TOPO-1在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與伊立替康化療的相關(guān)性研究

陳紹俊 黃健 華麗 陳海輝 歐海玲 黃海欣

臨床研究

TOPO-1在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與伊立替康化療的相關(guān)性研究

陳紹俊1黃健2華麗1陳海輝1歐海玲3黃海欣1

作者單位：545005 柳州 廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤科；530300 橫縣2橫縣人民醫(yī)院腫瘤科；530023 南寧3廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科

目的探討拓?fù)洚悩?gòu)酶1（topoisomerase1，TOPO-1）在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，并分析其與伊立替康（CPT-11）化療療效的相關(guān)性。方法經(jīng)病理活檢證實(shí)為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌初診者98例，均接受FOLFIRI方案一線化療，化療前檢測腫瘤組織TOPO-1的表達(dá)水平，分析TOPO-1表達(dá)水平與近期療效的關(guān)系，并觀察遠(yuǎn)期療效。結(jié)果TOPO-1表達(dá)水平與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的臨床特征無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。高表達(dá)組患者RR為52.2%（24/46），低表達(dá)組RR為28.8%（15/52），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。TOPO-1高表達(dá)組中位PFS為9.5個(gè)月（8~12個(gè)月），低表達(dá)組為8.0個(gè)月（7~9個(gè)月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）。結(jié)論TOPO-1高表達(dá)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者可從伊立替康化療中獲得更高的近期療效和更長的無疾病進(jìn)展生存時(shí)間，可能對伊立替康化療更敏感。

結(jié)直腸腫瘤；轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌；拓?fù)洚悩?gòu)酶1；伊立替康；化療

結(jié)直腸癌患者存在個(gè)體基因及遺傳差異，因此，不同患者對相同的化療方案敏感度也存在較大差異。伊立替康為主的方案是晚期結(jié)直腸癌主要化療方案之一。伊立替康是喜樹堿半合成衍生物，體內(nèi)作用后轉(zhuǎn)變?yōu)镾N-38，并通過其抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶1（topoisomerase-1，TOPO-1）而影響 DNA合成，阻礙DNA單鏈斷裂后的修復(fù)，繼發(fā)性造成DNA雙鏈不可逆性斷裂，從而發(fā)揮細(xì)胞毒作用［1］。轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者伊立替康化療的療效存在差異，可能與關(guān)鍵靶酶TOPO-1的表達(dá)相關(guān)。目前國內(nèi)相關(guān)研究報(bào)道不多，本研究通過檢測轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中TOPO-1的表達(dá)情況，分析其與伊立替康化療療效的相關(guān)性，為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的個(gè)體化治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2014年1月至2015年12月在廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤科住院的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（IVA-B期，2010AJCC分期第7版）患者98例，年齡≤60歲62例，＞60歲36例；男性51例，女性47例；結(jié)腸癌 49例，直腸癌49例；中高分化65例，低分化33例；肝轉(zhuǎn)移60例，其他部位轉(zhuǎn)移38例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴化療前經(jīng)穿刺活檢,病理證實(shí)的初診轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者；⑵以伊立替康為主的FOLFIRI方案作為一線治療方案；⑶保存有適于進(jìn)行免疫組化檢測的石蠟包埋標(biāo)本；⑷具有可測量病灶并能評價(jià)療效；⑸預(yù)期生存期gt;6個(gè)月；⑹ECOG PS評分0~1分；⑺中性粒細(xì)胞≥1.5×109L-1，血小板≥100×109L-1，血肌酐lt;1.2 mg/L，總膽紅素、ALT、AST及AKP≤正常參考值的2.5倍。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴預(yù)計(jì)生存期lt;12周；⑵患者病灶無法按RECIST標(biāo)準(zhǔn)測量評價(jià)。本研究得到廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并由患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 免疫組化染色法采用二步法檢測

TOPO-1蛋白的表達(dá)。常規(guī)脫蠟、乙醇梯度水化，TOPO-1用EDTA液（pH 7.5）修復(fù)抗原，3%H2O2去離子水孵育以抑制內(nèi)源性過氧化物酶，TBS緩沖液沖洗；DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明，中性樹膠封片后鏡下觀察。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判定 隨機(jī)選擇有代表性的5個(gè)高倍鏡視野（20×10）。TOPO-1免疫組化染色結(jié)果判定：根據(jù)細(xì)胞核染色程度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行綜合評分：基本不著色0分，色淡著為1分，著色適中為2分，著色深者為3分，著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率≤5%為0分、6%~25%為1分、25%~50%為2分、≥51%為3分。將每張切片著色程度得分與著色細(xì)胞百分率的得分相乘為最后得分。得分≥4分記為高表達(dá)，得分＜4分記為低表達(dá)。

