常見病原菌基因組DNA快速提取試劑盒研制

曹飛揚，王　娉，趙曉美，談　笑，李　菲，江連洲，陳　穎*（.中國檢驗檢疫科學研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心，北京0076；.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱50030）

常見病原菌基因組DNA快速提取試劑盒研制

曹飛揚1,2，王娉1，趙曉美1，談笑1，李菲1，江連洲2，陳穎1*
（1.中國檢驗檢疫科學研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心，北京100176；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，哈爾濱150030）

以單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等6種常見食源性致病菌為研究對象，優(yōu)化試劑盒工藝參數(shù)，采用瓊脂糖凝膠電泳及OD260/OD280分析基因組DNA提取效果。結(jié)果表明，試驗試劑盒可在30m in內(nèi)完成基因組DNA提取，對常見10類食品樣品抗基質(zhì)干擾能力強。與實時熒光PCR技術聯(lián)用，檢測染菌量1~10 cfu·25 g-1食品樣品時，僅一次增菌可得陽性結(jié)果；市售食品樣品檢測與國標方法結(jié)果無顯著差異。所研制病原菌基因組DNA提取試劑盒適用于食品病原菌快速檢測。

食源性致病菌；基因組DNA；提取試劑盒；快速

網(wǎng)絡出版時間2016-06-20 08:53[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160620.0853.002.htm l

Cao Feiyang,Wang Ping,Zhao Xiaomei,et al.Preparation of rapid extraction kit of genomic DNA from common pathogens [J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(6):81-88.(in Chinese with English abstract)

由病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全主要因素。食品生產(chǎn)和消費過程中病原微生物檢測和監(jiān)管對保障食品安全尤為重要。目前，食源性致病菌以傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測為主，耗時長且無法實現(xiàn)快速檢測。分子生物學技術是食源性致病菌快速檢測主要方向[1-3]。而食源性致病菌基因組DNA快速提取方法，是分子生物學技術在食品中應用關鍵，對快速檢測食源性致病菌具有重要意義。

目前常用病原菌基因組DNA提取方法主要有酚-氯仿法、離心柱法等，提取病原菌基因組DNA質(zhì)量較好，但提取速率有待提高。以磁珠為載體的DNA提取基于修飾基團磁珠在一定條件下可吸附DNA，而在水或TE溶液中可被解吸附原理，簡化分離純化、提高DNA提取效率。磁珠純化法操作簡單，有利于病原菌DNA自動化和高通量提取[4]，是快速提取病原菌DNA方法發(fā)展方向。高秋月通過對大腸桿菌O157?H7基因組DNA快速提取方法研究[5]，發(fā)現(xiàn)以磁珠為載體提取DNA可實現(xiàn)基因組DNA高效純化，但未評價提取DNA純度、革蘭氏陽性菌提取效果，適用范圍受限。

本研究以單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157?H7、克羅諾桿菌、志賀氏菌6種常見病原菌為研究對象，以磁珠為載體，優(yōu)化試劑盒工藝參數(shù)、與市售試劑盒比較、抗干擾試驗、模擬添加病原菌樣品檢測、實際樣品檢測等，研究病原菌基因組DNA快速提取試劑盒，為常見病原菌快速檢測提供參考。

1　材料與方法

1.1菌株

試驗用菌株由中國檢驗檢疫科學研究院微生物菌種保藏管理中心（IQCC）提供10株食品分離菌株和8株國際通用參考菌株。其中3株單核細胞增生李斯特菌，編號為IQCC42222、IQCC42223、IQCC42224；3株金黃色葡萄球菌，編號為ATCC25923、ATCC27217、ATCC13565；3株沙門氏菌，編號為IQCC10546、IQCC10547、IQCC10548；3株大腸桿菌O157?H7分離菌株，編號為IQCC10102、IQCC10103、IQCC10104；3株克羅諾桿菌，編號為ATCC29544、ATCC51329、IQCC10442；3株志賀氏菌，編號為ATCC12022、ATCC25931、ATCC9207。

