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    三種益生菌菌株與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用

    2016-10-26 06:00:36劉文娜王輝輝東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院哈爾濱50030鄂倫春自治旗大楊樹畜牧綜合服務(wù)站內(nèi)蒙古呼倫貝爾65456
    關(guān)鍵詞:共培養(yǎng)滴度菌體

    魏 萍,劉文娜,王輝輝(.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱50030;.鄂倫春自治旗大楊樹畜牧綜合服務(wù)站,內(nèi)蒙古呼倫貝爾65456)

    三種益生菌菌株與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用

    魏萍1,劉文娜1,王輝輝2
    (1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,哈爾濱150030;2.鄂倫春自治旗大楊樹畜牧綜合服務(wù)站,內(nèi)蒙古呼倫貝爾165456)

    為模擬豬腸道內(nèi)環(huán)境,探究益生菌與細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用,利用Transwell小室在體外建立益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng),通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色,檢測(cè)PK-15細(xì)胞存活率。結(jié)果表明,當(dāng)益生菌菌體濃度102cfu·mL-1≤c≤1012cfu·mL-1,共培養(yǎng)時(shí)間為1和3 h;當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間1 h≤t≤24 h,益生菌菌體濃度為102、104、106和108cfu·mL-1時(shí),PK-15細(xì)胞存活率較高,益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)成立。采用MTT比色法檢測(cè)對(duì)TGEV抑制率,結(jié)果顯示,益生菌菌體濃度約為102~108cfu·mL-1,共培養(yǎng)時(shí)間為1~24 h時(shí)對(duì)TGEV抑制率均達(dá)90%以上。此外,益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)的TGEV平均滴度較低。

    益生菌;PK-15細(xì)胞;共培養(yǎng);抗TGEV

    網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2016-6-17 15:21:52[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160617.1521.010.htm l

    魏萍,劉文娜,王輝輝.三種益生菌菌株與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(6):60-67.

    Wei Ping,Liu Wenna,Wang Huihui.Anti-TGEV effect of three probiotics strains and PK-15 cells co-culture[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(6):60-67.(in Chinese with English abstract)

    豬傳染性胃腸炎是危害嚴(yán)重的病毒性腹瀉病,主要臨床癥狀為嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水[1]。近年來(lái),常伴有PEDV、RV等混合感染,豬傳染性胃腸炎流行趨勢(shì)嚴(yán)峻[2]。Maragkoudakis等利用動(dòng)物和人腸道及非腫瘤來(lái)源巨噬細(xì)胞系模型檢測(cè)乳酸菌抗病毒活性,發(fā)現(xiàn)乳酸菌可保護(hù)完整單層細(xì)胞而不被RV或TGEV破壞,鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌抗RV和TGEV,對(duì)細(xì)胞有最佳保護(hù)效果[3]。Kumar等研究豬源腸道益生菌(植物乳桿菌和唾液乳桿菌)抗冠狀病毒(TGEV)活性,發(fā)現(xiàn)體外ST細(xì)胞上益生菌培養(yǎng)上清即代謝產(chǎn)物抑制TGEV生長(zhǎng),作用72 h未引起細(xì)胞病變效應(yīng),表明益生菌培養(yǎng)上清顯著抑制TGEV吸附ST細(xì)胞[4]。高長(zhǎng)春等根據(jù)體外ST細(xì)胞感染TGEV模型研究益生菌抗TGEV作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三株益生菌均能抑制TGEV感染ST細(xì)胞,但在菌株和作用方式存在差異[5]。前人研究?jī)H單一利用益生菌菌體、某種成分或代謝產(chǎn)物與細(xì)胞短暫作用,無(wú)法完全反映益生菌對(duì)細(xì)胞抗病毒作用影響。另外,相對(duì)于細(xì)菌間共培養(yǎng)[6]、細(xì)胞間共培養(yǎng)[7-8],尤其是益生菌與細(xì)胞共培養(yǎng)鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)嘗試將抗病毒和共培養(yǎng)有機(jī)融合,詣在模擬豬腸道內(nèi)環(huán)境,通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)初步摸索益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)成立條件,通過(guò)MTT比色法和CPE探究益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用效果,為應(yīng)用益生菌抗腹瀉病毒提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1菌株、細(xì)胞和病毒

