針刺對(duì)氯喹致非組胺依賴性瘙癢模型小鼠延髓5-羥色胺能神經(jīng)元及5-羥色胺受體2B表達(dá)的影響

趙一丁，閆嬋娟，孫丹，李文彬，閆小寧

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針刺對(duì)氯喹致非組胺依賴性瘙癢模型小鼠延髓5-羥色胺能神經(jīng)元及5-羥色胺受體2B表達(dá)的影響

趙一丁，閆嬋娟，孫丹，李文彬，閆小寧

陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西西安710003

觀察針刺對(duì)非組胺依賴性瘙癢模型小鼠瘙癢行為、延髓5-羥色胺（5-HT）能神經(jīng)元及5-HT受體2B（5-HTR2B）表達(dá)的影響，探討針刺在對(duì)瘙癢調(diào)控過(guò)程中的作用機(jī)制。采用頸背部皮下注射氯喹方法制作非組胺依賴性瘙癢模型。40只C57B/6J小鼠隨機(jī)分為造模組（針刺組、非針刺組）、生理鹽水組和空白對(duì)照組，每組10只。成模后，針刺組針刺雙側(cè)“血?！薄扒亍奔啊昂瞎取?，采用提插和捻轉(zhuǎn)手法刺激，每日1次，共3次，非針刺組不予針刺，生理鹽水組予頸背部注射生理鹽水后不做處理，空白對(duì)照組不做處理。分別觀察各組小鼠行為學(xué)變化，免疫熒光和Western blot檢測(cè)延髓5-HT能神經(jīng)元及5-HTR2B的表達(dá)。造模組小鼠搔抓次數(shù)明顯高于生理鹽水組和空白對(duì)照組（＜0.05），針刺組搔抓次數(shù)少于非針刺組（＜0.05），5-HT能神經(jīng)元在空白對(duì)照組和生理鹽水組表達(dá)均不明顯，造模組小鼠5-HT能神經(jīng)元表達(dá)明顯增加，針刺后5-HT能神經(jīng)元表達(dá)減少，針刺組和非針刺組延髓5-HTR2B表達(dá)明顯高于生理鹽水組和空白對(duì)照組（＜0.01），針刺組5-HTR2B表達(dá)低于非針刺組（＜0.01）。針刺對(duì)瘙癢模型小鼠搔抓行為具有抑制作用，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)延髓5-HT能神經(jīng)元及5-HTR2B的表達(dá)發(fā)揮作用。

針刺；非組胺依賴性瘙癢；5-羥色胺能神經(jīng)元；5-羥色胺受體2B；小鼠

瘙癢的定義最早由德國(guó)醫(yī)生Samuel Hafenreffer提出[1]，是一種可引發(fā)搔抓意愿和搔抓反射的特異性皮膚感覺(jué)，是特應(yīng)性皮炎、銀屑病、蕁麻疹等多種皮膚疾病的常見(jiàn)表現(xiàn)，其產(chǎn)生機(jī)制主要包括組胺依賴性瘙癢和非組胺依賴性瘙癢，后者涉及復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路、多種介質(zhì)和受體，臨床上缺乏有效的治療手段。研究顯示，針刺對(duì)瘙癢有不同程度的抑制作用[2]，但作用機(jī)制尚不清楚。本研究擬構(gòu)建非組胺依賴性瘙癢小鼠模型，觀察針刺穴位對(duì)模型小鼠脊髓5-羥色胺（5-HT）及5-HT受體2B（5-HTR2B）能神經(jīng)元表達(dá)的影響，探討針刺在對(duì)瘙癢調(diào)控過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康C57B/6J雄性小鼠40只，SPF級(jí)，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK2012-003。飼養(yǎng)于室溫18～24 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，12 h/12 h光照交替環(huán)境，自由攝食飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表將40只C57B/6J小鼠隨機(jī)分為造模組（20只）、生理鹽水組（10只）和空白對(duì)照組（10只）。

1.2 主要試劑與儀器

一抗5-HTR2B（26408-1-AP），美國(guó)Proteintech公司；β-actin（SC-47778），美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；羊抗鼠二抗，美國(guó)PIERCE公司；羊抗兔二抗，美國(guó)PIERCE公司；兔IgG免疫組化試劑盒、抗熒光衰減封片劑、DAPI染色劑，武漢博士德生物工程有限公司；丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、SDS、TEMED、過(guò)硫酸銨、甘氨酸、溴酚鹽、DTT、考馬斯亮藍(lán)R-250、Tween20，美國(guó)Amresco公司；OCT包埋劑，武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司；NC膜、BCA kit、Supersignalwest pico，美國(guó)PIERCE公司；RIPA蛋白裂解液，上海邦奕生物科技有限公司；Cocktail蛋白酶抑制劑，德國(guó)Roch公司。冰凍切片機(jī)（德國(guó)LAIKA），超低溫冰箱（日本SANYO），熒光顯微鏡（日本OLYMPUS），臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Benchmark），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海生工生物工程股份有限公司），蛋白垂直電泳槽（美國(guó)Biorad公司），蛋白濕轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Biorad公司），電泳儀（北京六一儀器廠），攝像機(jī)（日本SONY），華佗牌一次性0.25 mm×25 mm針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

