抑制Survivin可抑制貝伐珠單抗導致的膠質(zhì)瘤細胞侵襲性增強

王鵬 張劍寧 陳金輝 于新 劉銳 孫艷杰

(海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100048)

·腦膠質(zhì)細胞瘤研究·

抑制Survivin可抑制貝伐珠單抗導致的膠質(zhì)瘤細胞侵襲性增強

王鵬 張劍寧*陳金輝 于新 劉銳 孫艷杰

(海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100048)

目的探討Survivin對人腦膠質(zhì)瘤細胞經(jīng)貝伐珠單抗治療后侵襲性的影響。方法構建抑制Survivin表達的U251/sur(-)膠質(zhì)瘤細胞，經(jīng)貝伐珠單抗處理。采用四甲基偶氮唑藍法檢測細胞增殖，劃痕試驗檢測細胞的遷移能力，Transwell試驗檢測細胞的侵襲能力。結果經(jīng)貝伐珠單抗處理后，U251細胞的遷移、侵襲能力明顯增強。與親代U251細胞相比，抑制Survivin的U251/sur(-)細胞經(jīng)貝伐珠單抗處理后，其遷移和侵襲能力明顯降低。與單獨抑制Survivin或單獨使用貝伐珠單抗相比，將二者合用后膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力明顯下降。結論抑制Survivin可明顯抑制貝伐珠單抗處理后膠質(zhì)瘤細胞侵襲性增強，并與貝伐珠單抗產(chǎn)生協(xié)同效應，抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖。

膠質(zhì)瘤; 貝伐珠單抗; 存活蛋白; 侵襲

膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma, GBM)是顱內(nèi)最常見且侵襲性極強的惡性腫瘤，雖然基礎和臨床研究不斷進展，新型治療方法不斷出現(xiàn)，例如多種分子靶向藥物被研發(fā)，并相繼進入臨床試驗及臨床，但其預后仍不樂觀，確診后患者的中位生存時間為12～14個月[1]。

膠質(zhì)母細胞瘤的典型特征為瘤組織內(nèi)富含血管，以往研究表明膠質(zhì)母細胞瘤可分泌較高水平的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，并且臨床試驗發(fā)現(xiàn)針對腫瘤血管形成的人源化VEGF靶向單克隆抗體貝伐珠單抗，對復發(fā)膠質(zhì)瘤具有較好的治療效果[2]；新近2項貝伐珠單抗聯(lián)合放療及替莫唑胺治療新發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤患者的前瞻性III期臨床試驗(AVAglio amp; RTOG 0825)表明：貝伐珠單抗聯(lián)合放療及替莫唑胺化療，可以延長新診斷膠質(zhì)瘤患者的無癥狀生存時間(progression-free survival, PFS)，但是患者的總生存時間(overall survival, OS)沒有增加[3]。抗VEGF治療(包括貝伐珠單抗在內(nèi))可以迅速減少腫瘤血管的通透性，在磁共振影像上表現(xiàn)為腫瘤強化體積的減少，但是患者最終的預后并沒有改變，原因可能與抗VEGF治療增強瘤細胞的侵襲性有關[4]。

Survivin屬于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族成員，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，不僅可以影響細胞分裂及細胞增殖，還在腫瘤細胞的遷移及侵襲中發(fā)揮作用。

因此本實驗擬首先明確貝伐珠單抗治療是否可以導致膠質(zhì)瘤細胞侵襲性增強，進而下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞中Survivin的表達，觀察其是否可以抑制貝伐珠單抗治療導致的膠質(zhì)瘤細胞侵襲性，并探討抑制Survivin是否可以提高貝伐珠單抗的治療效果。

材料與方法

一、材料

U251膠質(zhì)瘤細胞，Survivin的干擾質(zhì)粒由第四軍醫(yī)大學西京腦科醫(yī)院章翔教授惠贈。改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)購自Hyclone公司，胎牛血清購自Gibco公司，貝伐珠單抗購自羅氏制藥有限公司，Matrigel購自BD公司，四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)購自Sigma公司，Transell小室購自Millipore公司，龍膽紫購自Sigam公司。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：人膠質(zhì)母細胞瘤系U251細胞用含10 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、50 mL/L CO2的孵箱中培養(yǎng)。將U251細胞分別轉(zhuǎn)染pRNAT(空載體)、pRNAT-Survivin shRNA[針對Survivin基因的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表達載體)、pRNAT-NS si [無關序列(nonsense sequence, NS)載體]，采用G418篩選，構建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系為：U251/pCtrl細胞、U251/sur(-)細胞和U251/NS si細胞。

