牛eIF5基因原核表達(dá)與蛋白純化

高學(xué)軍，臧艷麗，魏誠杰，駱超超（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省高校農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

牛eIF5基因原核表達(dá)與蛋白純化

高學(xué)軍，臧艷麗，魏誠杰，駱超超
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省高校農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

研究應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增牛eIF5基因編碼序列，通過Eco RⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)將其定向插入pGEX-4T-1載體，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-eIF5，并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21。酶切和測(cè)序鑒定正確后，用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）大量誘導(dǎo)表達(dá)，利用GST-Sepharose 4B親和珠純化，SDS-PAGE和Western Blot鑒定。結(jié)果表明，原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-eIF5構(gòu)建成功，Western Blot證實(shí)融合蛋白大量表達(dá)，純化后獲得GST-eIF5融合蛋白，為深入研究牛eIF5蛋白功能奠定基礎(chǔ)。

牛；eIF5；克??；原核表達(dá)；純化

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2016-6-17 15:21:53[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160617.1521.012.htm l

高學(xué)軍,臧艷麗,魏誠杰,等.牛e IF5基因原核表達(dá)與蛋白純化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(6):68-73.

Gao Xuejun,Zang Yanli,Wei Chengjie,et al.Prokaryotic expression and protein purification of gene bovineeIF5[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(6):68-73.(in Chinese with English abstract)

真核生物翻譯起始因子（Eukaryotic translation initiation factor，eIF）主要有eIF1、eIF2、eIF2B、eIF3、eIF4A和eIF5等[1]。真核生物翻譯是將遺傳信息從mRNA傳遞到蛋白質(zhì)過程，包括起始、延伸和終止，大多數(shù)翻譯調(diào)節(jié)均作用于起始步驟[2-4]。Maag等研究表明，在翻譯起始過程中，核糖體復(fù)合物識(shí)別到mRNA上正確起始位點(diǎn)至少需要12種真核生物因子共同作用[5]。研究表明，eIF2、eIF5和eIF1在這一進(jìn)程中發(fā)揮主要作用[6-8]。43S核糖體亞基由40S亞基和多重復(fù)合物（Multifactor com?plex，MFC）組成，包括eIF2-GTP-（Met-tRNAiMet）三元復(fù)合物、eIF3、eIF1、eIF1A和eIF5[9]。MFC結(jié)合40S核糖體亞基后，GTP酶催化蛋白eIF5催化eIF2上GTP水解為GDP[10-11]。當(dāng)Met-tRNAiMet和mRNA上密碼子與反密碼子配對(duì)后，eIF2-GDP和無機(jī)磷酸鹽從核糖體48S亞基上釋放[12]。結(jié)果顯示，eIF5-eIF2-GDP復(fù)合物中eIF5和eIF2一起釋放后，48S核糖體亞基結(jié)合60S亞基形成80S起始復(fù)合體，蛋白質(zhì)合成延伸步驟啟動(dòng)[13-16]。

eIF5編碼序列大多為1 300個(gè)核苷酸，編碼約430個(gè)氨基酸殘基多肽，進(jìn)化過程高度保守。近來發(fā)現(xiàn)，eIF5還參與細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)過程。于翠平等研究指出14-3-3γ可正向調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞增殖，通過免疫共沉淀、免疫熒光共定位分析和熒光能量共振轉(zhuǎn)移試驗(yàn)分析表明，14-3-3γ蛋白與eIF5蛋白存在直接相互作用[17]；駱超超等研究表明，甘氨酰tRNA合成酶（Glycyl-tRNA synthetase，GlyRS）能正向調(diào)節(jié)乳蛋白合成和細(xì)胞增殖，GlyRSCo-IP質(zhì)譜結(jié)果顯示，GlyRS在胞漿中與eIF5結(jié)合，說明eIF5在奶牛泌乳調(diào)控中可能發(fā)揮重要作用[18]。為深入研究eIF5在真核生物翻譯過程作用機(jī)制及在奶牛乳腺泌乳中信號(hào)調(diào)節(jié)作用，本研究利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建eIF5基因原核表達(dá)載體，在大腸埃希菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)其融合蛋白并純化，為eIF5蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1載體和細(xì)胞

