1株油茶真菌病害拮抗菌株的篩選鑒定及其拮抗作用

魏蜜+張偉+管維軒+朱潔倩+傅本重+王立華+李國(guó)元

摘要：為獲得并鑒定高效拮抗油茶主要真菌病害的拮抗菌，研究其拮抗作用，采用點(diǎn)接法和發(fā)酵培養(yǎng)法從油茶根部土壤分離獲得1株能同時(shí)拮抗6種油茶病害真菌的拮抗菌。通過(guò)生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，將該拮抗菌鑒定為解淀粉芽孢桿菌，并命名為Bacillus amyloliquefaciens D2WM。該拮抗菌能拮抗油茶炭疽病病菌（Colletotrichum nicotianae）、膠孢炭疽病病菌（C. gloeosporioide）、葉斑病病菌（Phyllosticta capitalensis）、軟腐病病菌（Agaricodochium camellia）、黑斑病病菌（Altermaria alternate）和潰瘍病病菌（Bothyosphaeria dothidea）6種油茶病害病原菌，且拮抗菌發(fā)酵產(chǎn)生的無(wú)菌濾液對(duì)以上6種病原菌的抑菌率均高于95%。同時(shí)，D2WM菌株發(fā)酵產(chǎn)生的10倍稀釋菌液還對(duì)細(xì)菌性軟腐病病原菌歐文氏菌3個(gè)亞種的抑菌圈均大于22 mm，是1株具有廣譜拮抗作用的生防菌株。D2WM菌株發(fā)酵液耐酸堿范圍廣，在pH值為9時(shí)拮抗作用最佳；不耐高溫，溫度達(dá)到80 ℃及以上時(shí)抑菌活性完全喪失。研究結(jié)果對(duì)細(xì)菌性軟腐病及油茶無(wú)公害防治提供了理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；鑒定；油茶病害；拮抗作用

中圖分類號(hào)： S435.659 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）18-0100-05

收稿日期：2016-04-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31200488）；湖北省教育廳中青年人才項(xiàng)目（編號(hào)：Q20152707）；湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：D20102704）；特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：2016K07）。

作者簡(jiǎn)介：魏 蜜（1987—），女，湖北孝感人，博士，講師，主要從事微生物學(xué)和植物病害防治等方面的研究。Tel：（0712）2345155；E-mail：weimi555@163.com。 油茶（Camellia oleifera）屬山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia），是我國(guó)特有的一種高級(jí)油料作物，主要生長(zhǎng)于中國(guó)南方亞熱帶地區(qū)高山及丘陵地帶，是重要的木本油料樹(shù)種之一[1]。油茶病害種類繁多，油茶炭疽病、油茶葉枯病、油茶軟腐病是油茶生產(chǎn)中3種毀滅性病害，在我國(guó)各油茶產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，油茶的地上各部位均可受害[2]，且油茶黑斑病、油茶潰瘍病等也時(shí)常發(fā)生，每年油茶產(chǎn)業(yè)因上述真菌性病害造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

芽孢桿菌（Bacillus）是一類理想的生防菌，在目前生防細(xì)菌中研究較多。周盈等報(bào)道了1種對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌BSn5及其產(chǎn)生的抑菌蛋白APn5，但該菌只能拮抗胡蘿卜軟腐歐文氏菌亞種，其生防范圍較窄[3]。劉君昂等公開(kāi)了1種拮抗油茶病害的短芽孢桿菌Z26，它能有效抑制油茶炭疽病病菌、根腐病病菌、半邊瘋病菌等病原菌的生長(zhǎng)，該生防菌劑對(duì)油茶炭疽病的最大抑制率達(dá)到 83.4%[4]。陳瓊珍等利用枯草芽孢桿菌對(duì)有害真菌的生防作用及最佳發(fā)酵條件進(jìn)行研究，結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌只對(duì)紅鐮刀菌的拮抗作用明顯[5]。目前，關(guān)于解淀粉芽孢桿菌能同時(shí)在油茶主要真菌性病害及細(xì)菌性軟腐病上的防治研究及應(yīng)用報(bào)道較少。