1.2食品樣品

乳制品：奶粉、純牛奶、酸奶；肉制品：豬肉、羊肉、牛肉、雞肉；飲料類：碳酸飲料、茶飲料；糧谷類制品：面片、饅頭、菜包、湯圓；蛋制品：雞蛋；水產(chǎn)制品：金槍魚；巧克力類：巧克力；果蔬類：黃桃罐頭；調(diào)味品類：沙拉醬；堅果類：核桃仁；涵蓋10大類樣品基質(zhì)。

1.3主要試劑與儀器

腦心浸液肉湯（Brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基、李氏增菌肉湯、7.5%氯化鈉肉湯、緩沖蛋白胨水（Buffered peptone water，BPW）、改良EC肉湯、志賀氏菌增菌肉湯、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、Baird-Parker平板、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、山梨醇麥康凱（SMAC）瓊脂、阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術股份有限公司；羧基化磁珠（0.82 μm）、氨基化磁珠（1.16μm）購自美國ACME公司；細胞裂解液（70mmol·L-1SDS,50mmol·L-1EDTA，0.1 mol·L-1Tris-HCl，pH 8.0）；Wizard Genomic DNA Purification Kit（美國Promega公司）；TIANamp Bacteria DNA Kit（天根生化科技有限公司）；臺式冷凍離心機（德國Sorvall公司）；DU640核酸蛋白分析儀（德國Beckman公司）；MODEL 200/2.0 POWER SUPPLY電泳儀、VersaDoc分子凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）；7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；PhoenixTM-100全自動微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)（美國BD公司）。

引物和探針，單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等6種病原菌引物、探針參照行業(yè)標準SN/T 1870-2007[6]、SN/T 1632.3-2013[7]，由上海生物工程公司合成。

1.4方法

1.4.1菌株培養(yǎng)

各菌株接種在5mLBHI液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。

1.4.2DNA提取方法

取1mL過夜培養(yǎng)菌液12 000 r·min-1離心1 min收集細胞，棄上清；1mL生理鹽水清洗，12 000 r·min-1離心1min，棄上清；加入600μL細胞裂解液、5μL蛋白酶K，混勻后65°C溫育5~25 min（對于革蘭氏陽性菌需在此步驟前加入480μL EDTA（50mmol·mL-1）及120μL溶菌酶（10mg·mL-1）共同消化以有效裂解）；加入10~100μL磁珠、600μL異丙醇，震蕩后置于磁力架2min，棄上清；加入200μL ddH2O，震蕩后置于磁力架5min，吸取上清至新管中；加入400μL無水乙醇，輕輕顛倒后12 000 r·min-1離心2min，棄上清；加入1 m L 70%乙醇，輕輕顛倒后12 000 r·min-1離心2min，棄上清；烘干后加入100μL TE緩沖液，輕輕吸放混勻備用。

1.4.3試劑盒工藝參數(shù)優(yōu)化

本研究選取磁珠種類、磁珠添加量、溫育時間3個因素做單因素試驗，瓊脂糖凝膠電泳、OD260/OD280評價DNA提取效果，確定最佳工藝條件。磁珠分別為粒徑最優(yōu)羧基化磁珠（0.82μm）和氨基化磁珠（1.16μm）；磁珠添加量分別為12.5、25、50和100μL；溫育時間分別為5、10、15、20和25min。

1.4.4試劑盒組裝

本研究病原菌基因組DNA快速提取試劑盒由磁珠（6 mL）、細胞裂解液（8 mL）、蛋白酶K（20 mg·mL-1，1mL）及TE緩沖液（15mL）組成。

1.4.5與市售試劑盒比較

取1mL菌株培養(yǎng)物按照本試驗試劑盒提取方法，Promega、天根試劑盒說明書提取基因組DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳、OD260/OD280比較DNA質(zhì)量。

1.4.6抗干擾試驗

分別將單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等6種病原菌接種奶粉、豬肉等10類食品樣品10倍稀釋液中，均質(zhì)處理（接種后單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌濃度為107cfu·mL-1，沙門氏菌、大腸桿菌0157?H7、克羅諾桿菌、志賀氏菌濃度為109cfu·mL-1）。按照本試驗試劑盒提取方法提取均質(zhì)液及無食品基質(zhì)等濃度6種病原菌DNA，核酸蛋白分析儀測定DNA濃度。

