RBM8A在人結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其意義

徐益彩 梁嶸 林燕 劉志輝 李永強(qiáng)

RBM8A在人結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其意義

徐益彩 梁嶸 林燕 劉志輝 李永強(qiáng)

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院消化腫瘤內(nèi)科

目的檢測(cè)RBM8A在不同結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)，為進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)篩選靶細(xì)胞。方法采用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)（qRT-PCR）法以及蛋白免疫印跡（Western-blot）法檢測(cè)RBM8A在結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、SW620、HT29、LOVO、COLO320DM、T84及人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460中的表達(dá)。結(jié)果RBM8A在7株細(xì)胞株中均有表達(dá)，其中在結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620和COLO320DM中的表達(dá)高于正常細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而其余細(xì)胞株中RBM8A的表達(dá)與正常細(xì)胞株差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論RBM8A在結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620和COLO320DM中高表達(dá)，SW620和COLO320DM細(xì)胞株或可作為靶細(xì)胞。

結(jié)腸腫瘤；結(jié)腸癌細(xì)胞系；RBM8A；實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)；蛋白免疫印跡

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在男性中排名第三，女性排第二［1］。結(jié)腸癌在亞洲地區(qū)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，一些國(guó)家推出結(jié)腸癌早期篩查項(xiàng)目，明顯降低了結(jié)腸癌的死亡率［2］。因此，研究結(jié)腸癌發(fā)病過程，尋找穩(wěn)定的腫瘤標(biāo)志物對(duì)結(jié)腸癌的早期診斷和治療至關(guān)重要。

腫瘤發(fā)生的原因之一是基因突變及錯(cuò)誤翻譯。無意義密碼子介導(dǎo)mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）是真核細(xì)胞重要的RNA監(jiān)視機(jī)制，可識(shí)別并降解異常的mRNA，以避免異常蛋白對(duì)細(xì)胞造成損傷［3］。核糖核酸結(jié)合基序蛋白R(shí)BM8A是NMD的核心成員之一，RBM8A的表達(dá)量可反映NMD的活躍程度。已有研究發(fā)現(xiàn)RBM8A在肝細(xì)胞癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)［4-6］。同時(shí)，RBM8A也是RNA結(jié)合基序蛋白（RBM）家族的一員，參與調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡過程［7］，提示RBM8A異常表達(dá)可能是惡性腫瘤轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制之一。目前RBM8A蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其意義尚不清楚，本研究檢測(cè)RBM8A在不同結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)，以篩選陽性靶細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞系

結(jié)腸癌細(xì)胞株 HT29、LOVO、COLO320DM、T84 購(gòu)自上海歌凡生物技術(shù)公司，結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480和SW620由廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤實(shí)驗(yàn)研究部提供，正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460由福建醫(yī)科大學(xué)腫瘤干細(xì)胞研究院惠贈(zèng)。

1.2主要試劑

RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購(gòu)自大連寶生物（TAKARA）公司。RBM8A小鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記馬抗小鼠多克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HT29細(xì)胞置于McCOY'5A培養(yǎng)基，LOVO細(xì)胞置于F12K培養(yǎng)基，T84細(xì)胞置于D-MEM/F-12 培 養(yǎng) 基 ，COLO320DM、SW620、SW480、NCM460細(xì)胞置于RPMI 1640培養(yǎng)基，所有細(xì)胞均補(bǔ)充10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 qRT-PCR檢測(cè)RBM8A mRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá) 根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中RBM8A序列設(shè)計(jì)引物，上游引物：5'-AGATGGCGGACGTGCTAGA-3'，下游引物：5'-CTCCACGCTGTCATAATCCTCA-3'，引物由深圳華大基因合成。按試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，聚丙乙烯凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；以β-actin為內(nèi)參，各細(xì)胞系間RBM8A基因的相對(duì)表達(dá)量通過2-△△Ct法確定，對(duì)照組為正常腸上皮細(xì)胞株NCM460。相對(duì)表達(dá)量≥2認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 Western blot檢測(cè)RBM8A蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá) 提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，每孔上樣20 μg蛋白，同時(shí)加4 μL蛋白預(yù)染Marker作為標(biāo)準(zhǔn)參照進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，觀察Marker的轉(zhuǎn)移效果，確定轉(zhuǎn)移后進(jìn)行脫脂牛奶封閉、孵一抗和二抗，采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RBM8A mRNA在正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，以正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460為對(duì)照，RBM8A mRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)量分別為COLO320DM：8.75±0.30；SW620：3.78±0.23；LOVO：1.47±0.61；SW480：1.43±0.16；HT29：1.38±0.12；T84：1.11±0.03。RBM8A mRNA 在結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620和COLO320DM中的表達(dá)高于正常細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 RBM8A mRNA在正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 RBM8A蛋白在正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，SW480、SW620、HT29、LOVO、COLO320DM、T84和 NCM460等 7株細(xì)胞均在大小約為21kD處出現(xiàn)一特異性條帶（圖2），說明RBM8A蛋白在7株細(xì)胞中均有表達(dá)?；叶戎到y(tǒng)計(jì)顯示RBM8A蛋白在SW620和COLO320DM細(xì)胞株中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余細(xì)胞株與正常細(xì)胞株差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 RBM8A蛋白在正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

