雄性激素受體抑制劑比卡魯胺對(duì)SCID鼠骨質(zhì)疏松影響的實(shí)驗(yàn)研究

楊政興+陳忠銘+劉美寶+陳夏韌

【摘要】 目的：研究雄性激素受體抑制劑（比卡魯胺）對(duì)前列腺癌大鼠的睪酮、雌性激素的影響以及對(duì)骨質(zhì)疏松的標(biāo)識(shí)物的影響。方法：選取40只SCID鼠作為研究對(duì)象，正常組10只，前列腺癌模型組30只，其中前列腺癌模型組分為實(shí)驗(yàn)組15只，對(duì)照組15只。實(shí)驗(yàn)組分別給予比卡魯胺0.2 mg/mL QD，灌胃，對(duì)照組用等量生理鹽水代替。分別于給藥后1、2、4周，采集實(shí)驗(yàn)組及相應(yīng)對(duì)照組裸鼠的血液及瘤體。對(duì)睪酮、雌性激素、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶分別用ELISA的雙抗體夾心法進(jìn)行檢測(cè)并記錄分析。結(jié)果：給藥2、4周后，實(shí)驗(yàn)組中睪酮明顯低于對(duì)照組與正常組（P<0.05），其他相關(guān)水平變化不明顯（P>0.05）。給藥4周后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組雄性激素受體免疫組化平均灰度值（IOD）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：比卡魯胺對(duì)在短期對(duì)前列腺癌大鼠中的睪酮影響明顯，對(duì)雌性激素?zé)o明顯影響，對(duì)骨質(zhì)疏松的指標(biāo)影響小。

【關(guān)鍵詞】 雄性激素受體抑制劑； 骨質(zhì)疏松； 實(shí)驗(yàn)研究

【Abstract】 Objective：To investigate the effects of the androgen receptor inhibitor bicalutamide on testosterone and estrogen，as well as the osteoporosis markers in rats with prostate cancer.Method：Forty SCID rats were assigned to the normal group including 10 rats or the prostate cancer model group including 30 rats.The rats in the prostate cancer model group were further divided into the test group including 15 rats，and the control group including 15 rats.The test group was given bicalutamide 0.2 mg/mL QD，and rats in the control group were given normal saline following the same dosing schedule.Blood and tumor were separately collected from rats in the test group and control group at 1 week，2 weeks and 4 weeks post-treatment.Testosterone，estrogen，ALP，and ACP were separately detected by double antibody sandwich ELISA， and then recorded and analyzed.Result：Testosterone in the test group was significantly lower than in the control and normal groups（P<0.05）；there were no significant changes in any other relevant indicators（P>0.05）.After 4 weeks，compared the mean gray value of androgen receptor immunohistochemistry in the control group and the experimental group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：In the short term，bicalutamide has significant impact on testosterone，no significant impact on estrogen，and minor impact on the osteoporosis indicators in rats with prostate cancer.

【Key words】 Androgen receptor inhibitor； Osteoporosis； Experimental study

First-authors address：Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University，F(xiàn)uzhou 350000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.28.008

本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究前列腺癌的大鼠服用比卡魯胺后對(duì)性激素水平的影響，以及對(duì)骨質(zhì)疏松癥患者骨代謝主要骨代謝指標(biāo)的影響，即抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（TRAP-5b）和骨質(zhì)疏松的指標(biāo)骨源性堿性磷酸酶（BALP），研究比卡魯胺對(duì)前列腺癌大鼠是否對(duì)骨質(zhì)疏松影響[1-3]，為研究臨床藥物對(duì)骨質(zhì)疏松的影響、分類診斷、預(yù)防及治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取40只SCID鼠作為研究對(duì)象，其中正常組10只，前列腺癌模型組30只，其中前列腺癌模型組分為實(shí)驗(yàn)組15只，對(duì)照組15只。雄性BALB/C裸鼠35只，鼠齡為4～6周，體重為18～20 g，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。裸鼠飼養(yǎng)條件：SPF級(jí)，在層流架內(nèi)自由喂養(yǎng)，自由攝入飼料，飲水無限制，并且均經(jīng)過嚴(yán)格消毒滅菌處理。

1.2 前列腺癌細(xì)胞株 LNCaP細(xì)胞株由中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供，LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱溫度保持37 ℃、5.0% CO2培養(yǎng)環(huán)境，1～2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)用0.25%胰酶消化后收集，用生理鹽水洗3次，制成單細(xì)胞懸液備用。endprint

1.3 模型建立 裸鼠造模：將LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)后，取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先將其采用胰酶進(jìn)行消化處理，濃度為0.25%，然后向其中加入完全培養(yǎng)液，待消化反應(yīng)終止后行離心分離處理，轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間分別為1000 r/min和5 min。處理后將所得樣品重懸于完全培養(yǎng)基，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢驗(yàn)細(xì)胞存活率大于90%的細(xì)胞懸液可用。用1 mL無菌注射器抽取0.2 mL混懸液，其中有5×107個(gè)細(xì)胞，將其在實(shí)驗(yàn)大鼠的右前肢腋部進(jìn)行皮下注射。待1周后，可在其右前肢腋窩處可肉眼看到有黃豆大小瘤塊形成。