2.MTT法檢測細胞增殖情況：將U251、U251/sur(-)、U251/pCtrl、U251/NS si細胞接種至24孔板，每孔1×104個細胞，每組細胞接種9孔。1 d后(細胞貼壁)分別加入不同濃度的貝伐珠單抗。在接種的第2、4、6天，每組細胞各取3孔計數(shù)，以MTT法測定各組的吸光度值，繪制細胞生長曲線。

3.劃痕實驗檢測細胞遷移能力：分別以1×105細胞/孔的密度，將各組細胞接種于6孔板中，生長至90%的融合度后，用20 μL槍頭垂直于六孔板底部劃痕，無血清的DMEM培養(yǎng)液洗去除劃下的細胞，加入含指定濃度貝伐珠單抗的無血清培養(yǎng)基后用倒置相差顯微鏡記錄此時及24 h后細胞的遷移情況。

4.Transwell實驗檢測細胞侵襲能力：基質(zhì)膠包被的Transwell小室放入 24 孔培養(yǎng)板中，無血清培養(yǎng)液加至下室，分別以 5×104細胞/孔的密度，將U251、U251/sur(-)、U251/pCtrl、U251/NS si細胞接種至上室，孔徑為 8 μm的濾膜將上室的細胞和下室的培養(yǎng)液隔開，在上室和下室中加入指定濃度的貝伐珠單抗。在37 ℃孵箱中培養(yǎng) 24 h后，將位于濾膜上層的細胞擦除，穿過濾膜，位于濾膜下部的細胞用龍膽紫染色后，倒置顯微鏡觀察。

2.從格蘭杰因果關系看，廣西對東盟出口貿(mào)易與跨境人民幣結算兩者間互為格蘭杰原因關系，而廣西對東盟進口貿(mào)易與跨境人民幣結算兩者間不存在格蘭杰原因關系。

結 果

一、不同濃度貝伐珠單抗對細胞增殖能力的影響

為了排除貝伐珠單抗對細胞增殖能力的影響，進而因細胞增殖能力差異導致貝伐珠單抗處理后細胞侵襲及遷移能力的差異，首先繪制不同濃度的(0、2、4、6、8和10 mg/mL)貝伐珠單抗處理后，U251細胞的生長曲線。以濃度為0、2、4、6 mg/mL的貝伐珠單抗處理U251細胞，細胞的增殖能力無明顯差異(Pgt;0.05，圖1 )；以濃度為8、10 mg/mL的貝伐珠單抗處理U251細胞，細胞的增殖能力明顯下降(Plt;0.01，圖1 )。因此下述試驗選用的貝伐珠單抗的濃度均為6 mg/mL。

二、貝伐珠單抗可增強膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力

將未經(jīng)貝伐珠單抗處理U251細胞(對照組細胞, Ctrl)的遷移距離設為100%，其他各組細胞遷移的距離與對照組進行比較后，表示成百分率的形式。劃痕實驗提示，與未經(jīng)貝伐珠單抗處理的U251細胞相比，經(jīng)貝伐珠單抗處理的U251細胞，遷移能力明顯增強(Plt;0.01，圖2、3)。

三、貝伐珠單抗可增強膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力

四、抑制Survivin可降低貝伐珠單抗處理后細胞遷移能力的增強

抑制Survivin的U251細胞(U251/sur(-))，與親代U251(Ctrl)細胞相比，遷移能力減弱(Plt;0.01，圖2、3)；經(jīng)貝伐珠單抗處理后，抑制Survivin的U251細胞(U251/sur(-))，與親代U251(Ctrl)細胞相比，遷移能力減弱(Plt;0.01，圖2、3) 。

