膜片鉗技術(shù)在慢性痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電生理學(xué)特性改變中的應(yīng)用*

蔡 捷 方 東 李 松 邢國剛△

（1北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所/基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京100191；2河南大學(xué)藥學(xué)院，開封 475004）

·論 著·

膜片鉗技術(shù)在慢性痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電生理學(xué)特性改變中的應(yīng)用*

蔡 捷1方 東2李 松1邢國剛1△

（1北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所/基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京100191；2河南大學(xué)藥學(xué)院，開封 475004）

目的：以骨癌痛大鼠為例，探討全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在慢性痛研究中的應(yīng)用。方法：急性分離背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion, DRG）神經(jīng)元，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分別記錄對(duì)照組和骨癌痛組大鼠小直徑DRG神經(jīng)元的動(dòng)作電位及TRPV1（transient receptor potential vanilloid channel subfamily V member 1）的電流，分析大鼠小直徑DRG神經(jīng)元電活動(dòng)的變化。結(jié)果：利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)可以記錄到骨癌痛大鼠的小直徑DRG神經(jīng)元靜息膜電位絕對(duì)值降低、動(dòng)作電位發(fā)放頻率增加、爆發(fā)動(dòng)作電位的閾值降低、TRPV1通道的電流幅度增大。結(jié)論：全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)可以有效而直觀的記錄到單個(gè)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢缓碗娏鞯淖兓?，并由此?duì)神經(jīng)元電生理學(xué)特性進(jìn)行分析，從而進(jìn)行慢性痛發(fā)病機(jī)制的研究。

全細(xì)胞膜片鉗；背根神經(jīng)節(jié)；慢性痛；動(dòng)作電位；電流

膜片鉗（patch clamp）技術(shù)是1976年由德國馬普生物物理研究所Neher和Sakmann創(chuàng)建[1]，他們首次在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時(shí)記錄到乙酰膽堿（acetylcholine, Ach）激活的單通道離子電流，從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)。經(jīng)過1980年 Sigworth和1981年Hamill和Neher的不斷改進(jìn)[2]，使該技術(shù)更趨完善，現(xiàn)已被廣泛用于生物學(xué)研究，尤其是神經(jīng)科學(xué)的研究。在神經(jīng)科學(xué)的慢性痛研究領(lǐng)域，由于各種原因?qū)е碌穆蕴弁粗?，外周感覺神經(jīng)元的電生理學(xué)特性會(huì)發(fā)生改變[3～5]，因此利用全細(xì)胞膜片鉗（whole-cell patch-clamp）技術(shù)中電流鉗記錄模式記錄神經(jīng)元興奮性的改變成為分析神經(jīng)元電生理學(xué)特性的重要手段。本文以利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄急性分離骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的動(dòng)作電位發(fā)放以及TRPV1 (transient receptor potential vanilloid channel subfamily V member 1)電流為例，詳細(xì)介紹膜片鉗技術(shù)操作步驟、注意事項(xiàng)以及結(jié)果分析。

方 法

1.骨癌痛大鼠模型的建立

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康成年雌性SD (Sprague Dawley, SD)大鼠, 體重約 150～180 g, 由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

（2）骨癌痛大鼠模型的建立: 參照Medhurst SJ等的方法[6], 微量注射器向左側(cè)脛骨骨髓腔內(nèi)注射MRMT-1大鼠乳腺癌細(xì)胞（4×104, 4 μl）, 骨蠟封閉注射孔。建立骨癌痛大鼠模型, 術(shù)后14 天用 von Frey 纖維絲測定大鼠同側(cè)后爪的50% 縮足閾（paw withdraw threshold, PWT）以檢測造模是否成功。對(duì)照組注射等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS組）。

2.大鼠DRG神經(jīng)元的急性分離[4,5]

（1）準(zhǔn)備工作：提前一天用多聚賴氨酸（poly-D-lysine）包被置于24孔板中的圓形玻片(直徑12 mm)，500 μl/孔，第二天雙蒸水清洗三遍，超凈臺(tái)內(nèi)吹30 min。

（2）取材：大鼠稱重麻醉后，迅速斷頭處死。消毒后剝離背側(cè)皮膚分離出脊椎，迅速用外科鑷分離出骨癌細(xì)胞接種側(cè)腰4、腰5 DRG，剪除DRG胞體兩側(cè)的神經(jīng)纖維，將DRG胞體置于預(yù)冷的無血清DMEM中，用DMEM清洗兩遍，眼科剪將DRG剪碎。