表達(dá)載體pGEX-4T-1和大腸埃希菌BL21為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省高校農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；奶牛乳腺上皮細(xì)胞樣品取自哈爾濱市雙城區(qū)連發(fā)屠宰場(chǎng)，健康泌乳期中國荷斯坦奶牛，取乳腺組織原代培養(yǎng)，經(jīng)純化培養(yǎng)后傳5~15代。

1.1.2試劑

Prime ScriptTMRT reagent Kit、Reverse Tran?scriptase M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶（Eco RⅠ、SalⅠ）、PrimeSTAR?HSDNA Polymerase、T4DNA連接酶和DNA Marker（DL2000、DL10000）購自TaKaRa公司（大連）；TRIzol試劑購自Life tech?nologies，Invitrogen公司（美國）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒DNA小量試劑盒購自Axygen生物技術(shù)公司（美國）；引物片段均由Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成（上海）；核酸測(cè)序由華大基因科技有限公司完成（北京）；氨芐青霉素（Amp）購自生工生物工程股份有限公司（上海）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（2×）、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒和GST抗體購自碧云天生物技術(shù)有限公司（北京）；eIF5抗體購自Santa Cruz公司（美國）；HRP標(biāo)記二抗購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司（北京）；ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購自普利萊基因技術(shù)有限公司（北京）；GSTMicrospin Purification kit購自中科晨宇生物科技公司（北京）；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo公司（美國）；超凈工作臺(tái)購自安泰空氣技術(shù)有限公司（蘇州）；DFC280型倒置相差顯微鏡購自Leica公司（德國）；PCR儀購自Biometra公司（德國）；恒溫金屬浴購自博日科技有限公司（杭州）；凝膠成像系統(tǒng)購自UVP公司（美國）；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和DYCZ-23A型穩(wěn)壓電泳槽購自六一儀器廠（北京）；-80℃超低溫冰箱購自三洋電器集團(tuán)（日本）；iBlot?Dry Blotting System購自Life technologies，Invitrogen公司（美國）；PowerLook 2100XL掃描儀購自Umax有限公司（韓國）。

1.2方法

1.2.1RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

奶牛乳腺上皮細(xì)胞（Bovine mammary epithelial cells，BMECs）用含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)至90%單層匯合時(shí)，收集細(xì)胞并移入1.5mLEP管中，加入1mL TRIzol溶液混勻，室溫靜置5min，加入200μL氯仿，快速震蕩15 s，室溫放置3min，4℃12 000 r·min-1離心10min，取上清至新EP管中，加入等體積異丙醇，輕輕混勻管中液體，室溫靜置10 min，4℃12 000 r·min-1離心10min，棄上清，沉淀加1mL 75%乙醇（無RNA酶水配制）輕輕洗滌沉淀，4℃7 500 r·min-1離心10min，棄上清，靜置晾干，向干燥沉淀中加10μL無RNA酶的水，得到純化RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，達(dá)標(biāo)后-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

測(cè)定RNA的OD260/OD280，計(jì)算比值和濃度，Prime ScriptTMRT試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。首先配制模板RNA混合溶液（體系6μL）：模板RNA 1μL，Oligo（dT）Primer 1μL，RNase Free dH2O 4μL。反應(yīng)條件為：70℃孵育10min，冰上急冷2 min以上，離心15 s，使模板RNA混合物變性液聚集于EP管底部；然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA（體系10μL）：上述模板RNA變性液6μL，5×M-MLV Buffer 2μL，dNTPMixture 0.5μL，RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.25μL，RTase M-MLV（RNase H-）（200 U·μL-1）0.5μL，RNase free dH2O 0.75μL。反應(yīng)條件為：42℃保溫1 h，70℃孵育15min，冰上冷卻，得到cDNA溶液直接用于PCR擴(kuò)增，或-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2eIF5全長(zhǎng)編碼區(qū)基因擴(kuò)增