1.2.3 化療方案 入組患者均采用以伊立替康為主的FOLFIRI方案一線化療，具體給藥劑量及方式：伊立替康180mg/m2，靜脈滴注（維持90min），第1天；甲酰四氫葉酸鈣（LV）400 mg/m2，靜脈滴注，第 1 天；5-FU 400 mg/m2，靜脈推注，第 1 天；然后 5-FU 2 400 mg/m2，持續(xù)靜脈輸注46~48 h；每2周重復(fù)。至少4個(gè)周期評價(jià)療效。

1.3 近期療效和生存評價(jià)

完成4個(gè)周期FOLFIRI方案化療后，進(jìn)行影像學(xué)檢查。按實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（RECIST 1.1）評價(jià)近期療效，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）和疾病進(jìn)展（PD），有效率（RR）=（CR+PR）/總例數(shù)×100%。同時(shí)觀察無進(jìn)展生存期（PFS），PFS指從本次治療開始到腫瘤進(jìn)展的時(shí)間。通過門診復(fù)查、住院復(fù)查及電話等途徑隨訪，末次隨訪時(shí)間為2016年6月20日。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，TOPO-1表達(dá)

情況與臨床特征和有效率的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用logrank檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOPO-1在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

TOPO-1在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)主要集中在細(xì)胞核，見圖1。98例患者中TOPO-1高表達(dá)率為 46.94%（46/98），低表達(dá)率為 53.06%（52/98）。

2.2 TOPO-1表達(dá)與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌臨床特征的關(guān)系

TOPO-1表達(dá)與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度及轉(zhuǎn)移部位等臨床特征無關(guān)（Pgt;0.05），見表1。

圖1 TOPO-1在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)（IHC×200）

表1 TOPO-1表達(dá)與轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌臨床特征的關(guān)系［n（%）］

2.3 TOPO-1表達(dá)與近期療效的關(guān)系

在可評價(jià)近期療效的98例患者中獲CR4例（4.1%），PR 35例（35.7%），SD 33例（33.7%），PD 26例（26.5%），RR為39.8%。TOPO-1高表達(dá)組RR為52.2%（24/46），低表達(dá)組RR為28.8%（15/52），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.019），提示TOPO-1表達(dá)與伊立替康化療療效相關(guān)，高表達(dá)組比低表達(dá)組有效率更高。

2.4 TOPO-1表達(dá)與無進(jìn)展生存時(shí)間的相關(guān)性

98例患者中4例失訪，隨訪率為96%，失訪患者按截尾值計(jì)算處理。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，F(xiàn)OLFIRI方案化療后TOPO-1高表達(dá)組中位PFS為9.5個(gè)月（8~12個(gè)月），低表達(dá)組為8.0個(gè)月（7~9個(gè)月），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），生存曲線見圖2。

圖2 TOPO-1表達(dá)與PFS的關(guān)系

3 討論

我國結(jié)直腸癌發(fā)病率在所有消化道惡性腫瘤中高居第二位［2］。50%~60%結(jié)直腸癌確診時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中80%~90%為不可切除的轉(zhuǎn)移灶，對于這些患者，全身化療是主要的治療方法。盡管靶向治療藥物如貝伐珠單抗、西妥昔單抗等聯(lián)合化療已被證實(shí)可延長患者生存時(shí)間，但由于價(jià)格昂貴，目前不能為大部分患者使用。因此對晚期結(jié)直腸癌相關(guān)化療藥物的研究及探索有重要的意義［3-5］。