（3）消化：棄去DMEM后，加入1.5 ml膠原酶（1.5 mg/ml, type IA, Sigma），37℃，110轉(zhuǎn)/分鐘的恒溫?fù)u床上消化45分鐘。然后棄去膠原酶，加入1.5 ml胰酶(2 mg/ml, type II-S, Sigma)，繼續(xù)37℃，110轉(zhuǎn)/分鐘的恒溫?fù)u床上消化10分鐘。

（4）制備單細(xì)胞懸液：消化完畢后，加入1.5 ml含10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM培養(yǎng)基終止消化，將帶有DRG組織的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，用在酒精燈上拋光后的巴斯德管將消化后的DRG小心吹打成細(xì)胞懸液。

（5）接種：將上述細(xì)胞懸液用適量的10%FBS DMEM培養(yǎng)基稀釋，接種至多聚賴氨酸包被過的24孔板內(nèi)的蓋玻片上，500 μl/孔，輕輕晃動(dòng)，使其均勻分布。37 ℃，5% CO2培養(yǎng)2 h后進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)。

3.玻璃微電極的制備

采用垂直二步拉制法（第一步拉制溫度為58.1℃，第二步為48.0 ℃）制備玻璃微電極，拉好的電極用拋光儀熱拋光，消除殘留的毛刺，以有利于形成巨阻封接。電極拋光后的入水阻抗約為5～8 M。

4. 膜片鉗記錄過程

（1）取細(xì)胞：將貼附有細(xì)胞的玻片從培養(yǎng)基中取出，放至新的加有細(xì)胞外液的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放至顯微鏡平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞外液（mM）：144 NaCl，2.5 KCl，2 CaCl2, 0.5 MgCl2，5 HEPES，10 glucose，用NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.4。

（2）Patch過程：鏡下選取直徑小于25 μm的DRG神經(jīng)元。將充灌有電極內(nèi)液的玻璃微電極固定在電極夾持器上，此時(shí)電路呈斷路狀態(tài)，電阻很高。用注射器給電極施以正壓后用電動(dòng)微操縱器將電極入水，此時(shí)電路接通，軟件顯示電極阻抗，觀察電極阻抗為5～8 M，單擊液接電位補(bǔ)償中的“Auto”鍵進(jìn)行液接電位補(bǔ)償。在顯微鏡下找到電極尖端，用微操縱器將電極移至目標(biāo)細(xì)胞附近，調(diào)整電極位置，使電極剛好壓到細(xì)胞的正上方稍偏向電極夾持器方向一點(diǎn)，鏡下看細(xì)胞表面被壓出一個(gè)小凹，此時(shí)電極電阻上升0.5～1.5 M，撤去正壓并給予輕微負(fù)壓，直至電阻增加至1 G以上形成高阻封接。單擊“C-Fast”中的“Auto”鍵，儀器自動(dòng)進(jìn)行快電容補(bǔ)償。再次向微電極內(nèi)施以負(fù)壓，打破電極尖端下的細(xì)胞膜，單擊“C-Slow”中的“Auto”鍵，進(jìn)行慢電容補(bǔ)償，形成全細(xì)胞（whole-cell）電壓鉗模式。最后串聯(lián)電阻補(bǔ)償至少70%以上。實(shí)驗(yàn)所用的電流內(nèi)液（mM）: 135 K-gluconate，5 KCl，5 Mg-ATP，0.5 Na2GTP，5 HEPES，2 MgCl2，5 EGTA，0.5 CaCl2用KOH調(diào)節(jié)至pH 7.4；采用EPC10膜片鉗放大器和Patchmaster軟件（德國HEKA公司）來記錄和分析DRG神經(jīng)元的電活動(dòng)，濾波2 KHz、采樣頻率10 KHz。

（3）記錄過程

電流鉗模式：記錄模式設(shè)置為電流鉗，神經(jīng)元注射電流為0 pA，此時(shí)記錄的為神經(jīng)元的靜息膜電位(resting membrane potential, RMP)，之后觀察對(duì)照組和骨癌痛組細(xì)胞自發(fā)放電情況。然后給予神經(jīng)元步階命令電流(5 pA, 100 ms)，直至誘發(fā)出第一個(gè)動(dòng)作電位，動(dòng)作電位爆發(fā)的閾值(threshold of action potential, TP)以及恒定去極化電流(300 pA, 500 ms)誘發(fā)動(dòng)作電位爆發(fā)的個(gè)數(shù)。

電壓鉗模式：以TRPV1電流記錄為例，將神經(jīng)元鉗制在-70 mV，執(zhí)行TRPV1受體激動(dòng)劑辣椒素(capsaicin, CAP，20 μg/μl)灌流給藥步驟（細(xì)胞外液5 s-激動(dòng)劑5 s-細(xì)胞外液20 s），記錄TRPV1電流。