本研究從油茶根部土壤分離獲得1株能拮抗油茶主要病害真菌的解淀粉芽孢桿菌D2WM。采用平板對(duì)峙法和發(fā)酵培養(yǎng)法研究該拮抗菌對(duì)油茶6種病害真菌的拮抗作用。另外，使用管碟法測(cè)定該拮抗菌的無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)細(xì)菌性軟腐病病菌的拮抗作用。最后本研究對(duì)拮抗菌發(fā)酵菌液的理化性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，為油茶真菌病害及蔬菜細(xì)菌性軟腐病的無(wú)公害防治提供了一定的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株來(lái)源：油茶炭疽病病菌（Colletotrichum nicotianae）、油茶膠孢炭疽病病菌（C. gloeosporioides）、油茶葉斑病病菌（Phyllosticta capitalensis）、油茶軟腐病病菌（Agaricodochium camellia）、油茶黑斑病病菌（Altermaria alternate）、油茶潰瘍病病菌（Bothyosphaeria dothidea），均分離自湖北孝感大悟油茶林地；胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種（Erwinia carotovora ssp. carotovora）、胡蘿卜軟腐歐文氏菌黑脛亞種（E. carotovora ssp. atroseptica）、菊歐文氏菌（E. chrysanthemi），均分離自湖北孝感當(dāng)?shù)厥卟颂镏懈癄€的蔬菜。所有菌株均保存于湖北工程學(xué)院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基[6]及主要試劑和儀器

LB培養(yǎng)基（篩選培養(yǎng)基）：1 L中含有10 g蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl、15～20 g瓊脂，pH值7.0～7.2，用去離子水調(diào)至總體積為1 L；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（分離培養(yǎng)基）：1 L中含有3.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，15.0 g瓊脂，pH值7.2～7.4，用去離子水調(diào)至總體積為1 L。上述培養(yǎng)基分裝后于121 ℃滅菌20 min，備用。

DNA凝膠回收試劑盒、PCR反應(yīng)用的各種試劑，均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、酵母粉、NaCl、瓊脂等，均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 拮抗菌的篩選、分離及拮抗作用研究

采用稀釋分離法[7]從油茶根部土壤分離拮抗細(xì)菌，取 10 g 健康油茶根際土樣加入到盛有90 mL無(wú)菌水和玻璃珠（直徑0.5 cm，每瓶30～50個(gè)）的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min 搖床中振蕩20 min后，將菌懸液放置在80 ℃水浴中保持15 min。將1 mL土壤懸浮液移入盛有9 mL無(wú)菌水的試管中，制成10-1菌懸液，依此類推，獲得10-2、10-3、10-4、10-5、10-6菌懸液。梯度稀釋后，吸取100 μL稀釋度為 10-6～10-3的菌懸液均勻涂布在分離培養(yǎng)基上，將涂布有菌懸液的平板置于30 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后觀察分離培養(yǎng)基上菌落的狀態(tài)，用三步劃線法進(jìn)行分離純化，統(tǒng)一編號(hào)登記。接種斜面后，可在4 ℃短暫保藏，用50%甘油作為保護(hù)劑，可在-80 ℃長(zhǎng)久保藏。endprint

采用平板對(duì)峙法[8]篩選能同時(shí)拮抗各油茶病原真菌的拮抗細(xì)菌，將直徑為7 mm的病原菌餅置于PDA平板中心，然后用無(wú)菌牙簽蘸取待測(cè)菌，于等距離點(diǎn)（距平板中央1.5 cm）接拮抗菌，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5 d后觀察抑菌帶的大小，每個(gè)處理重復(fù)3次，篩選抑菌帶寬大于5 mm的菌株。

將初篩有拮抗作用的菌株在LB液體培養(yǎng)基中于 150 r/min 適溫培養(yǎng)24 h，發(fā)酵菌液以8 000 r/min離心 10 min，上清用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾至滅菌EP管中。將初篩拮抗菌濾液與約50 ℃的PDA固體培養(yǎng)基按體積比1 ∶ 19混勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻后在平板中央放入直徑為7 mm的油茶病原真菌菌餅，以無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，5 d后測(cè)量病原菌菌落直徑。無(wú)菌濾液抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-0.7）×100%。