    豬源枯草芽孢桿菌、屎腸球菌和食淀粉乳桿菌均為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存;PK-15細(xì)胞購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司;豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)TO163株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。

    1.1.2試驗(yàn)試劑

    DMEM/F-12 1?1購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司;FBS購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司;臺(tái)盼藍(lán)、MTT、DMSO均購(gòu)自Sigma公司;Transwell、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和六孔細(xì)胞培養(yǎng)板均購(gòu)自哈爾濱賽托(賽信)生物科技有限公司。

    1.2方法

    1.2.1益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)建立

    當(dāng)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中PK-15細(xì)胞鋪滿單層約為2.5×106cells·mL-1時(shí),棄液,PBS液洗滌3次后將0.4μm Transwell小室放入培養(yǎng)板孔中,每孔即分為上室和下室,小室內(nèi)稱上室,培養(yǎng)板孔內(nèi)稱下室,在下室中添加新的細(xì)胞培養(yǎng)基,以剛接觸Transwell小室基底膜為宜,約2mL,上室加用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的益生菌菌體,其終濃度分別為102、104、106、108、1010和1012cfu·mL-1,各處理組均封蓋于37℃,5%CO2無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別共培養(yǎng)1、3、6、12、18和24 h,移除Transwell小室,收集共培養(yǎng)上懸液,PBS液洗滌下室3次,加1m L 0.25%胰酶消化液作用5min,將貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)板上消化下來(lái),再加1mL細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化,連同收集的共培養(yǎng)上懸液一并用移液器轉(zhuǎn)移至Ep管中,1 000 r·min-1離心5min,棄上清液,加2mL PBS液并將PK-15細(xì)胞沉淀吹散成均勻單細(xì)胞混懸液,另加等體積0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液,混合均勻,染色2min,吸取少許液體于蓋有蓋玻片的血球計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)池內(nèi),光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)錄藍(lán)染和未藍(lán)染細(xì)胞數(shù)。

    1.2.2益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV效果測(cè)定

    1.2.2.1益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)TGEV抑制率影響

    當(dāng)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的PK-15細(xì)胞鋪滿單層約為2.5×106cells·mL-1時(shí),棄液,PBS液洗滌3次后,加2mL細(xì)胞培養(yǎng)基,將Transwell小室放入培養(yǎng)板孔中,上室加用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋益生菌菌體,其終濃度分別為102、104、106、108、1010和1012cfu·mL-1,封蓋于37℃,5%CO2無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)3 h,上室加細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的終濃度為108cfu·mL-1益生菌菌體,封蓋于37℃,5% CO2無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別共培養(yǎng)1、3、6、12、18和24 h后,移除Transwell小室,PBS液洗滌下室3次,加100μL 100TCID50TGEV與PK-15細(xì)胞作用,于37℃,5%CO2無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用1.5 h,PBS液洗滌3次,加1 m L維持液于37℃,5%CO2無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組,每組處理三孔重復(fù),改良MTT比色法測(cè)定益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)TGEV抑制率,即當(dāng)病毒對(duì)照組CPE達(dá)75%時(shí),PBS液洗滌3次,加25μLMTT溶液(5mg·mL-1)和100μL維持液,37℃避光孵育4 h,棄液,每孔加100μL二甲基亞砜(DMSO),避光震蕩10min,酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處光吸收度即OD490,根據(jù)公式計(jì)算:病毒抑制率(%)=[(益生菌與細(xì)胞共培養(yǎng)處理組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值)/(正常細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值)]× 100%。

    1.2.2.2益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)TGEV滴度影響

    當(dāng)六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中PK-15細(xì)胞鋪滿單層約為2.5×106cells·mL-1時(shí),棄液,PBS液洗滌3次后,加2mL細(xì)胞培養(yǎng)基,將Transwell小室放入培養(yǎng)板孔中,向上室加用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的終濃度為108cfu·mL-1益生菌,共培養(yǎng)12 h,PBS液洗滌3次后接入TGEV,于37℃,5%CO2無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1.5 h,PBS液洗滌3次,棄液,細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng),分別于6、12、24、48和72 h置-20℃反復(fù)凍融3次,4 000 r·min-1離心10 min,收集各組上清即為病毒液,0.22μm濾器過(guò)濾并分裝,于-80℃保存待測(cè)。