五、抑制Survivin可降低貝伐珠單抗處理后細胞侵襲能力的增強

抑制Survivin的U251細胞(U251/sur(-))，與親代U251(Ctrl)細胞相比，侵襲能力明顯減弱(Plt;0.01，圖4、5)；經(jīng)貝伐珠單抗處理后，抑制Survivin的U251細胞(U251/sur(-))，與親代U251(Ctrl)細胞相比，侵襲能力明顯減弱(Plt;0.01，圖4、5)。

六、抑制Survivin可與貝伐珠單抗發(fā)揮協(xié)同效應，抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖

以濃度為6 mg/mL的貝伐珠單抗處理U251細胞，細胞的增殖能力未見下降(Pgt;0.05, 圖1)；將貝伐珠單抗(6 mg/mL)與抑制survivin聯(lián)合應用，與單獨使用貝伐珠單抗或單純抑制survivin相比，U251細胞增殖能力明顯下降(Plt;0.01, 圖6)。

圖1 各組細胞生長曲線

Fig 1 Growth curve of U251 cells in different groups

aPlt;0.01,vs0 mg/mL.

圖2 貝伐珠單抗和Survivin對U251細胞遷移能力的影響 (×100)

Fig 2 Effect of bevacizumab (Bev) or Survivin on U251 cells migration detected by scratch assay (×100)

A: The wound of U251 cells without the treatment of Bev at baseline; B: The wound of U251 cells without the treatment of Bev at 24 h later; C: The wound of U251 cells treated by Bev at baseline; D: The wound of U251 cells treated by Bev at 24 h later; E: The wound of U251/sur(-) cells without the treatment of Bev at baseline; F: The wound of U251/sur(-) cells without the treatment of Bev at 24 h later; G: The wound of U251/sur(-) cells treated by Bev at baseline; F: The wound of U251/sur(-) cells treated by Bev at 24 h later.

圖3 定量分析貝伐珠單抗和Survivin對U251細胞遷移能力的影響

Fig 3 Quantitative analysis of bevacizumab (Bev) or Survivin on U251 cells migration in vitro

aPlt;0.01,vsCtrl;bPlt;0.01,vsBev.

圖4 貝伐珠單抗和Survivin對U251細胞侵襲能力的影響(×100)

Fig 4 Effect of bevacizumab (Bev) or Survivin on U251 cells invasion in vitro (×100)

A: The U251 cells that had migrated across transwell filters without the treatment of Bev; B: The U251 cells that had migrated across transwell filters treated by Bev; C: The U251/sur (-) cells that had migrated across transwell filters without the treatment of Bev; D: The U251/sur(-) cells that had migrated across transwell filters treated by Bev.

圖5 貝伐珠單抗和Survivin對U251細胞侵襲能力的影響

Fig 5 Quantiative analysis of bevacizumab (Bev) or Survivin on U251 cells invasion in vitro

aPlt;0.01,vsCtrl;bPlt;0.01,vsBev.

圖6 各組細胞生長曲線

Fig 6 Growth curve of U251 cells in different groups

aPlt;0.01,vsBev (+).

討 論

抗血管形成治療是一種新型的膠質(zhì)瘤治療方法，人源化針對VEGF的單克隆抗體貝伐珠單抗，對復發(fā)的膠質(zhì)母細胞瘤具有顯著的治療價值；但是抗血管治療后，腫瘤細胞具有更強的侵襲性，很多患者表現(xiàn)出彌漫性或多中心的進展，并導致病情迅速惡化[5-6]。因此貝伐珠單抗雖然可以使患者在短時間內(nèi)受益，但是亟需進一步研究明確抗血管形成治療如何影響腫瘤細胞的生物學特性，闡明其中的機制，以克服抗血管形成治療導致的腫瘤細胞侵襲性增強，提高膠質(zhì)瘤患者的存活時間。

我們的研究發(fā)現(xiàn)貝伐珠單抗可直接作用于U251細胞，使其侵襲及遷移能力增強，這就提示我們靶向性抑制VEGF或者說干擾腫瘤細胞的VEGF-VEGF受體信號轉(zhuǎn)導通路，可以使腫瘤細胞的表型發(fā)生改變，對治療產(chǎn)生抗性。但是也有研究認為，應用貝伐珠單抗后，使腫瘤組織內(nèi)的血供減少，加劇了腫瘤組織內(nèi)的缺氧微環(huán)境，通過缺氧誘導腫瘤基因表達的改變，進而使腫瘤細胞的侵襲性增強[7]。存在上述不同解釋，說明腫瘤細胞侵襲能力改變的機制非常復雜，究竟何種機制在其中發(fā)揮主要作用，二者有無關聯(lián)，有待進一步的研究闡明。

