左右,具有腫瘤的病理形態(tài)(圖12)。梯度3組:裸鼠均未出現(xiàn)腫塊,精神、飲食、排便均沒出現(xiàn)異常表現(xiàn)。接種后21 d剖檢5只裸鼠,接種后12周剖檢5只裸鼠,觀察各淋巴結(jié)和各器官,均無結(jié)節(jié)形成(圖13)。

    圖1 陰性對照1組裸鼠Fig 1 Negative control group 1

    圖2 陰性對照2組裸鼠Fig 2 Negative control group 2

    圖3 陽性對照1組裸鼠Fig 3 Positive control group 1

    圖4 陽性對照2組裸鼠Fig 4 Positive control group 2

    圖5 凍融1組裸鼠Fig 5 Freezing-thawing group 1

    圖6 凍融2組裸鼠Fig 6 Freezing-thawing group 2

    圖7 凍融3組裸鼠Fig 7 Freezing-thawing group 3

    圖8 甲醛組裸鼠Fig 8 Formaldehyde treatment group

    圖9 BEI組裸鼠Fig 9 BEI treatment group

    圖10 BPL組裸鼠Fig 10 BPL treatment group

    圖11 梯度1組裸鼠Fig 11 Gradient group 1

    圖12 梯度2組裸鼠Fig 12 Gradient group 2

    圖13 梯度3組裸鼠Fig 13 Gradient group 3

    2.5 HELA細(xì)胞致瘤裸鼠腫瘤病理學(xué)觀察 采集裸鼠皮下腫瘤結(jié)節(jié),進(jìn)行組織切片制備和病理形態(tài)學(xué)觀察。細(xì)胞排列紊亂,失去正常的排列層次,細(xì)胞大小不一(圖14)。有些細(xì)胞體積偏大,細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的比例增大,細(xì)胞核形態(tài)大小不一,染色質(zhì)粗糙,出現(xiàn)病理性核分裂象(圖15)。

    圖14 HELA細(xì)胞致瘤 HE 200×Fig 14 Tumor caused by Hela cells HE 200×

    →:病理性核分裂相→:Pathological mitotic phase圖15 HELA細(xì)胞致瘤 HE 400×Fig 15 Tumor caused by Hela cells HE 400×

    2.6 BHK-21細(xì)胞致瘤裸鼠腫瘤病理學(xué)觀察 采集各腫塊,制備石蠟包埋切片,HE染色,顯微鏡下觀察,結(jié)果見圖16、圖17。

    圖16 BHK-21細(xì)胞致瘤 HE 200×Fig 16 Tumor caused by BHK-21 cells HE 200×

    →:病理性核分裂相→:Pathological mitotic phase圖17 BHK-21細(xì)胞致瘤 HE 400×Fig 17 Tumor caused by BHK-21 cells HE 400×