1.4.7模擬添加病原菌樣品檢測

奶粉、豬肉等10類食品樣品在人工污染前，按照GB 4789.30-2010[8]、GB 4789.10-2010[9]、GB 4789.4-2010[10]、GB/T 4789.36-2008[11]、GB 4789.40-2010[12]、GB 4789.5-2012[13]分別驗證其是否含有單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌0157?H7、克羅諾桿菌、志賀氏菌。將上述6種病原菌分別以10~100 cfu·25 g-1樣品、1~10 cfu·25 g-1樣品濃度人工接種到食品樣品中，按照上述國家標準一次增菌后，本試驗試劑盒提取病原菌DNA，并與實時熒光PCR技術聯(lián)用，檢測增菌后食品樣品。實時熒光PCR反應體系和擴增條件參照行業(yè)標準SN/T 1870-2007[6]、SN/T 1632.3-2013[7]。

1.4.8實際樣品檢測

按照1.4.7方法對涵蓋乳制品、肉制品、飲料類及糧谷類制品40份實際樣品中的單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等6種病原菌檢測，并與國家標準對比。

1.4.9統(tǒng)計分析

40份實際樣品檢測中，χ2檢驗分析本試驗試劑盒與實時熒光聯(lián)用方法檢測結(jié)果與國標方法間顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1試劑盒工藝參數(shù)優(yōu)化

2.1.1磁珠種類對DNA提取效果影響

在磁珠添加量50μL、溫育時間20min條件下，分別對比羧基化磁珠和氨基化磁珠對病原菌基因組DNA提取效果影響。羧基化磁珠提取DNA電泳條帶比氨基化磁珠提取DNA電泳條帶亮（見圖1），說明羧基化磁珠提取病原菌DNA濃度較高。

因為羧基化磁珠可與蛋白氨基修飾核酸共價結(jié)合[5]；氨基化磁珠因其帶正電荷，可與磷酸骨架帶負電荷DNA非特異結(jié)合[14]；共價結(jié)合力比正負電荷結(jié)合力強。羧基化磁珠和氨基化磁珠提取病原菌DNA的OD260/OD280均在1.8~1.9，說明這兩種磁珠提取病原菌DNA純度差別小。綜合試驗結(jié)果選擇羧基化磁珠。

2.1.2磁珠添加量對DNA提取效果影響

在溫育時間20min、羧基化磁珠條件下，分別對比磁珠添加量為12.5、25、50和100μL時病原菌DNA提取效果。磁珠添加量對病原菌DNA純度影響較小（OD260/OD280均在1.8~1.9），對電泳條帶亮度影響較大。磁珠添加量從12.5μL增加到100μL，同一菌株電泳條帶亮度呈先增后減趨勢，磁珠添加量為50μL時，試驗菌株電泳條帶最亮、DNA濃度最高（見圖2）。原因是磁珠添加量小，磁珠對DNA吸附不徹底，提取DNA濃度較??；磁珠添加量大，磁珠團聚現(xiàn)象嚴重，磁珠對DNA吸附效率降低；洗脫緩沖液TE對DNA洗脫效率下降，提取DNA濃度較小。綜合考慮，選擇磁珠添加量為50μL。

2.1.3溫育時間對DNA提取效果影響

在羧基化磁珠、添加量為50μL條件下，分別對比溫育時間5、10、15、20和25min時病原菌基因組DNA提取效果。溫育時間對病原菌DNA純度影響較?。∣D260/OD280均在1.8~1.9），對電泳條帶亮度影響較大。溫育時間從5到10min時，電泳條帶亮度顯著增強；從10到25min時，電泳條帶亮度變化不大。因為溫育時間5min時，細胞裂解液與細菌作用時間較短，菌株裂解不充分；溫育時間10min時，菌株已充分裂解；溫育時間再延長，菌株裂解量增加幅度較?。ㄒ妶D3）?？紤]DNA提取效率問題，選擇溫育時間10min。

圖1　不同種類磁珠對DNA提取效果影響Fig.1 Effect of different kinds of magnetic beads on DNA extraction

圖2　不同磁珠添加量對DNA提取效果影響Fig.2 Effect of different magnetic bead quantity on DNA extraction