3 討論

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在世界不同地區(qū)差異較大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率在發(fā)達(dá)國(guó)家呈下降趨勢(shì)［8］。但青年人群結(jié)腸癌［9］的發(fā)病率卻逐年上升。從病因看，結(jié)腸癌半數(shù)以上來自腺瘤癌變。因此研究結(jié)腸癌的癌變過程，尋找新的診斷和治療靶點(diǎn)對(duì)早期診斷和改善預(yù)后尤為重要。

RBM8A是RNA結(jié)合基序蛋白家族中的一員，參與形成外顯子連接復(fù)合體，也是NMD的核心蛋白之一。NMD是真核mRNA的監(jiān)視機(jī)制，可迅速清除異常mRNA，阻止異常蛋白的產(chǎn)生［7］。作為NMD的關(guān)鍵因子，RBM8A表達(dá)量可反映NMD的活躍程度，提示是否存在異常的蛋白表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，RBM8A在肝細(xì)胞癌、肺癌、子宮頸癌、乳腺癌以及多發(fā)性骨髓瘤中異常表達(dá)。Kim等［10］發(fā)現(xiàn)伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮頸癌中，RBM8A表達(dá)明顯增高；Carrasco等［11］發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤中存在RBM8A異常表達(dá)。Liang等［4］發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌組織中存在RBM8A高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤直徑、HBsAg、TNM分期、Edmondson病理分級(jí)呈正相關(guān)，且發(fā)現(xiàn)存在RBM8A高表達(dá)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的增殖、侵襲能力增強(qiáng)，凋亡能力減弱，提示RBM8A可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生以及轉(zhuǎn)移有關(guān)。冉亮等［12］發(fā)現(xiàn)RBM8A在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，且在組織學(xué)Ⅲ級(jí)和有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中表達(dá)更高，提示RBM8A可能參與乳腺癌的形成及轉(zhuǎn)移。Ishigaki等［13］發(fā)現(xiàn)沉默RBM8A后，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549的克隆形成能力下降，細(xì)胞周期出現(xiàn)G2/M期阻滯，不能進(jìn)行正常有絲分裂，提示RBM8A可能與肺癌細(xì)胞株的增殖凋亡有關(guān)。以上研究結(jié)果均提示RBM8A在腫瘤的形成、進(jìn)展以及腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期中可能發(fā)揮重要作用，可能是腫瘤診斷與基因治療的潛在靶點(diǎn)。

目前，關(guān)于RBM8A在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其作用的研究甚少，本研究初步篩選了存在RBM8A高表達(dá)的細(xì)胞系，通過qRT-PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了RBM8A在結(jié)腸癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，其中在SW620和COLO320DM細(xì)胞中存在高表達(dá)。SW620是結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，可進(jìn)一步研究其增殖、侵襲能力等，同時(shí)探究RBM8A在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的作用，以進(jìn)一步證實(shí)RBM8A作為結(jié)腸癌診斷標(biāo)志物和基因治療的潛在靶點(diǎn)。

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RBM8A expression and its role in human colon carcinoma cell lines

Xu Yicai，Liang Rong，Lin Yan，Liu Zhihui，Li Yongqiang（Department of Gastroenterology Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

ObjectiveTo detect RBM8A expression in human colon carcinoma cell lines in order to select the most appropriate cell line for further study.MethodsRBM8A expression was examined in the following cell lines using quantitative RT-PCR and Westernblotting：SW480，SW620，HT29，LOVO，COLO320DM，T84，and NCM460 enterocytes.ResultsRBM8A mRNA and protein were detected in all seven cell lines.RBM8A expression was higher in SW620 and COLO320DM cell lines than in normal enterocytes（P＜0.05）.Expression was similar between the normal enterocyte cell line and other cell lines（P＞0.05）.ConclusionRBM8A expression is higher in SW620 and COLO320DM cell lines，so they may be more suitable for more extensive laboratory studies.

Li Yongqiang.E-mail：lyq702702@126.com

Colorectal neoplasms；Colon carcinoma cell lines；RBM8A；RT-PCR；Western blotting

R735.3

A

1674-5671（2017）05-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.05.07

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2016GXNSFBA380090）；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（桂科AB16380215）；廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)開發(fā)與推廣應(yīng)用資助項(xiàng)目（S2017101，S201634）

李永強(qiáng)。E-mail：lyq702702@126.com

梁嶸為并列第一作者

［2017-07-05收稿］［2017-08-12修回］［編輯 羅惠予］