    結(jié)果顯示,腫塊大部分區(qū)域為壞死的腫瘤組織,腫瘤細(xì)胞如橫紋肌母細(xì)胞樣彌漫分布,可見病理性核分裂象。

    3 討 論

    本試驗中使用的甲醛、BPL、BEI屬于化學(xué)滅活劑。化學(xué)滅活的優(yōu)點是效果確實、方法簡便。甲醛滅活的作用機(jī)制是破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)。甲醛滅活時首先與含氨基的核苷酸堿基(如A、G、U)結(jié)合而使核酸變性。使用較高濃度的甲醛和較長時間的作用時間,甲醛可與蛋白質(zhì)的胺基結(jié)合,形成羥甲基衍生物或二羥甲基衍生物,后者再與酰胺發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。微生物的蛋白質(zhì)發(fā)生變性,阻止其核酸逸出[5-6]。甲醛滅活存在較多的缺陷,包括刺激性大、致癌危險、破壞免疫原性、滅活時間長、滅活效果受多種因素影響等[7]。BPL滅活的作用機(jī)制是作用于微生物的DNA或RNA,通過與核酸的嘌呤堿基(主要是G)反應(yīng)破壞核酸的結(jié)構(gòu),但不直接作用于蛋白質(zhì),因此能保持良好的免疫原性。大劑量BPL是一種潛在致癌物,但是BPL極易水解,在37 ℃水浴水解2 h后消失,其水解為無毒性的人體脂肪代謝產(chǎn)物β-羥基丙酸。BPL滅活的另一優(yōu)勢是滅活所需時間短,能顯著縮短疫苗生產(chǎn)周期[5]。BEI滅活的作用機(jī)制是烷化微生物DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤,引起單鏈斷裂、雙螺旋鏈交聯(lián)及干擾酶系統(tǒng)和核蛋白作用,破壞核酸代謝、合成,導(dǎo)致微生物核酸芯破壞。BEI破壞微生物核酸,不作用于蛋白質(zhì),能較好的保持抗原的免疫原性[5]。本試驗中使用凍融處理BHK-21細(xì)胞。凍融是一種破碎細(xì)胞的方法,作用機(jī)理是突然冷凍時細(xì)胞內(nèi)形成冰晶,細(xì)胞內(nèi)外溶劑濃度突然改變致使細(xì)胞破碎[8]。

    本試驗用裸鼠檢測細(xì)胞致瘤性,裸鼠胸腺先天性缺陷,T淋巴細(xì)胞缺損,適于免疫生物學(xué)、免疫病理學(xué)、移植免疫等研究,是生物制品傳代細(xì)胞致瘤試驗的最好動物模型[9]。裸鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞,可導(dǎo)致其產(chǎn)生腫瘤或組織癌變,且保持原發(fā)瘤的組織學(xué)形態(tài)、免疫學(xué)特點及其特有的染色體組型[10]。

    細(xì)胞染色體遺傳特征決定致瘤性質(zhì)并具有種屬特異性,不同核型細(xì)胞致瘤性不同[11-12]。對BHK-21細(xì)胞系KA株、M株、YA株的染色體組型與遺傳變異率分析,研究發(fā)現(xiàn)BHK-21細(xì)胞皮下接種裸鼠均產(chǎn)生進(jìn)行性生長的惡性腫瘤,且不論核型如何始終具有強(qiáng)的致癌性[12]。染色體數(shù)目變異越大,染色體眾數(shù)越多、范圍越寬,染色體條數(shù)越多,致瘤性越強(qiáng)??赡苁且驗椤皟?yōu)勝劣汰”作用導(dǎo)致染色體數(shù)目變異較小細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖處于劣勢或被淘汰,相反染色體數(shù)目變異較大細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)增殖處于優(yōu)勢而明顯增多[13-14]。李六金等學(xué)者研究BHK-21細(xì)胞致瘤性,結(jié)果顯示108BHK-21細(xì)胞和107BHK-21細(xì)胞不論是低代次還是高代次的腫塊形成率和致瘤率均為100%,且代次之間差異不顯著。正常BHK-21細(xì)胞經(jīng)快速裂解后仍具有致瘤性[1]。

    本試驗用裸鼠檢測BHK-21細(xì)胞致瘤性,結(jié)果顯示,103個BHK-21細(xì)胞接種裸鼠引發(fā)腫瘤;10個BHK-21接種裸鼠觀察期內(nèi)未見腫瘤。本試驗結(jié)果表明,BHK-21細(xì)胞的數(shù)量及密度對裸鼠的致瘤性有明顯影響,裸鼠檢測BHK-21細(xì)胞致瘤性敏感性為103個細(xì)胞。

    本試驗對BHK-21細(xì)胞進(jìn)行-20 ℃凍融1次處理后,進(jìn)行裸鼠致瘤性試驗觀察。結(jié)果顯示皮下接種裸鼠引發(fā)腫瘤,且重復(fù)性穩(wěn)定,這和李六金等學(xué)者的正常BHK-21細(xì)胞經(jīng)快速裂解后仍具有致瘤性的結(jié)論相符。