大量研究表明，Survivin在腫瘤細胞中發(fā)揮重要作用，包括抑制凋亡，促進分裂，增加腫瘤細胞耐藥性，維持腫瘤干細胞，促進腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移等；回顧性研究分析及薈萃分析提示Survivin與乳腺癌、直結腸癌、胃癌、甲狀腺癌、食管癌、非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移及侵襲性密切相關[8]。IAP家族可以通過Ras相關的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)的泛素化調(diào)控受體輔助因子(receptor accessory factor, RAF)，發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤細胞遷移的作用；也有研究提示IAPs可以通過進化的保守性促進腫瘤細胞遷移[9]；作為IAP家族的成員，越來越多的研究提示Survivin是重要的腫瘤細胞遷移及侵襲的調(diào)節(jié)因子，在腫瘤的遷移中發(fā)揮重要作用。Survivin調(diào)控細胞遷移的信號轉(zhuǎn)導通路可能與其抑制凋亡及促進分裂的信號通路不同；有研究指出Survivin可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶，消化細胞外基質(zhì)，發(fā)揮促進細胞遷移的作用[10]。

我們的研究首次發(fā)現(xiàn)靶向抑制腫瘤組織中的Survivin可以明顯抑制貝伐珠單抗導致的腫瘤細胞侵襲性增強。以往的研究提示，Survivin在細胞分裂及細胞增殖中發(fā)揮重要作用，因此抑制腫瘤細胞的Survivin，是通過抑制腫瘤細胞增殖，導致腫瘤細胞數(shù)量減少，進而間接起到了抑制貝伐珠單抗導致的侵襲性增強的作用，還是通過調(diào)控細胞遷移及侵襲的信號轉(zhuǎn)導通路，直接發(fā)揮了抑制貝伐珠單抗導致的腫瘤細胞侵襲性增強的作用，或者兩者皆而有之，有待進一步研究闡明。更有意思的現(xiàn)象是，將二者聯(lián)合應用，與單純抑制腫瘤細胞中的Survivin或單獨使用貝伐珠單抗相比，腫瘤細胞的增殖能力明顯下降，提示二者聯(lián)合應用可產(chǎn)生協(xié)同效應，但是通過何種機制發(fā)揮的協(xié)同效應，也需要進一步研究明確。

總之，靶向抑制腫瘤組織中的Survivin與貝伐珠單抗聯(lián)合應用，可能會對膠質(zhì)瘤的治療起到積極的促進作用，有望提高膠質(zhì)瘤患者的治療效果。

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KnockdownofSurvivinexpressioninhibitsgliomacellsinvasioninducedbybevacizumabtreatmentingliomacells

WANGPeng,ZHANGJianning,CHENJinhui,YUXin,LIURui,SUNYanjie

DepartmentofNeurosurgery,NavyGeneralHospital,Beijing100048, China

ObjectiveThe study aims to investigate the effect of Survivin on glioma cells invasion after treated by bevacizumab.MethodsSurvivin shRNA plasmids were transfected in to U251 cells. The cells proliferation, migration, and invasion were determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, wound healing, and transwell assay, respectively.ResultsThe migration and invasion of U251 cells were increased by bevacizumab. Knockdown of Survivin by RNAi inhibited bevacizumab-induced cell invasion. Furthermore, the combined administration of bevacizumab and knockdown of Survivin significantly suppressed the proliferation of glioma cells compared to bevacizumab treatment or knockdown of Survivin alone.ConclusionDown-regulation of Survivin could inhibit glioma cells invasion induced by bevacizumab treatment, therefore Survivin might be a potential target to ameliorate the therapeutic efficiency of bevacizumab.

Glioma; Bevacizumab; Survivin; Invasion

1671-2897(2017)16-011-04

R 739.41

A

王鵬，博士，E-mail: 986257010@qq.com

*通訊作者： 張劍寧，教授、主任醫(yī)師，博士生導師，E-mail: jnzhang2005@163.com

2016-05-08；

2016-10-30)