1.4 實(shí)驗(yàn)給藥與處理 實(shí)驗(yàn)組分別給予比卡魯胺0.2 mg/mL QD，灌胃，比卡魯胺（非甾體類抗雄激素藥物，與黃體生成素釋放激素（LHRH）類似物或外科睪丸切除術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于晚期前列腺癌的治療）按照人的劑量換算成裸鼠的劑量制成懸液，分別于給藥后1、2、4周，采集實(shí)驗(yàn)組及相應(yīng)對(duì)照組裸鼠的血液及瘤體。裸鼠采血前先用水合氯醛（200 μL/只）麻醉后，75%酒精消毒裸鼠腹部皮膚，打開腹腔，找到腹主動(dòng)脈取血。血液由1000 r/5 min離心分離出血清，-20 ℃分存。瘤體取材后放入4%多聚甲醛固定液中固定24 h，固定后制成石蠟切片。

1.5 血清指標(biāo)檢測(cè) 人前列腺特異性抗原、睪酮、游離睪酮、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶分別用ELISA的雙抗體夾心法進(jìn)行檢測(cè)[3-5]，步驟如下：（1）將試劑盒從恒溫冰箱中取出后在室溫中放置15～30 min；（2）將酶標(biāo)板取出后依次向空白微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液，劑量為100 μL，空白對(duì)照組中則需要加入同等劑量的無菌蒸餾水；（3）在除去空白對(duì)照孔之外的各孔中加入酶標(biāo)記溶液，劑量為50 μL；（4）采用封口膠將酶標(biāo)板密封處理，在37 ℃條件下進(jìn)行孵育，1 h后對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行反復(fù)5次沖洗，濃縮的洗滌液稀釋比例為1∶100，稀釋溶液為無菌蒸餾水，然后采用吸水紙將洗滌后的酶標(biāo)板徹底排干；（5）依次向各孔中加入各50 μL的A和B溶液，室溫避光條件下使其充分進(jìn)行反應(yīng)，時(shí)間為10 min，然后向各孔中加入終止液，劑量為50 μL，將反應(yīng)終止。血清雌激素的檢測(cè)用ELISA的競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)[6]，（1）配好標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋好樣品（用樣品稀釋液1∶1稀釋）；（2）加50 μL EIA Buffer到B0孔中；（3）加50 μL各標(biāo)準(zhǔn)品到標(biāo)準(zhǔn)孔中；（4）加50 μL稀釋好的樣品到樣本中；（5）加50 μL Estradiol Ache Tracer 到每孔中；（6）加50 μL Estradiol EIA Antiserum 到每孔中；（7）蓋上覆膜，在振蕩器里室溫孵育1 h；（8）甩開孔里面的液體，用洗液沖洗5次；（9）加200 μL Ellmans Regent 到每孔中；（10）加5 μL Tracer 到每孔中；（11）蓋上覆膜，避光，振蕩器中室溫孵育60～90 min；（12）揭開覆膜，酶標(biāo)板測(cè)OD值。

1.6 病例切片

1.6.1 切片制作具體步驟 （1）脫水：將固定后的肺組織取出后采用梯度酒精進(jìn)行脫水處理，梯度酒精的濃度為30%→50%→70%→80%→90%→95%→95%→100%→100%，各級(jí)處理的時(shí)間均為1 h。（2）透明：二甲苯和無水乙醇比例為1∶1，處理時(shí)間為30 min，然后單純采用二甲苯處理8 min。（3）浸蠟：二甲苯和無水乙醇比例為1∶1，處理時(shí)間為30 min，然后給予石蠟三道浸蠟，1 h/次。（4）包埋：將熔化的石蠟倒入模具中，采用加熱的鑷子將經(jīng)過浸蠟處理的組織塊輕輕加入熔蠟中，將包埋盒改好并采用采用熔蠟填充凹槽，在室溫下等待至凝固狀態(tài)。（5）切片：將經(jīng)過石蠟包埋后的組織連續(xù)切片，層厚為6 μm，完成后將其放入45 ℃水浴鍋中燙平，以便能夠?qū)⑵滟N在載玻片上，在烘片箱中（60 ℃）處理3 h。