結(jié) 果

1. 神經(jīng)元興奮性分析

（1）電流鉗模式下將神經(jīng)元鉗制于0 pA，觀察到骨癌痛組神經(jīng)元自發(fā)放電較對(duì)照組增多，而且靜息膜電位絕對(duì)值減?。ㄒ妶D1）。

圖1 骨癌痛大鼠小直徑DRG神經(jīng)元自發(fā)放電的變化Fig.1 The number of spontaneous action potentials of DRG neuron is more in MRMT-1 rats than that of PBS rats, meanwhile DRG neurons depolarize in MRMT-1 rats compare to DRG neurons in PBS rats

（2）給予步階命令電流（5 pA，100 ms），直至誘發(fā)出第一個(gè)動(dòng)作電位，而動(dòng)作電位爆發(fā)的閾值（threshold potential, TP）骨癌痛較對(duì)照組相比絕對(duì)值較大（見圖2）。

圖2 骨癌痛大鼠誘發(fā)動(dòng)作電位的閾值變化Fig.2 The threshold of evoked action potentials of DRG neuron is lower in MRMT-1 rats than that of in PBS rats

（3）給予恒定的去極化電流（300 pA，500 ms）發(fā)現(xiàn)誘發(fā)的動(dòng)作電位頻率骨癌痛大鼠較對(duì)照組相比增多（見圖3）。

圖3 骨癌痛大鼠誘發(fā)動(dòng)作電位頻率變化Fig.3 The frequency of evoked action potentials of DRG neuron is higher in MRMT-1 rats than that of in PBS rats

2. TRPV1電流變化

將神經(jīng)元膜電位鉗制在-70 mV，執(zhí)行TRPV1受體激動(dòng)劑辣椒素（capsaicin）灌流給藥步驟后，記錄TRPV1電流發(fā)現(xiàn)，骨癌痛組與對(duì)照組相比TRPV1電流幅度增大（見圖4）。

圖4 利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄到骨癌痛大鼠辣椒素誘發(fā)TRPV1電流的變化Fig.4 Representative traces of capsaicin-induced currents in DRG neurons with whole-cell patch-clamp recording

討 論

單細(xì)胞膜片鉗技術(shù)雖然已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究，但是該技術(shù)掌握起來還是有一定難度，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)有幾個(gè)關(guān)鍵步驟需要注意。在DRG神經(jīng)元的急性分離培養(yǎng)過程中，首先是取材要快，因要保持細(xì)胞活性，所以需要快速而準(zhǔn)確地取出DRG，以免時(shí)間過長細(xì)胞死亡。然后是消化階段，一般操作流程中會(huì)有個(gè)固定的消化時(shí)間，但是因?yàn)橐让负湍z原酶每個(gè)批次的活性都不一樣，所以每次拿到新的胰酶和膠原酶都要做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定具體消化時(shí)間，否則消化過度或消化時(shí)間不夠都會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)而影響patch過程。最后是制備單細(xì)胞懸液過程中的吹打步驟，要把玻璃吸管尖端燒制光滑，粗細(xì)適中，吹打力度、頻率以及手法都要輕柔，避免出現(xiàn)氣泡，這一步需要多次練習(xí)才能掌握。在細(xì)胞貼壁結(jié)束取出進(jìn)行patch時(shí)注意要將附著有細(xì)胞的一面朝上放置，新手操作時(shí)容易將玻片放反導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在電極制備時(shí)根據(jù)所用拉制儀不同還可以采用水平拉制法制備玻璃微電極，電極尖端大小及形狀與拉制溫度、拉力、拉制速度、拉制時(shí)間等密切相關(guān)，而且每批次電極所用拉制參數(shù)均不同，所以換新批次電極時(shí)需要重新設(shè)定拉制參數(shù)。Patch過程中在鏡下找到玻璃微電極是剛開始接觸該技術(shù)的人員需要攻克的難點(diǎn)。首先在鏡下確定好要patch的細(xì)胞，將其放至視野中央，然后將玻璃微電極放至光路，在鏡下會(huì)看到反光，電極入水前需要給予正壓，然后用微操縱器將玻璃微電極緩慢下降，下降過程中適當(dāng)調(diào)整前后左右位置，如果視野中看不到電極影子先不要盲目下降，以免電極觸及培養(yǎng)皿壓碎電極尖端，當(dāng)電極下到細(xì)胞上方時(shí)鏡下可以看到清楚的電極尖端。Patch過程中另一個(gè)關(guān)鍵步驟就是高阻封接和破膜的過程。這一過程成功與否與細(xì)胞狀態(tài)和破膜技巧有關(guān)。如果細(xì)胞一破膜就掉或者溶解，有可能細(xì)胞消化過度或者吹打力度太大，如果細(xì)胞很難破膜說明消化不夠，下次需要調(diào)整消化時(shí)間。