近年來，伊立替康等藥物的加入已使結(jié)直腸癌患者中位生存期由10~12個(gè)月延長至14~16個(gè)月［6-8］。國內(nèi)外多項(xiàng)臨床研究表明采用伊立替康為基礎(chǔ)的化療方案可提高患者的RR、PFS和OS［9-10］。伊立替康屬于喜樹堿衍生物，能夠特異抑制TOPO-1，而TOPO-1是一種參與調(diào)節(jié)DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并且廣泛存在于真核細(xì)胞、原核細(xì)胞等生物體的酶。在DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制時(shí)，雙螺旋打開形成互不交叉的單鏈，通過與TOPO-1和DNA兩者結(jié)合而形成穩(wěn)定的復(fù)合物，特異性阻止DNA鏈重新組合，從而引起DNA長鏈斷裂及再修復(fù)，使DNA產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的永久性損傷，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。伊立替康在組織中經(jīng)過羧酸酯酶的作用而產(chǎn)生有活性的代謝產(chǎn)物SN-38，此中間產(chǎn)物的抗腫瘤活性比伊立替康強(qiáng)，等于伊立替康抗腫瘤活性的100~1 000倍，而SN-38為DNA TOPO-1抑制劑，以其特殊的多環(huán)平面共軛結(jié)構(gòu)，通過與TOPO-1-DNA復(fù)合物結(jié)合，從而阻止斷裂單鏈再連接，阻斷DNA復(fù)制叉，由此產(chǎn)生細(xì)胞毒性。這種細(xì)胞毒性具有時(shí)間依賴性，并特異性作用于S期，具有高特異性，不產(chǎn)生多耐藥性［11］。在惡性腫瘤中，如結(jié)腸癌、子宮頸癌、卵巢癌、神經(jīng)細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，TOPO-1的含量比正常細(xì)胞明顯升高［12-13］。Allen等［14］研究14例卵巢癌中 TOPO-1的表達(dá)，結(jié)果陽性率為 43%（6/14）。TOPO-1抑制劑類藥物對腫瘤細(xì)胞具有較高的選擇性。

目前TOPO-1在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中的表達(dá)的相關(guān)研究不多，且存在爭議。Qiu等［15］收集復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者共90例，用免疫組化法檢測TOPO-1的表達(dá)水平，試驗(yàn)組根據(jù)ERCCl低表達(dá)選擇添加奧沙利鉑或TOPO-1高表達(dá)選擇伊立替康聯(lián)合5氟尿嘧啶的化療方案，結(jié)果顯示TOPO-1高表達(dá)使用伊立替康的39例患者（7例死亡，11例疾病進(jìn)展）與TOPO-1低表達(dá)使用伊立替康的5例患者（1例死亡，2例疾病進(jìn)展）中位生存時(shí)間為311 d和202 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.021）；治療到進(jìn)展時(shí)間為235 d和8 d，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.036）。但徐建明等［16］收集了78例結(jié)直腸癌患者，并用免疫組化進(jìn)行TOPO-1檢測，其中高表達(dá)32例，低表達(dá)48例，所有患者均用伊立替康聯(lián)合5-FU方案化療，用百分位數(shù)的Q75值代替Q50作為截?cái)嘀?，結(jié)果TOPO-1低表達(dá)患者的OS明顯延長（P=0.02）?？梢姡琓OPO-1表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞對伊立替康的敏感性可能呈正相關(guān)這一觀點(diǎn)尚存爭議。本研究發(fā)現(xiàn)TOPO-1的表達(dá)水平與其臨床特征無相關(guān)性，高表達(dá)組的患者均較低表達(dá)組患者可從伊立替康化療中獲得更高的近期療效和更長的無疾病進(jìn)展時(shí)間，提示檢測TOPO-1表達(dá)或可作為伊立替康治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌療效的預(yù)測因子，但仍需長期進(jìn)一步隨訪并進(jìn)行多因素分析加以明確。此外，本研究免疫組化步驟和結(jié)果判定差異可能導(dǎo)致結(jié)果偏倚，且樣本量較小，根據(jù)腫瘤標(biāo)記的表達(dá)狀況再分組樣本量更小，因此，研究結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。

［1］Pommier Y，Leo E，Zhang H，et al.DNA topoisomerases and their poisoning by anticancer and antibacterial drugs［J］.Chem Biol，2010，17（5）：421-433.

［2］Chang YS，Chang SJ，Yeh KT，et al.RAS，BRAF，and TP53 gene mutationsin Taiwanese colorectal cancer patients［J］.Onkologie，2013，36（12）：719-724.

［3］Jakobsen A，Andersen F，F(xiàn)ischer A，et al.Neoadjuvant chemotherapy in locally advanced colon cancer.a phaseⅡtrial［J］.Acta Oncol，2015，54（10）：1747-1753.

［4］Huo YR，Huang Y，Liauw W，et al.Prognostic value of carcinoembryonic antigen（CEA），AFP，CA19-9 and CA125 for patients with colorectal cancer with peritoneal carcinomatosis treated by cytoreductive surgery and intraperitoneal chemotherapy［J］.Anticancer Res，2016，36（3）：1041-1049.