以BMECs cDNA為模板PCR擴(kuò)增。NCBI查找牛eIF5基因序列，Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，eIF5基因上游引物：5'CGGAATTCAAAATGTCTGT CAATGTCAACCGC 3'（下劃線部分為Eco RⅠ酶切位點(diǎn)）；下游引物：5'GCGTCGACCA TCCCTTTA AATGGCATCAATATC 3'（下劃線部分為SalⅠ酶切位點(diǎn)）。PCR反應(yīng)體系25μL：模板cDNA 0.5μL，dNTP Mixture 2.5μL，2×PrimeSTAR?Buffer 12.5 μL，PrimeSTAR?HSDNA Polymerase（2.5 U·μL-1）0.25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH2O 7.25μL；PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸1.5min，30次循環(huán)后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若條帶在預(yù)期位置約1 300 bp則回收目的片段膠。

1.2.3pGEX-4T-1-eIF5表達(dá)載體構(gòu)建

將pGEX-4T-1載體質(zhì)粒和膠回收目的片段分別用Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切，37℃水浴2~3 h，酶切產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，膠回收試劑盒對(duì)目的片段回收，將酶切回收eIF5基因與載體pGEX-4T-1用T4DNA連接酶于恒溫金屬浴16℃連接過夜，連接體系10μL：eIF5基因6.5μL，pGEX-4T-1載體2μL，T4DNA連接酶0.5μL，10× Buffer 1μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含Amp抗性LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，37℃150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)過夜，菌液提取質(zhì)粒，Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定連接成功重組質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4重組蛋白原核細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將鑒定正確重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-eIF5及pGEX-4T-1空載體分別轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21。提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切后鑒定陽性克隆。將陽性克隆接種到含有Amp抗性（終濃度為50μg·mL-1）LB培養(yǎng)基中，37℃150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)過夜后，將菌液按1:50接種到含有Amp抗性（終濃度為50μg·mL-1）50mL LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6~0.8，加入IPTG至終濃度為1mmol·L-1，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h[19]。除試驗(yàn)組外，取兩組對(duì)照：一組為陽性菌液不加IPTG誘導(dǎo)對(duì)照；一組為含GST蛋白的pGEX-4T-1空質(zhì)粒加IPTG（終濃度為1mmol·L-1）誘導(dǎo)對(duì)照。誘導(dǎo)后菌液4℃10 000 r·min-1離心10min后收集菌體，加入1mL細(xì)菌裂解液重懸細(xì)菌，冰上超聲破碎30 s[20]，冰上孵育30min，4℃10 000 r·min-1離心10 min后收集上清，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取20μL樣品和20μLSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（2×）混合，沸水煮5~10min，超聲3次，每次15 s，樣品10%SDS-PAGE電泳（配方參見SDSPAGE凝膠快速配制試劑盒說明書）。電泳結(jié)束后，取膠放入適量考馬斯亮藍(lán)染色液，微波爐加熱至沸騰即停止加熱，隨后在室溫?fù)u床上搖5~ 10min，倒出染色液，加入適量脫色液，充分覆蓋凝膠，微波爐加熱至沸騰即停止加熱，搖床5~ 10min，此時(shí)可觀察到較清晰蛋白條帶，檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。

1.2.5融合蛋白GST-eIF5純化

將誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定正確剩余樣品與500μL PBS重懸GST-Sepharose 4B親和珠4℃顛倒混勻4 h，3 000 r·min-1低速離心收集GST-Sepharose 4B親和珠，500μL PBS漂洗親和珠3次，每次4℃3 000 r·min-1離心1min，除去未結(jié)合蛋白質(zhì)，加100μL還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫GST-eIF5，室溫作用10min，4℃3 000 r·min-1離心1 min，重復(fù)洗脫步驟2~3次增加回收量，收集樣品，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6Western Blot分析