在疼痛研究中膜片鉗技術(shù)最常用于研究疼痛導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性改變和離子通道的電流變化[4,5,7～9]。以本文提到的骨癌痛為例，骨癌痛大鼠的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元與對(duì)照組相比神經(jīng)元的興奮性增高，可以從全細(xì)胞膜片鉗記錄到的神經(jīng)元放電分析得到。首先是神經(jīng)元自發(fā)放電的變化，在注射了PBS的對(duì)照組大鼠DRG神經(jīng)元自發(fā)放電很少甚至沒有，而骨癌痛大鼠的DRG神經(jīng)元自發(fā)放電明顯多于對(duì)照組，而且靜息膜電位絕對(duì)值較對(duì)照組明顯降低，說明神經(jīng)元靜息膜電位更接近于爆發(fā)動(dòng)作電位的閾值，更容易興奮。當(dāng)給予一系列去極化電流(5 pA，100 ms)時(shí)，會(huì)誘發(fā)一系列動(dòng)作電位的發(fā)放，可以看到骨癌痛組誘發(fā)的動(dòng)作電位個(gè)數(shù)較對(duì)照組增多。具體可以從靜息膜電位(resting membrane potential, RMP)、引發(fā)第一個(gè)動(dòng)作電位的去極化電流閾值(current threshold, CT)、膜輸入阻抗(membrane input resistance, Rin)、動(dòng)作電位閾值(threshold potential, TP)、后超極化(afterhyperpolarization, AHP)等動(dòng)作電位的特征分析誘發(fā)的第一個(gè)動(dòng)作電位，從而分析造模組和對(duì)照組的區(qū)別。電壓鉗模式下可以記錄疼痛相關(guān)的離子通道的電流變化。此文中列舉的TRPV1是配體門控的離子通道，可以給予通道的TRPV1受體的配體辣椒素(capsaicin, CAP)使通道開放記錄通過該通道的電流。如果是電壓門控的離子通道就可以通過控制細(xì)胞膜電位使離子通道開放或關(guān)閉，從而記錄通道電流。因記錄的每個(gè)細(xì)胞大小不同，單看幅度有時(shí)不太客觀，所以常用電流幅度除以細(xì)胞膜電容得出電流密度來進(jìn)行比較。

綜上所述，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)可以通過記錄神經(jīng)元放電和相關(guān)離子通道的電流變化來探討疼痛發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，是疼痛學(xué)研究領(lǐng)域不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)之一。

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THE APPLICATION OF PATCH-CLAMP RECORDINGS IN THE CHANGE OF DORSAL ROOT GANGLION NEURONS ELECTROPHYSIOLOGICAL PROPERTIES OF CHRONIC BONE CANCER PAIN *

CAI Jie1, FANG Dong2, LI Song1, XING Guo-Gang1△
(1Neuroscience Research Institute and Department of Neurobiology, Peking University, Beijing 100191, China；2College of pharmacy, Henan University, Kaifeng 475004, China)

Objective:To investigate the application of whole-cell patch-clamp recordings in chronic bone cancer pain research.Methods:Analyses of the properties of action potential and capsaicin induced inward current with whole-cell patch-clamp recordings was used in acute dissociated small DRG neurons in bone cancer pain rats and control rats.Results:The number of spontaneous and evoked action potentials of DRG neuron is more and the threshold of evoked action potentials of DRG neuron is lower in bone cancer rats than that of PBS rats, meanwhile DRG neurons depolarize in bone cancer rats compare to DRG neurons in PBS rats. Amplitude of capsaicin induced TRPV1 current is bigger in bone cancer pain rats than that of control rats.Conclusion:Whole-cell patch-clamp technology can be routinely used to characterize action potentials and current fl ow through ionic channels in research of mechanism of chronic pain.

Whole-cell patch-clamp; Dorsal root ganglion; Chronic pain; Action potential; Current

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.01.005

國家自然科學(xué)基金(81671085, 81371237, 61527815, 31171063)；科技部國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃“973”資助項(xiàng)目(2013CB531905)；衛(wèi)生部行業(yè)專項(xiàng)基金(201302013-01)；中國中醫(yī)科學(xué)院針灸研究所基礎(chǔ)研究開放課題項(xiàng)目(ZZ04004).

△通訊作者 ggxing@bjmu.edu.cn