1.6.2 免疫組化二步法檢測(cè)各組瘤塊雄性激素受體的表達(dá)情況 具體步驟：（1）石蠟切片脫蠟至水后依次加入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ，時(shí)間間隔均為15 min，然后依次加入無水乙醇Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水，時(shí)間間隔均為5 min。（2）熱抗原修復(fù)：放進(jìn)0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液里，加熱至95 ℃ 10 min，室溫冷卻。（3）PBS洗3次，持續(xù)時(shí)間為5 min/次，待水分甩干后，用免疫組化筆將組織圈起。（4）H2O2室溫孵育，濃度為3%，時(shí)間為10 min。（5）PBS沖洗3次，持續(xù)時(shí)間為3 min/次。（6）滴加一抗（稀釋比例為1∶100），室溫孵育，時(shí)間為1～2 h，PBS沖洗3次，持續(xù)時(shí)間為2 min/次。（7）滴加試劑A，劑量為50～100 μL，室溫孵育，時(shí)間為1 h，PBS沖洗3次，持續(xù)時(shí)間為2 min/次。（8）滴入DAB溶液顯色，并在顯微鏡下觀察。（9）PBS沖洗，持續(xù)時(shí)間為10 min，加入蘇木精復(fù)染，2 min后加入鹽酸酒精分色，完成后用自來水沖洗，持續(xù)時(shí)間為10～15 min。（10）脫水、透明、中性樹膠封固。（11）光鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

比卡魯胺給藥1周后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)水平變化不大（P>0.05）；比卡魯胺用藥2周后，實(shí)驗(yàn)組睪酮水平下降，4周后睪酮水平可見明顯下降（P<0.05），其他指標(biāo)未見明顯變化（P>0.05），見表1，圖1。給藥4周后對(duì)照組雄性激素受體免疫組化平均灰度值（IOD）為（735±5），實(shí)驗(yàn)組為（531±6），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

前列腺癌患者在實(shí)施抗雄激素治療后常并發(fā)骨質(zhì)疏松，在圍絕經(jīng)期婦女中發(fā)生骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)也明顯增高[7]。研究顯示，在前列腺癌患者最開始實(shí)施康雄激素治療的幾年內(nèi)，平均每年骨密度下降水平為3%～5%，與此同時(shí)，此類患者的骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也明顯增加[8-10]。endprint

在一項(xiàng)小鼠去勢(shì)模型和AR基因敲除模型對(duì)比的實(shí)驗(yàn)研究中可以明確了解雄激素對(duì)男性骨折的重要作用，與對(duì)照組相比較，去勢(shì)實(shí)驗(yàn)小鼠的皮質(zhì)骨厚度和松質(zhì)骨量分別下降8%和71%[11-13]，而AR基因敲除小鼠的皮質(zhì)骨厚度和松質(zhì)骨量分別下降13%和68%[14-16]，證實(shí)雄激素在小鼠的松質(zhì)骨量維持方面作用和重要，而雄激素和雌激素在小鼠皮質(zhì)厚度維持方面的作用很重要。

人體骨量的多少主要取決于在相同的骨重建單位過程中骨吸收與骨形成的動(dòng)態(tài)平衡，骨質(zhì)疏松可以分為低轉(zhuǎn)換型和高轉(zhuǎn)換型，其中前者主要由成骨細(xì)胞介導(dǎo)，后者主要由破骨細(xì)胞介導(dǎo)[17]。骨代謝的生化標(biāo)志物是股轉(zhuǎn)換整體情況的重要標(biāo)志。其中BALP半衰期較長，且具有良好的穩(wěn)定性，是具有代表性的有效的骨形成代謝指標(biāo)反映。有研究認(rèn)為，對(duì)BALP定量測(cè)定或者動(dòng)態(tài)觀察中OP的早期診斷、療效監(jiān)測(cè)中提供有效的依據(jù)[18-20]。其中TRAPS5b的特異性是骨吸收指標(biāo)中最高，不容易受到白天和夜晚變化的影響，并且也不會(huì)受到肝腎疾病的影響。

比卡魯胺屬于臨床常用的雄激素受體的拮抗劑，能夠?qū)е滦奂に貑适?duì)前列腺細(xì)胞生長以及功能的調(diào)節(jié)作用，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制前列腺癌細(xì)胞生長，對(duì)骨質(zhì)疏松的影響研究很少。本次實(shí)驗(yàn)研究通過建立動(dòng)物模型，分別于給藥不同時(shí)間，采集實(shí)驗(yàn)組及相應(yīng)對(duì)照組裸鼠的血液及瘤體。對(duì)睪酮、雌性激素、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶分別用ELISA的雙抗體夾心法進(jìn)行檢測(cè)并記錄分析，骨質(zhì)疏松相關(guān)指數(shù)變化不大。雄激素受體的拮抗劑（比卡魯胺）可以影響睪酮的含量，對(duì)骨質(zhì)的生化指標(biāo)影響不大。

通過4周的實(shí)驗(yàn)，雄性激素受體抑制劑比卡魯胺可以影響雄性大鼠的睪酮含量，對(duì)雌性激素含量不影響，同時(shí)對(duì)骨質(zhì)疏松的生化指標(biāo)不影響?；蛘邥r(shí)間短，影響不能體現(xiàn)，對(duì)此方面的研究需要更長期的努力。

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