將純化GST及GST-eIF5融合蛋白樣品10% SDS-PAGE電泳，利用iBlot?Dry Blotting System儀器干轉(zhuǎn)，膜用含5%脫脂奶粉TBST 37℃封閉1.5 h，分別加入GST抗體（1?1 000稀釋）和eIF5抗體（1? 200稀釋），4℃顛倒搖床過夜，TBST洗膜3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記相應(yīng)二抗（1?2 000稀釋），37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10min。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，X光片壓片，顯影技術(shù)顯示結(jié)果，利用掃描儀掃描顯色片子。

2　結(jié)果與分析

2.1細(xì)胞總RNA提取

采用TRIzol法提取BMECs總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量（見圖1）。28S條帶亮度最高，18S條帶亮度其次，5S條帶亮度最弱，表明細(xì)胞總RNA未發(fā)生降解，可用于后續(xù)試驗(yàn)，合成cDNA。

圖1　BMECs總RNA提取Fig.1 TotalRNA extraction from BMECs

2.2eIF5基因克隆

以BMECs cDNA為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)引物對(duì)eIF5基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見約1 300 bp特異性片段（見圖2），與預(yù)期目的條帶位置相符。

圖2　PCR擴(kuò)增eIF5基因Fig.2 PCR amplification of eIF 5 gene

2.3重組表達(dá)載體pGEX-4T-1-eIF5構(gòu)建與測(cè)序

將eIF5基因PCR產(chǎn)物與pGEX-4T-1載體連接、轉(zhuǎn)化，擴(kuò)大培養(yǎng)后得到陽性克隆pGEX-4T-1-eIF5，Eco RⅠ單酶切得到約6 300 bp片段，Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切后得到兩條清晰條帶，分別為1 300 bp處eIF5基因和4 969 bp處pGEX-4T-1載體（見圖3），與預(yù)期結(jié)果條帶位置相符，測(cè)序驗(yàn)證。

測(cè)序結(jié)果顯示，插入片段為1 326 bp，與NCBI中公布的eIF5基因mRNA序列完全匹配，兩者同源性為100%，且含有pGEX-4T-1質(zhì)粒序列，證明重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-eIF5構(gòu)建成功。

圖3　重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-eIF5酶切鑒定Fig.3 Identification of recombination plasm id pGEX-4T-1-eIF5 by restriction enzyme digestion

2.4融合蛋白GST-eIF5誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

分別用IPTG對(duì)pGEX-4T-1-eIF5重組載體及含有GST蛋白pGEX-4T-1空載體誘導(dǎo)表達(dá)，超聲裂解所收集菌體，10%SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和脫色，分別在82和27 ku處出現(xiàn)明顯特異性增強(qiáng)條帶，與GST-eIF5融合蛋白和GST蛋白分子質(zhì)量相符（見圖4），結(jié)果表明GST-eIF5融合蛋白和GST蛋白成功大量誘導(dǎo)表達(dá)。

2.5融合蛋白GST-eIF5純化

用GST-Sepharose 4B親和珠純化得到融合蛋白，利用還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液小量多次洗脫，收集樣品10%SDS-PAGE電泳?？捡R斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示，GST-eIF5和GST蛋白成功純化，無雜帶（見圖5）。

2.6Western Blot結(jié)果

用GST單克隆抗體對(duì)GST-eIF5融合蛋白和GST蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)分別在82和27 ku位置出現(xiàn)明顯特異反應(yīng)帶，與GST-eIF5融合蛋白和GST蛋白分子質(zhì)量相符，且與SDS-PAGE電泳出現(xiàn)目的蛋白帶位置相符，同時(shí)對(duì)融合蛋白作eIF5抗體免疫反應(yīng)檢測(cè)，有特異性產(chǎn)生，說明重組蛋白GST-eIF5在大腸埃希菌BL21中正確表達(dá)（見圖6）。

圖4　融合蛋白GST-eIF5誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳鑒定Fig.4 SDS-PAGE result of recombinant protein GST-eIF5 induced expression

圖5　融合蛋白GST-eIF5的純化SDS-PAGE電泳鑒定Fig.5 SDS-PAGE result of recombinant protein GST-eIF5 purification