1.3 造模

實(shí)驗(yàn)前小鼠放入透明樹(shù)脂盒內(nèi)每日適應(yīng)1 h，3 d后除空白對(duì)照組外全部小鼠頸背部（肩胛連線中點(diǎn)上方約5 mm處）皮膚刮毛，適應(yīng)1 h后于模型組小鼠頸背部刮毛區(qū)皮內(nèi)注射氯喹50 μg/50 μL，生理鹽水組小鼠頸背部刮毛區(qū)注射生理鹽水，各組注射后立即放入透明脂盒內(nèi)，觀察小鼠行為學(xué)變化。

1.4 干預(yù)

將成模小鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為針刺組和非針刺組，針刺組取雙側(cè)“血?！薄扒亍奔啊昂瞎取?，小鼠穴位定位及針刺深度均參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]，將毫針直刺雙側(cè)血海、曲池及合谷5 mm，采用提插和捻轉(zhuǎn)手法刺激，留針時(shí)間為20 min，每日1次，共治療3次，非針刺組造模后不做任何處理，生理鹽水組頸背部刮毛區(qū)注射生理鹽水后不做任何處理，空白對(duì)照組不做任何處理。

1.5 取材

針刺后各組小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，固定在操作臺(tái)上，迅速開(kāi)胸，提拉胸骨柄，完全暴露小鼠心臟，使用6號(hào)靜脈輸液器插入左心室后，用血管鉗固定好輸液器進(jìn)針處，并夾閉心臟，剪開(kāi)右心耳，打開(kāi)靜脈輸液器最快滴速注入生理鹽水，觀察小鼠肝臟及腸管，待肝臟由紅色變?yōu)榘咨c管鼓脹，四肢及尾部僵直，迅速緊貼小鼠枕骨下用剪刀斷頭，剔除多余皮膚、肌肉組織，用彎鉗剪去顱骨，將大腦沿腹側(cè)剝出并置于冰面上，切除小腦后定位延髓上、下界，取延髓后切半，一半置于凍存管內(nèi)放入液氮罐中凍存，后移入-80 ℃冰箱中保存，用于Western blot檢測(cè)；另一半置于4%多聚甲醛固定液中固定，經(jīng)30%蔗糖溶液脫水4 d，待組織沉底后在冰凍切片機(jī)中做水平切片，收集切片于防脫載玻片上，置于切片盒中4 ℃冰箱保存用于免疫熒光檢測(cè)。

1.6 行為學(xué)觀察

小鼠頸背部中央剃毛區(qū)皮下注射氯喹/生理鹽水后，立即將小鼠放回透明樹(shù)脂盒內(nèi)，保持室內(nèi)安靜，和空白對(duì)照組小鼠同時(shí)由攝像機(jī)錄像40 min，針刺組小鼠治療后再行觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后回放錄像觀察小鼠活動(dòng)情況。行為學(xué)觀察以搔抓次數(shù)作為評(píng)判方法：以小鼠后爪離開(kāi)盒子底面并搔抓皮膚，到其后爪落地或舔舐其后爪為一次完整的搔抓動(dòng)作，在此期間不管搔抓多少次，均記為1次[4]，由2名不參加實(shí)驗(yàn)的工作人員記錄小鼠搔抓次數(shù)。

1.7 延髓5-羥色胺能神經(jīng)元熒光表達(dá)測(cè)定

將制備的延髓組織用含0.3%TritonX-100的PBS洗1次，再用PBS洗3次，每次10 min，10%羊血清封閉液封閉30 min，之后甩干凈封閉液，晾干；一抗用PBS稀釋（1∶200），4 ℃過(guò)夜，棄去一抗，0.3%TritonX-100洗2次，PBS洗1次，每次10 min；二抗用PBS稀釋，室溫孵育30 min，0.3% TritonX-100洗2次，PBS洗1次，每次10 min；室溫孵育30 min，0.3%TritonX-100洗2次，PBS洗1次，每次10 min，DAPI染色劑染色5 min，0.3%TritonX-100洗2次，PBS洗1次，每次10 min，最后加入抗熒光衰減封片劑，加蓋玻片，于熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.8 延髓5-羥色胺受體2B蛋白表達(dá)測(cè)定