［5］Arredondo J，González I，Baixauli J，et al.Tumor response assessment in locally advanced colon cancer after neoadjuvant chemotherapy［J］.J Gastrointest Oncol，2014，5（2）：104-111.

［6］Uchida K，Otake K，Tanaka K，et al.Clinical implications of CES2 RNA expression in neuroblastoma［J］.J Pediatr Surg，2013，48（3）：502-509.

［7］Ottaiano A，Nasti G，Cassata A，et al.FOLFOXIRI in metastatic colorectal cancer：A criticism from its native land［J］.Cancer Lett，2017，408：71-72.

［8］Leal F，F(xiàn)erreira FP，Sasse AD.FOLFOXIRI regimen for metastatic colorectal cancer：a systematic review and meta-analysis［J］.Clin Colorectal Cancer，2017.

［9］Wulaningsih W，Wardhana A，Watkins J，et al.Irinotecan chemotherapy combined with fluoropyrimidines versus irinotecan alone for overall survival and progression-free survival in patients with advanced and/or metastatic colorectal cancer［J］.Cochrane Database Syst Rev，2016，2：CD008593.

［10］Munakata M，Sakata Y.Chemotherapy for advanced colorectal cancer［J］.Nihon Rinsho，2011，69（suppl 3）：30-36.

［11］Silvestris N，Simone G，Partipilo G，et al.CES2，ABCG2，TS and Topo-I primary and synchronous metastasis expression and clinical outcome in metastatic colorectal cancer patients treated with first-line FOLFIRI regimen［J］.Int J Mol Sci，2014，15（9）：15767-15777.

［12］Heestand GM，Schwaederle M，Gatalica Z，et al.Topoisomerase expression and amplification in solid tumours：analysis of 24，262 patients［J］.Eur J Cancer，2017，83：80-87.

［13］Shen J，Kong W，Wu Y，et al.Plasma mRNA as liquid biopsy predicts chemo-sensitivity in advanced gastric cancer patients［J］.J Cancer，2017，8（3）：434-442.

［14］Allen JD，Jackson SC，Schinkel AH.A mutation hot spot in the Bcrp1 （Abcg2）multidrug transporter in mouse cell lines selected for Doxorubicin resistance［J］.Cancer Res，2002，62（8）：2294-2299.

［15］Qiu JG，Shen DM，Huang CJ，et al.Clinical values of detecting excision repair cross complementing 1 and top-isomerase I in individualized therapies of metastatic colorectal cancer［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2013，93（48）：3852-3856.

［16］徐建明，朱步東，Mangia Anita，等.胸苷酸合成酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶-1及Ki-67對伊立替康聯(lián)合5-氟脲嘧啶治療晚期大腸癌的預(yù)測價(jià)值［J］.中華腫瘤雜志，2005，27（5）：312-315.

Correlation of TOPO-1 expression with irinotecan therapy in patients with metastatic colorectal cancer

Chen Shaojun1，Huang Jian2，Hua Li1，Chen Haihui1，Ou Hailing3，Huang Haixin1（1Department of Medical Oncology，the Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Liuzhou 545005，P.R China；2Hengxian People's Hospital，Hengxian 530300，P.R China；3Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medicine University，Nanning 530023，P.R China）

Huang Haixin.E-mail：huanghaixinliuzhou@163.com

ObjectiveTo explore TOPO-1 expression in patients with metastatic colorectal cancer.MethodsTOPO-1 expression was detected by immunohistochemistry in 98 cases of metastatic colorectal cancer before receiving FOLFIRI chemotherapy，and investigate its association with short-term efficacy of chemotherapy.The long-term efficacy of chemotherapy was evaluated.ResultsTOPO-1 expression showed no obvious correlation with clinico-pathological characteristics（P＞0.05）.The patients showing high and low TOPO-1 expression showed significant difference between response rate（52.2%vs 28.8%，P＜0.05）and median progression-free survival（9.5 months vs 8.0 months，P=0.002）.ConclusionIrinotecan showed a tendency toward higher response rate and longer median survival for treating metastatic colorectal cancer patients with high expression of TOPO-1.

Colorectal neoplasms；Metastatic colorectal cancer；Topoisomerase-1；Irinotecan；Chemotherapy

R735.3

A

1674-5671（2017）05-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.05.09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260340）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013GXNSFAA019263）

黃海欣。E-mail：huanghaixinliuzhou@163.com

［2017-06-03收稿］［2017-08-29修回］［編輯 江德吉］