    當(dāng)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中PK-15細(xì)胞鋪滿單層約為105cells·mL-1時(shí),將待測(cè)病毒作10個(gè)梯度連續(xù)10倍倍比稀釋,每個(gè)稀釋度病毒以100μL·孔-1量接種到96孔細(xì)胞微量培養(yǎng)板每一縱列,同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照,于37℃,5%CO2無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天顯微鏡觀察,記錄細(xì)胞產(chǎn)生CPE孔數(shù),直至最低稀釋度孔內(nèi)細(xì)胞無(wú)病變,且對(duì)照組細(xì)胞開始衰老為止。

    1.3數(shù)據(jù)處理

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2007初步整理后,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,運(yùn)用SPSS 17.0軟件,作單因素方差A(yù)NOVA和多重比較分析,P>0.05時(shí),表示差異不顯著;P<0.05時(shí),表示差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)建立

    應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中藍(lán)染及未藍(lán)染細(xì)胞數(shù),根據(jù)公式:細(xì)胞存活率(%)=未藍(lán)染細(xì)胞數(shù)/(藍(lán)染細(xì)胞數(shù)+未藍(lán)染細(xì)胞數(shù))×100%,計(jì)算不同益生菌菌體濃度與不同共培養(yǎng)時(shí)間組合處理PK-15細(xì)胞存活率(%),結(jié)果見表1~4。

    由表1可知,同一共培養(yǎng)時(shí)間條件下,益生菌菌體濃度102、104、106、108cfu·mL-14組間PK-15細(xì)胞存活率差異不顯著,但均顯著高于益生菌菌體濃度為1010和1012cfu·mL-1的PK-15細(xì)胞存活率。

    表1 同一共培養(yǎng)時(shí)間不同益生菌菌體濃度PK-15細(xì)胞存活率比較(M ean±SD)Table1 Comparison of PK-15 cells survival rate of the same time of co-culture and different concentration of probiotics (%)

    當(dāng)益生菌菌體濃度102cfu·mL-1≤c≤1012cfu·mL-1時(shí),對(duì)不同共培養(yǎng)時(shí)間PK-15細(xì)胞存活率比較組間差異性,結(jié)果見表2。

    由表2可知,當(dāng)益生菌菌體濃度102cfu·mL-1≤c≤1012cfu·mL-1時(shí),共培養(yǎng)1和3 h兩組間PK-15細(xì)胞存活率差異不顯著,但均顯著高于其余各組。

    綜上所述,當(dāng)益生菌菌體濃度102cfu·mL-1≤c≤1012cfu·mL-1時(shí),共培養(yǎng)時(shí)間為1或3 h,益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)成立。

    表2 不同共培養(yǎng)時(shí)間PK-15細(xì)胞存活率組間比較(Mean±SD)Table2 Comparison of PK-15 cells survival rate of different time of co-culture

    由表3可知,當(dāng)益生菌菌體濃度≤108cfu·mL-1時(shí),同一益生菌菌體濃度條件下,不同共培養(yǎng)時(shí)間各組間PK-15細(xì)胞存活率差異不顯著;當(dāng)益生菌菌體濃度108cfu·mL-1

    當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間1 h≤t≤24 h時(shí),對(duì)不同益生菌菌體濃度PK-15細(xì)胞存活率作組間差異性比較,結(jié)果見表4。

    由4可知,當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間1 h≤t≤24 h時(shí),益生菌菌體濃度為102、106和108cfu·mL-1三組間PK-15細(xì)胞存活率差異不顯著,但均顯著高于其余各益生菌菌體濃度組PK-15細(xì)胞存活率。

    綜上所述,當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間1 h≤t≤24 h時(shí),益生菌菌體濃度為102、106和108cfu·mL-1,益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)成立。

    表3 同一益生菌菌體濃度不同共培養(yǎng)時(shí)間PK-15細(xì)胞存活率比較(M ean±SD)Table3 Comparison of PK-15 cells survival rate of the same concentration of probiotics and different time of co-culture(%)

    表4 不同益生菌菌體濃度PK-15細(xì)胞存活率組間比較(M ean±SD)Table 4 Comparison of PK-15 cells survival rate of different concentration of probiotics

    2.2益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)TGEV抑制率測(cè)定

    不同濃度益生菌菌體與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)3 h后,加TGEV作用1.5 h,MTT比色法測(cè)OD490值,根據(jù)公式計(jì)算TGEV抑制率,并繪制TGEV抑制率隨益生菌菌體濃度變化曲線,結(jié)果見圖1。