采用Western blot方法。取出保存的延髓組織，稱重后研缽中倒入液氮，研碎組織塊后移入EP管中，加RIPA蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑Aprotinin，裂解后取上清液置于EP管內(nèi)，冰上保存，將各樣品蛋白液1∶50稀釋，參照BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白測(cè)定，每個(gè)樣品取相同質(zhì)量蛋白，加5×loading buffer后沸水煮10 min使其變性；將制備好的10%凝膠板放入電泳槽內(nèi)，倒入1×Running Buffer，用細(xì)槍頭加樣，確定加樣順序并計(jì)算加樣量；將電泳槽與電源連接好，以90 V穩(wěn)壓狀態(tài)電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠時(shí)將電壓調(diào)整至100 V，待溴酚藍(lán)電泳至分離膠底部停止電泳；按方向依次放好濾紙、膠、膜，直至整個(gè)夾板保持緊密，含5%脫脂奶粉的TBS封閉，室溫封閉4 h；結(jié)合一抗，4 ℃過(guò)夜，5-HTR2B（1∶1000），室溫漂洗3次，每次10 min；結(jié)合二抗，室溫結(jié)合2 h，羊抗鼠二抗（1∶10 000）、羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫漂洗3次，每次10 min，最后1次用TBS漂洗以去除吐溫；化學(xué)發(fā)光，于暗室中曝光操作，梯度曝光10～300 s。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 針刺對(duì)模型小鼠搔抓次數(shù)的影響

造模組小鼠搔抓次數(shù)明顯高于生理鹽水組和空白對(duì)照組（＜0.01），針刺后對(duì)造模組小鼠搔抓行為有抑制作用，針刺組搔抓次數(shù)低于非針刺組（＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：與造模組比較，##P＜0.01；與針刺組比較，*P＜0.05

2.2 針刺對(duì)模型小鼠延髓5-羥色胺能神經(jīng)元表達(dá)的影響

5-HT能神經(jīng)元在空白對(duì)照組和生理鹽水組表達(dá)均不明顯，造模組小鼠5-HT能神經(jīng)元表達(dá)明顯增加，在小鼠延髓皮質(zhì)呈團(tuán)塊狀分布，針刺后顯示同視野針刺組與非針刺組比較5-HT能神經(jīng)元表達(dá)減少。結(jié)果見(jiàn)圖2。

注：圖中箭頭所指為神經(jīng)元內(nèi)目標(biāo)蛋白

2.3 針刺對(duì)模型小鼠延髓5-羥色胺受體2B蛋白表達(dá)的影響

非針刺組延髓5-HTR2B蛋白表達(dá)明顯高于生理鹽水組和空白對(duì)照組（＜0.01），針刺組延髓5-HTR2B蛋白表達(dá)明顯低于非針刺組（＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1、圖3。

表1 各組小鼠延髓5-HTR2B蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與非針刺組比較，##＜0.01；與針刺組比較，**＜0.01

注：A.空白對(duì)照組；B.生理鹽水組；C.針刺組；D.非針刺組

3 討論

中醫(yī)對(duì)瘙癢的認(rèn)識(shí)，早在《靈樞?刺節(jié)真邪》便有“虛邪之中人也……搏于皮膚之間，其氣外發(fā)，腠理開(kāi)，毫毛搖，氣往來(lái)行，則為癢”，說(shuō)明風(fēng)邪犯表，正氣出與抗?fàn)?，腠理開(kāi)泄，風(fēng)邪游走于毛腠之間，故癢；《金匱要略?水氣病脈證并治》有“……風(fēng)氣相搏，風(fēng)強(qiáng)則為隱疹，身體為癢，癢為泄風(fēng)”，說(shuō)明風(fēng)與熱相搏，風(fēng)邪偏盛則傷及營(yíng)分，故癢；朱丹溪認(rèn)為“諸癢為虛，血不榮肌膚，所以癢也”；戴原禮認(rèn)為“有脾虛身癢……”，說(shuō)明瘙癢與血虛、脾虛有關(guān)[5]。現(xiàn)代中醫(yī)所講瘙癢由風(fēng)、濕、熱、蟲(chóng)、毒之邪氣郁于皮膚腠理，使其氣血不和，膚失濡養(yǎng)，郁而生微熱所致，或由于血虛風(fēng)燥阻于皮膚，肌膚失養(yǎng)，內(nèi)生虛熱而發(fā)。