綜合單因素試驗結(jié)果，最優(yōu)工藝條件是羧基化磁珠、添加量50μL、溫育時間10min。最優(yōu)工藝條件下，病原菌基因組DNA質(zhì)量較高，可在30 min內(nèi)完成病原菌基因組DNA提取。

2.2與市售試劑盒提取效果比較

通過比較天根試劑盒、Promega試劑盒提取DNA質(zhì)量，考查本試驗試劑盒DNA提取效果。由電泳結(jié)果（見圖4）可知，本試驗試劑盒與天根試劑盒、Promega試劑盒提取病原菌DNA濃度無顯著差異，這3種試劑盒提取DNA純度相差較?。∣D260/ OD280均在1.8~1.9），說明本試驗試劑盒磁珠純化方法與市場同類商品提取效果相當。

圖3　不同溫育時間對DNA提取效果影響Fig.3 Effect of different incubation time on DNA extraction

圖4　本試驗試劑盒與兩種市售試劑盒提取DNA電泳Fig.4 Electrophoretic results of genomic DNA extracted by the developed kit and two commercial kits

2.3抗干擾試驗結(jié)果

通過抗干擾試驗，食品基質(zhì)對本試驗試劑盒DNA提取效果影響。對單增李斯特菌，巧克力DNA回收率（食品基質(zhì)/無食品基質(zhì)）最低29.32%、蘋果汁最高65.44%；金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157?H7、克羅諾桿菌、志賀氏菌DNA回收率分別是28.23%~65.45%、35.02%~ 64.68%、30.20%~62.46%、27.73%~66.88%、31.26%~ 67.37%（見表1），6種病原菌在10類食品樣品中DNA回收率均較高，說明本試驗試劑盒抗基質(zhì)干擾能力強，可用于食品病原微生物DNA提取。

表1　本試驗試劑盒抗干擾性Tab le1 Anti-jamming capability of the developed kit(μg·m L-1)

2.4模擬添加病原菌樣品檢測結(jié)果

在食品樣品中模擬添加不同染菌量病原菌，并通過本試驗試劑盒與實時熒光PCR聯(lián)用檢測，對比本試驗試劑盒與實時熒光PCR聯(lián)用檢測靈敏度。奶粉、豬肉等10類食品樣品在染菌量為10~ 100 cfu·25 g-1樣品、1~10 cfu·25 g-1樣品時，均可檢測出6種病原菌陽性結(jié)果，說明本試驗試劑盒與實時熒光PCR技術聯(lián)用檢測靈敏度可達1~10 cfu·25 g-1樣品。本研究僅給出金黃色葡萄球菌（該菌為革蘭氏陽性菌，比革蘭氏陰性菌細胞壁厚、DNA提取難度大）在染菌量1~10 cfu·25 g-1樣品時檢測結(jié)果（見圖5），其他檢測結(jié)果未給出。

圖5　模擬添加金黃色葡萄球菌樣品檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of samples added by Staphylococcus aureus

2.5實際樣品檢測結(jié)果

在40份市售樣品中，本試驗試劑盒與實時熒光PCR聯(lián)用檢出6份樣品單增李斯特菌陽性，7份樣品金黃色葡萄球菌陽性，5份樣品沙門氏菌陽性，4份樣品大腸桿菌O157?H7陽性，3份樣品克羅諾桿菌陽性，6份樣品志賀氏菌陽性；傳統(tǒng)國標檢測方法檢出3份樣品單增李斯特菌陽性，3份樣品金黃色葡萄球菌陽性，1份樣品沙門氏菌陽性，1份樣品大腸桿菌O157?H7陽性，2份樣品克羅諾桿菌陽性，1份樣品志賀氏菌陽性（見表2）。

經(jīng)χ2檢驗發(fā)現(xiàn)，6種病原菌P>0.05，本試驗試劑盒與實時熒光PCR聯(lián)用方法檢測結(jié)果與傳統(tǒng)國標法無顯著差異，說明本試驗試劑盒與實時熒光PCR聯(lián)用方法檢測準確度較高。

同時，以國標方法檢測病原菌樣品，本試驗試劑盒與實時熒光PCR聯(lián)用方法均可檢出，且病原菌檢出率高于國標方法，因聯(lián)用方法可檢測出死亡或不可培養(yǎng)病原菌[15]。