    本試驗對BHK-21細(xì)胞分別進(jìn)行甲醛37 ℃滅活72 h、BEI 37 ℃滅活48 h、BPL 4 ℃滅活24 h、-20 ℃凍融2次或3次處理后,進(jìn)行裸鼠致瘤性試驗觀察。結(jié)果顯示,甲醛、BEI、BPL、-20 ℃凍融2次或3次后,皮下接種裸鼠均不引發(fā)腫瘤。結(jié)果表明,獸用滅活疫苗若以BHK-21細(xì)胞作為病毒增殖載體收獲的抗原液,經(jīng)2次凍融處理或0.1%甲醛或0.005 mol/L的BEI或1/4000的BPL進(jìn)行滅活,均能使BHK-21細(xì)胞喪失致瘤性。

    綜上所述, BHK-21細(xì)胞經(jīng)滅活和凍融處理可喪失對裸鼠的致瘤性,其結(jié)果可以作為判定BHK-21細(xì)胞是否適用于獸用滅活疫苗抗原生產(chǎn)的參考依據(jù)。

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    [13] 張德禮,黃高升,李六金,等. 惡性橫紋肌樣瘤MRT的起源研究-高變異率細(xì)胞系致裸鼠產(chǎn)生MRT的實驗研究[C]//2000年中國博士后學(xué)術(shù)大會論文集:醫(yī)藥學(xué)與生物學(xué)分冊,2000: 573-582.

    Zhang D L, Huang G S, Li L J,etal. Study on the origin of the malignant striated muscle tumor (MRT )-the experimental research on the MRT Caused by high mutation rate cell lines in nude mice[C]// Proceedings of Chinese post-doctoral academic conference in 2000: the archies of medicine and biology, 2000: 573-582.

    [14] 張德禮,黃高升,李六金,等. 惡性橫紋肌樣瘤(MRT)的起源研究-高變異率HELA細(xì)胞致裸鼠產(chǎn)生MRT的實驗研究[J]. 遺傳學(xué)報,2000,27(12):1057-1071.

    Zhang D L, Huang G S, Li L J,etal. Study on the origin of the malignant striated muscle tumor (MRT )-the experimental research on the MRT caused by high mutation rate cell lines in nude mice.[J]. Acta Genitica Sinica, 2000, 27(12): 1057-1071.

    (編輯:李文平)

    EffectsofDifferentTreatmentsofBHK-21CellsonTumorigenicityinNudeMice

    YU Yi-juan, QIN Tao, MIN Juan-juan, QI Shi-hua, JING Zhi-qiang, FU Ya, LI Jing-mei,
    LIAO Yuan-yuan, SHU Yin-hui, ZHU Wei, XU Song, XIE Hong-ling*

    (WuhanChopperBiologyCo.,Ltd,Wuhan430070,China)

    XIEHong-ling,E-mail: 13419546263@163.com

    For understanding the tumorigenicity of BHK-21 cells, nude mice were injected by BHK-21 cells which inactivated by formaldehyde, diethylenimine (BEI), β-propiolactone (BPL) as well as BHK-21 cells which freezing-thawing at -20 ℃, the tumor-bearing characteristics were observed by pathomorphological changes. The results showed that the tumor morbidity of BHK-21 cells were treated by formaldehyde, BEI, BPL and freezing-thawing for two or three times were zero, 107,105,103BHK-21 cells can 100% cause the tumors as well as the BHK-21 cells were freezing-thawing only once, no tumors were found when the dose of injection is ten. These results suggested that the sensitivity of tumorigenicity of BHK-21 cells in nude mice was 103cells, the tumorigenicity of BHK-21 cells can be killed with freezing-thawing for twice, formaldehyde, BEI and BPL; but it still have tumorigenicity in nude mice with freezing-thawing only once.

    BHK-21 cells;nude mice; tumorigenicity

    10.11751/ISSN.1002-1280.2017.11.05

    2017-02-23

    A

    1002-1280 (2017) 11-0028-08

    Q813

    于義娟,碩士,從事獸用疫苗研發(fā)和動物組織病理檢測研究。

    謝紅玲。E - mail:13419546263@163.com

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