瘙癢是許多皮膚疾病常見(jiàn)而棘手的臨床表現(xiàn)，如特應(yīng)性皮炎、蕁麻疹、銀屑病等，這些疾病引發(fā)的瘙癢類型通常為非組胺依賴性瘙癢，不伴隨發(fā)熱、紅疹等，傳統(tǒng)抗組胺治療無(wú)效。這類瘙癢是由一類機(jī)械熱敏感的有髓鞘C-纖維（mechanoheat-sensitive C fibers，CMHs）介導(dǎo)的，這類纖維傳導(dǎo)速度較快，其神經(jīng)末梢主要分布在表皮，可以被非組胺類致癢劑（如氯喹）所激活，CMHs將信號(hào)傳導(dǎo)到脊髓背角的淺層和深層，然后沿脊髓丘腦束上行傳導(dǎo)到丘腦[6]。瘙癢作為一種傷害性刺激對(duì)脊髓上中樞組成的下行調(diào)制系統(tǒng)有激活作用，其中延髓頭端腹內(nèi)側(cè)核作為下行系統(tǒng)的重要組成部分參與多種神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)感覺(jué)的調(diào)控[7]，其中5-HT是一種重要的內(nèi)源性致癢物質(zhì)，通過(guò)與其特異性受體結(jié)合，可引起磷脂酶C及絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路的活化，誘導(dǎo)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+釋放和細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，增加神經(jīng)細(xì)胞興奮性，產(chǎn)生癢覺(jué)[8]。有研究報(bào)道，針刺可降低5-HT致癢大鼠血清IgE含量及5-HT2A受體數(shù)量[9]。

本研究通過(guò)建立非組胺依賴性瘙癢動(dòng)物模型，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT能神經(jīng)元為研究對(duì)象，以針刺“曲池”“血?！薄昂瞎取睘楦深A(yù)措施，初步探討了針刺止癢的可能中樞機(jī)制。曲池、合谷屬手陽(yáng)明大腸經(jīng)，乃多氣多血之經(jīng)，善于開(kāi)泄，能疏泄蘊(yùn)于肌膚之邪，達(dá)到開(kāi)腠理、疏風(fēng)清熱止癢的作用；血海屬足太陰脾經(jīng)穴為血會(huì)，具有理血活血、散風(fēng)除濕的作用，取“治風(fēng)先治血、血行風(fēng)自滅”之意。本研究結(jié)果從動(dòng)物行為學(xué)觀察、5-HT能神經(jīng)元的熒光表達(dá)及5-HTR2B表達(dá)3個(gè)層次，共同說(shuō)明針刺對(duì)瘙癢模型小鼠的搔抓行為具有抑制作用，并可下調(diào)模型小鼠延髓5-HT能神經(jīng)元及5-HTR2B的表達(dá)，降低神經(jīng)細(xì)胞興奮性，從而抑制癢覺(jué)的產(chǎn)生，從機(jī)制上闡明針灸止癢的可能靶點(diǎn)，為針刺治療瘙癢性皮膚病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of Acupuncture on Expression of 5-HT Neurons in Medulla Oblongata and 5-HTR2B on Mice Models with Chloroquine-induced Pruritus

ZHAO Yi-ding, YAN Chan-juan, SUN Dan, LI Wen-bin, YAN Xiao-ning

To explore the effects of acupuncture on pruritic behaviors, expression of 5-HT neurons in medulla oblongata and 5-HTR2B on mice with chloroquine-induced pruritus; To discuss the mechanism of action of acupuncture in chloroquine-induced pruritus.A non-histamine-dependent pruritus model was prepared by subcutaneous injection of chloroquine into the back of the neck. Forty C57B/6J mice were randomly divided into model-acupuncture group, model-non-acupuncture group, normal saline group and blank control group, with 10 mice in each group. After modeling, acupuncture was given in Xuehai, Quchi and Hegu on both sides. The plug and twist way was used to stimulate, once a day, three times. Model-non-acupuncture group received no acupuncture. Normal saline group received the neck injection of saline in the back. Blank control group received no treatment. Behavioral changes were observed, and immunofluorescence technique and Western blot were used to test the expression of 5-HT neurons and 5-HTR2B in medulla oblongata neurons.The number of scratches in model-acupuncture group and model-non-acupuncture group was obviously more than normal saline group and blank control group (<0.05). The number of scratches in model-acupuncture group was lower than that of model-non-acupuncture group (<0.05). The expression of 5-HT in medulla oblongata neurons was unclear in both normal saline group and blank control group. The expression of 5-HT neurons in medulla oblongata significantly increased in model group, which decreased after acupuncture. The expression of 5-HTR2B of model group was significant higher than normal saline group and blank control group (<0.01). Compared with model-non-acupuncture group, the expression of 5-HTR2B in model-acupuncture group significant decreased (<0.01).Acupuncture can significantly inhibit scratching behaviors in mice induced by chloroquine, and the mechanism may be realized by decreasing the expression of 5-HT neurons and 5-HTR2B in medulla oblongata neurons.

acupuncture; non-histamine-dependent; 5-HT neurons; 5-HTR2B; mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.014

R245

A

1005-5304(2017)12-0056-04

（2017-05-15）

（2017-06-13；編輯：華強(qiáng)）

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃（2015JQ8317）