表2　實際樣品檢測結(jié)果Tab le2 Detection results of commercial samples

3　討論與結(jié)論

以分子生物學技術快速檢測食源性致病菌時，提取病原菌基因組DNA質(zhì)量是影響檢測結(jié)果因素之一。常規(guī)DNA提取方法通常使用有機溶劑酚、氯仿等去除蛋白質(zhì)、脂肪、多糖等，有機溶劑殘留影響檢測結(jié)果。本試驗食品常見病原菌DNA快速提取試劑盒，以磁珠為載體，有效去除抑制物，適用于低含量病原菌DNA提取。與實時熒光PCR技術聯(lián)用，可實現(xiàn)食品中病原菌快速檢測，減少快速檢測中假陰性結(jié)果產(chǎn)生。

磁珠種類、磁珠添加量及溫育時間是影響DNA純化效果關鍵因素。試劑盒在最優(yōu)工藝參數(shù)下可在30min內(nèi)完成病原菌基因組DNA提取，提取效率明顯高于常用試劑盒，提取質(zhì)量與市售試劑盒相當。

本試驗試劑盒與實時熒光PCR技術聯(lián)用以10大類食品作為試驗樣本，實現(xiàn)對6種病原菌快速檢測，抗基質(zhì)干擾能力強、應用范圍較廣。姜彥君等采用三重PCR方法快速檢測3種病原菌，但檢測樣品僅局限于肉制品[16]；O'Grady等采用實時熒光PCR方法實現(xiàn)對多種食品基質(zhì)中單增李斯特菌檢測，但僅適用于一種病原菌[17]；本試驗試劑盒應用范圍較Zhang[18]、Rossmanith[19]等建立PCR方法廣泛。在模擬添加病原菌試驗中，檢測靈敏度達1~10 cfu·25 g-1樣品，與Bian、Ma等建立PCR體系檢測結(jié)果接近[20-21]，高于王文娟等建立PCR檢測體系[22]。

為進一步驗證本試驗試劑盒與實時熒光PCR聯(lián)用方法檢測準確性，本研究與國家標準方法對比檢測乳制品、肉制品等40份實際樣品，經(jīng)χ2檢驗發(fā)現(xiàn)本試驗試劑盒與實時熒光PCR聯(lián)用方法檢測結(jié)果與國標法無顯著差異，說明本試驗試劑盒提取病原菌DNA質(zhì)量較高，與PCR技術聯(lián)用檢測準確度高。

綜上所述，本試驗試劑盒提取效率高，與實時熒光PCR技聯(lián)用適用于食品病原菌準確、快速檢測。為食品監(jiān)測及快速診斷上述6種病原菌提供技術手段，應用前景良好。

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Preparation of rapid extraction kit of genomic DNA from common
pathogens/CAO Feiyang1,2,WANG Ping1,ZHAO Xiaomei1,TAN Xiao1,LI Fei1,JIANG

Lianzhou2,CHEN Ying1
(1.Agro-product Safety Research Center,Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing 100176,China;2.School of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

This study analyzed extraction quality of genomic DNA by agarose gel electrophoresis and OD260/OD280to optimize technology parameters of kit,focusing on six kinds of common food-borne pathogens,such as Listeria monocytogenes,Staphylococcus aureus,etc.The result showed that the extraction of genomic DNA could be finished in 30 min by the developed kit,and its anti-jamming capability was also strong in 10 categories of common food matrixes.The detection limits of the six kinds of pathogens could reach 1-10 cfu·25 g-1samples by one enrichment culture based on real-time PCR.The detection results of commercial samples by the developed kit were consistent with GB detection.It can be used for rapid detection of pathogens in food.

food-borne pathogens;genomic DNA;extraction kit;rapid

TS207.4

A

1005-9369（2016）06-0081-08

2016-04-01

國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B11）

曹飛揚（1989-），男，碩士，研究方向為食品質(zhì)量安全檢測與控制。E-mail:feiyangc@163.com

陳穎，研究員，研究方向為食品質(zhì)量安全與控制。E-mail:chenyingcaiq@163.com