    圖1 不同濃度益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)TGEV抑制率變化曲線Fig.1 TGEV inhibition rate curve of different concentrations of probiotics and PK-15 cells co-culture

    由圖1可知,TGEV抑制率隨益生菌菌體濃度增加先升后降。不同益生菌菌體與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng),對(duì)TGEV抑制率存在差異,枯草芽孢桿菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,當(dāng)菌體濃度為1010cfu·mL-1時(shí),對(duì)TGEV抑制率達(dá)到峰值為87.4%;屎腸球菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,當(dāng)菌體濃度為106cfu·mL-1時(shí),對(duì)TGEV抑制率達(dá)到峰值為80.95%;食淀粉乳桿菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,當(dāng)菌體濃度為108cfu·mL-1時(shí),對(duì)TGEV抑制率達(dá)到峰值為80.39%。綜合比較每組對(duì)TGEV平均抑制率為:枯草芽孢桿菌組(53.97%)>屎腸球菌組(52.32%)>食淀粉乳桿菌組(41.86%)。

    綜上所述,當(dāng)益生菌菌體濃度約為108cfu·mL-1時(shí),對(duì)TGEV抑制率較高,因此108cfu·mL-1為益生菌最佳濃度。

    濃度為108cfu·mL-1益生菌菌體與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間,加TGEV作用1.5 h,MTT比色法,測(cè)OD490,根據(jù)公式計(jì)算對(duì)TGEV抑制率,并繪制TGEV抑制率隨共培養(yǎng)時(shí)間變化曲線,結(jié)果見圖2。

    圖2 益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)TGEV抑制率變化曲線Fig.2 TGEV inhibition rate curve of probiotics and PK-15 cells different time of co-culture

    由圖2可知,TGEV抑制率隨共培養(yǎng)時(shí)間呈先升后降趨勢(shì)。益生菌菌體與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間,對(duì)TGEV抑制率存在差異,枯草芽孢桿菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至12 h時(shí),對(duì)TGEV抑制率達(dá)到峰值為86.49%;屎腸球菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至18 h時(shí),對(duì)TGEV抑制率達(dá)到峰值為93%;食淀粉乳桿菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至12 h時(shí),對(duì)TGEV抑制率達(dá)到峰值為68.81%。綜合比較,每組對(duì)TGEV平均抑制率為:枯草芽孢桿菌組(50.21%)>屎腸球菌組(48.36%)>食淀粉乳桿菌組(40.92%)。

    綜上所述,當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至12 h時(shí),對(duì)TGEV抑制率較高,因此12 h為最佳共培養(yǎng)時(shí)間。

    2.3益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)TGEV滴度測(cè)定

    濃度為108cfu·m L-1益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后,接種TGEV作用1.5 h,洗滌后加細(xì)胞維持液,不同時(shí)間點(diǎn)收集病毒液,按Reed-Muench兩氏法計(jì)算TGEV滴度。以收集TGEV時(shí)間為橫坐標(biāo),半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量負(fù)對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),繪制TGEV滴度變化曲線,結(jié)果見圖3。

    圖3 益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)TGEV滴度變化曲線Fig.3 TGEV titer curve of probiotics and PK-15 cells co-culture

    由圖3可知,TGEV半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量負(fù)對(duì)數(shù)隨收集病毒液時(shí)間呈先升后降趨勢(shì)。益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng),不同時(shí)間點(diǎn)收集TGEV,其滴度差異顯著。枯草芽孢桿菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,48 h收集TGEV,其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量負(fù)對(duì)數(shù)達(dá)到峰值為3.87;屎腸球菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,24 h收集TGEV,其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量負(fù)對(duì)數(shù)達(dá)到峰值為5.16;食淀粉乳桿菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,48 h收集TGEV,其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量負(fù)對(duì)數(shù)達(dá)到峰值為4.55。綜合比較,每組TGEV平均滴度為:枯草芽孢桿菌組(102.70)<屎腸球菌組(102.85)<食淀粉乳桿菌組(102.92)<正常病毒對(duì)照組(103.46)。

    綜上所述,益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)能降低TGEV滴度,降低程度為:枯草芽孢桿菌組>屎腸球菌組>食淀粉乳桿菌組。