圖6　融合蛋白GST-eIF5的W estern Blot鑒定Fig.6 Western Blot result of recombinant protein GST-eIF5

3　討論與結(jié)論

本研究成功構(gòu)建pGEX-4T-1-eIF5載體，并進(jìn)一步利用IPTG大量誘導(dǎo)表達(dá)，獲得純化蛋白。在載體選擇上，選用pGEX-4T-1載體，其為表達(dá)GST融合蛋白的原核高效表達(dá)載體，帶有IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)子，所表達(dá)蛋白產(chǎn)物在N端帶有GST序列，融合蛋白產(chǎn)物可通過GST層析柱快速、簡(jiǎn)便純化，且在運(yùn)載序列后含有蛋白酶切割位點(diǎn)，表達(dá)融合蛋白可通過凝血酶X因子等切割后快速釋放[21]。此載體最適表達(dá)菌為大腸埃希菌BL21（DE3），含有DE3溶素原，無Lon蛋白酶和可降解蛋白的Ompt蛋白酶，目的蛋白較穩(wěn)定且產(chǎn)量高[22]。基因表達(dá)時(shí)，表達(dá)產(chǎn)物為GST蛋白和目的基因表達(dá)蛋白融合體，目的基因eIF5預(yù)期表達(dá)蛋白分子質(zhì)量為55 ku，GST分子質(zhì)量為27 ku，融合蛋白分子質(zhì)量為82 ku，蛋白表達(dá)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符。

在融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)過程中，IPTG濃度、作用時(shí)間及誘導(dǎo)溫度對(duì)融合蛋白表達(dá)影響顯著，增加IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間可提高融合蛋白產(chǎn)量，但I(xiàn)PTG具有細(xì)胞毒性，長(zhǎng)時(shí)間作用于細(xì)菌可產(chǎn)生毒性損害，也可能使細(xì)菌生物合成系統(tǒng)過載，產(chǎn)生大量不溶性包涵體，造成后續(xù)純化和其他試驗(yàn)困難[23]。誘導(dǎo)溫度對(duì)融合蛋白表達(dá)及正確折疊影響顯著，一般低溫培養(yǎng)表達(dá)外源蛋白細(xì)菌，一定程度上抑制包涵體形成[24]。本研究通過前期試驗(yàn)，37℃條件下融合蛋白表達(dá)量較少，將誘導(dǎo)溫度選擇在28℃，通過降低IPTG濃度和延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間等，得到最佳誘導(dǎo)溫度、IPTG作用濃度及時(shí)間，分別為28℃、1mmol·L-1和4 h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)量最高。

本研究獲得融合蛋白GST-eIF5純度較高，為后續(xù)有關(guān)14-3-3γ和GlyRS等同eIF5相互作用機(jī)制研究提供底物eIF5蛋白，為探索eIF5相互作用蛋白及其在蛋白質(zhì)合成過程中功能研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Prokaryotic expression and protein purification of gene bovine eIF5/

GAO Xuejun,ZANG Yanli,WEI Chengjie,LUO Chaochao
(Agricultural Biological Functional Gene Laboratory of Heilongjiang Province,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

The bovine eIF5 gene coding sequence was amplified by polymerase chain reaction(PCR) and was cloned into EcoR I andSalⅠsites of pGEX-4T-1 vector to construct the recombinant plasmid pGEX-4T-1-eIF5.The recombinant plasmid was identified by restriction enzyme digestion and sequencing. Then it was transformed into BL21,induced by IPTG and purified by GST-Sepharose 4B beads,identified by SDS-PAGE and Western Blot analysis.Results showed that the prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-eIF5 was successfully constructed.Western Blot confirmed the recombinant protein GST-eIF5 were expressed and purified.This study provided the basis for the further research on the protein function of bovine eIF5.

bovine;eIF5;cloning;prokaryotic expression;purification

S823；Q785

A

1005-9369（2016）06-0068-06

2016-01-18

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863）項(xiàng)目（2013AA102504-03）

高學(xué)軍（1969-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槿闃I(yè)生物技術(shù)。E-mail:gaoxj5390@sina.com