    3 討論

    3.1益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)建立

    杜維霞等利用Caco-2腸上皮細(xì)胞單層屏障模型,研究四種腸道微生物對(duì)腸道屏障影響,檢測(cè)細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)體系中緊密連接蛋白表達(dá)和分布,結(jié)果致病菌組(大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌)緊密連接蛋白表達(dá)明顯減少;益生菌組表達(dá)與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯變化,說(shuō)明致病菌降低緊密連接蛋白表達(dá)、改變蛋白分布,最終導(dǎo)致腸道屏障功能受損;益生菌對(duì)腸道屏障無(wú)損傷作用[9]。Georgia等利用體外Transwell共培養(yǎng)模型,研究細(xì)菌與鼠源腸上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)相互作用,發(fā)現(xiàn)益生菌能顯著增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞活性,證實(shí)細(xì)胞趨化因子作用,而金黃色葡萄球菌作用效果不明顯;益生菌可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞分化、成熟[10]。細(xì)菌穿越物理屏障誘導(dǎo)pro-inflammatory信號(hào)能力與其致病性和共生狀態(tài)無(wú)關(guān),依賴特殊表面“物質(zhì)”即脂多糖。為模擬腸道環(huán)境,研究益生菌與細(xì)胞相互作用,尤其是益生菌對(duì)細(xì)胞有益作用,建立益生菌與細(xì)胞共培養(yǎng)模型十分必要。本試驗(yàn)以PK-15細(xì)胞為平臺(tái),建立益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)模型,探索共培養(yǎng)條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)益生菌菌體濃度102cfu·mL-1≤c≤1012cfu·mL-1,共培養(yǎng)時(shí)間為1或3 h;當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間1 h≤t≤24 h,益生菌菌體濃度為102、106和108cfu·mL-1時(shí),PK-15細(xì)胞存活率較高,表明益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)成立。

    杜維霞等研究側(cè)重于與致病菌相比,益生菌對(duì)腸道屏障無(wú)損傷作用[9]。Georgia等研究側(cè)重于機(jī)理方面[10]。而本試驗(yàn)側(cè)重于探索益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)條件,為益生菌與細(xì)胞共培養(yǎng)抗病毒相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。細(xì)胞平臺(tái),應(yīng)選用更加貼近腸道內(nèi)環(huán)境IPEC-J2細(xì)胞,體外建立益生菌與IPEC-J2細(xì)胞共培養(yǎng)模型,探索益生菌與IPEC-J2細(xì)胞共培養(yǎng)條件。目前難以建立益生菌與腸黏膜細(xì)胞共培養(yǎng)模型原因:①益生菌是兼性厭氧甚至絕對(duì)厭氧,腸黏膜細(xì)胞為5%CO2,無(wú)體外共培養(yǎng)試驗(yàn)裝置;②益生菌適宜培養(yǎng)基是MRS液體培養(yǎng)基,腸黏膜細(xì)胞為DMEM/F-12 1:1+10%FBS,現(xiàn)有培養(yǎng)基無(wú)法同時(shí)滿足體外共培養(yǎng)需求;③益生菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗大于腸黏膜細(xì)胞,共培養(yǎng)使腸黏膜細(xì)胞處于乏養(yǎng)狀態(tài);④益生菌代謝速度遠(yuǎn)大于腸黏膜細(xì)胞,代謝產(chǎn)物積累,形成過(guò)酸環(huán)境,容易損傷腸黏膜細(xì)胞;⑤腸道環(huán)境復(fù)雜,存在多種益生菌,代謝產(chǎn)物豐富,相互作用,血液循環(huán)能給腸黏膜細(xì)胞提供足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和穩(wěn)定pH環(huán)境,腸黏膜本身分泌黏液對(duì)腸黏膜細(xì)胞形成保護(hù)層等。建議延長(zhǎng)共培養(yǎng)時(shí)間為2和3 d甚至更長(zhǎng)時(shí)間,增加更換細(xì)胞培養(yǎng)基頻次或使用帶有進(jìn)出孔可使細(xì)胞培養(yǎng)基流動(dòng)的裝置。

    3.2益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV效果評(píng)價(jià)

    研究多集中在單一利用益生菌菌體(如活菌體、滅活菌體、破碎菌體等)、某些成分(如S-層蛋白)或代謝產(chǎn)物(如所有培養(yǎng)上清、提取單獨(dú)胞外多糖等)與細(xì)胞短暫作用評(píng)價(jià)益生菌對(duì)細(xì)胞抗病毒作用效果。由于作用時(shí)間短且單獨(dú)某一時(shí)間點(diǎn),益生菌不同培養(yǎng)時(shí)間產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)不同,無(wú)法完全反映益生菌對(duì)細(xì)胞抗病毒作用影響。鑒于PK-15細(xì)胞是TGEV易感細(xì)胞,本試驗(yàn)在益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)基礎(chǔ)上,模擬豬腸道內(nèi)益生菌與細(xì)胞相互作用動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,進(jìn)行抗TGEV效果評(píng)價(jià),主要針對(duì)兩方面檢測(cè):①通過(guò)測(cè)定PK-15細(xì)胞活性即OD490間接計(jì)算共培養(yǎng)對(duì)TGEV抑制率;②測(cè)定TGEV滴度即TCID50直接反映共培養(yǎng)對(duì)TGEV作用。結(jié)果表明,益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)具有抗TGEV作用,表現(xiàn)為對(duì)TGEV抑制率升高,降低TGEV滴度,不同益生菌菌株與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)具有不同抗TGEV作用效果,表現(xiàn)為枯草芽孢桿菌組>屎腸球菌組>食淀粉乳桿菌組,說(shuō)明益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用具有菌株差異性,推測(cè)可能與益生菌菌株自身結(jié)構(gòu)有直接關(guān)系。需改進(jìn)之處是增設(shè)動(dòng)物性試驗(yàn),供試仔豬可全面評(píng)價(jià)益生菌與細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用效果。目前,益生菌抗TGEV機(jī)制尚不清楚,后續(xù)將深入研究。

    4 結(jié)論

    本試驗(yàn)通過(guò)Transwell小室,利用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)PK-15細(xì)胞存活率,初步摸索共培養(yǎng)條件,即當(dāng)益生菌菌體濃度102cfu·mL-1≤c≤1012cfu·mL-1,共培養(yǎng)時(shí)間為1和3 h;當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為1 h≤t≤24 h,益生菌菌體濃度為102、104、106和108cfu·mL-1時(shí),益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)成立。在此基礎(chǔ)上,檢測(cè)益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)TGEV抑制率和滴度變化,評(píng)價(jià)益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)抗TGEV作用效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)益生菌與PK-15細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)TGEV有抑制作用,能降低TGEV滴度,組抗TGEV作用效果枯草芽孢桿菌>屎腸球菌組>食淀粉乳桿菌組。

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    Anti-TGEV effect of three probiotics strains and PK-15 cells co
    culture/WEI Ping1,LIU Wenna1,WANG Huihui2
    (1.School of Veterinary Medicines,Northeast

    Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Animal Husbandry Comprehensive Service Station of Dayangshu,Oroqen Autonomous Banner,Hulunbeir Inner Mongolia 165456,China)

    In order to simulate the porcine intestinal environment and explore the anti-TGEV effect of probiotics and cells co-culture,this experiment used Transwell to establish probiotics and PK-15 cells coculture in vitro.In addition,this test took advantage of trypan blue staining to detect the PK-15 cells survival rates.The results showed that the PK-15 cells survival rates were higher under the conditions of 102cfu·mL-1≤the concentration of probiotics≤1012cfu·mL-1,1,3 h of co-culture time or 1 h≤the time of co-culture≤24 h, 102,104,106and 108cfu·mL-1of probiotics concentration.On this basis,this experiment made use of MTT colorimetric assay to detect the TGEV inhibition rates.The results showed that the TGEV inhibition rates were more than 90%when the concentration of probiotics was about 102-108cfu·mL-1and the time of coculture was about 1-24 h.Furthermore,the TGEV average titer of probiotics and PK-15 cells co-culture was lower.

    probiotics;PK-15 cells;co-culture;anti-TGEV

    S858.28

    A

    1005-9369(2016)06-0060-08

    2016-04-14

    黑龍江省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(12521z001);哈爾濱市科技局項(xiàng)目(2014RFXGJ096)

    魏萍(1961-),男,教授,博士,研究方向?yàn)楂F醫(yī)傳染病學(xué)與流行病學(xué)。E-mail:weiiping@163.com

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