采用平板對(duì)峙法分析拮抗菌對(duì)真菌主要病害的拮抗作用[8]：將打好的直徑為7 mm的油茶炭疽病等病原菌菌餅置于PDA平板中心，然后用無(wú)菌牙簽蘸取待測(cè)菌，于等距離點(diǎn)（距平板中央1.5 cm）接拮抗菌，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后觀察抑菌帶的大小，每個(gè)處理重復(fù)3次。采用管碟法[9]分析拮抗菌對(duì)歐文氏菌的拮抗作用：在涂布有100 μL病原菌（約1×107 CFU/mL）的LB瓊脂平板上等距離用打孔器打直徑為7 mm的孔。每個(gè)孔中接入50 μL發(fā)酵液10倍稀釋液，以無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。在30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)20～28 h后測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)數(shù)值大小確定拮抗程度。

1.4 拮抗菌株鑒定

1.4.1 拮抗菌的形態(tài)特征和生理生化鑒定 將純化后的菌種轉(zhuǎn)接到LB平板上，于30 ℃培養(yǎng)24 h后，對(duì)菌落形態(tài)、顏色、基質(zhì)顏色及有無(wú)運(yùn)動(dòng)性等進(jìn)行形態(tài)特征鑒定，并依據(jù)東秀珠等的方法[10]對(duì)拮抗菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.4.2 拮抗菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定 拮抗菌株基因組DNA的提取方法參考文獻(xiàn)[11]。采用生工生物工程（上海）股份有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（編號(hào)：B518225）提取細(xì)菌基因組DNA，-20 ℃保存。

采用細(xì)菌的通用引物F27（AGAGTTTGATCCTGGCT CAG）和R1492（TACGGCTACCTTGTTACGACTT）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到該細(xì)菌的16S rDNA。PCR反應(yīng)總體系為50 μL：各 2 μL 引物F27和R1492（由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成）、5 μL 10×buffer、2 μL dNTP、1 μL Taq酶、5 μL MgCl2、33 μL 雙蒸水。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共設(shè)35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)顯示并記錄電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物委托天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.5 拮抗菌株無(wú)菌發(fā)酵液的特性研究

酸堿穩(wěn)定性測(cè)定[12]：將拮抗菌株菌液經(jīng)無(wú)菌濾器過(guò)濾，吸取5 mL無(wú)菌濾液轉(zhuǎn)入無(wú)菌試管中，用1 mol/L NaOH或HCl調(diào)pH值分別至1、3、5、7、9、11、13，靜置1 h后，測(cè)試不同pH值拮抗菌株菌液對(duì)歐文氏菌的抑制作用。以不調(diào)pH值的濾液作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

熱穩(wěn)定性研究[13]：將拮抗菌液經(jīng)無(wú)菌濾器過(guò)濾，取5 mL無(wú)菌濾液轉(zhuǎn)入無(wú)菌試管中，分別在20、40、60、80、100 ℃下處理2 h，測(cè)試不同溫度處理的拮抗菌株菌液對(duì)歐文氏菌的抑制作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的篩選和分離

以實(shí)驗(yàn)室分離到的油茶炭疽病病菌（C. nicotianae）為指示菌，以分離得到的菌株為待檢菌，將分離純化得到的細(xì)菌利用平板對(duì)峙法依次篩選，初步確定對(duì)油茶主要真菌病害有拮抗作用的3株菌株D2WM、D9WM、D21WM。然后采用發(fā)酵法進(jìn)行復(fù)篩，最終確定D2WM的拮抗作用最強(qiáng)。

2.2 拮抗菌株D2WM的形態(tài)學(xué)及生理生化特性分析

如圖1所示，D2WM菌株的菌體呈桿狀，周生鞭毛，并具有運(yùn)動(dòng)性；菌落為乳白色，呈近圓形，表面粗糙有褶皺，邊緣不規(guī)則，不產(chǎn)生可溶性色素。生理生化鑒定結(jié)果表明，該菌株屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，具有接觸酶活性，能水解淀粉，能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖產(chǎn)酸，能利用檸檬酸鹽，能夠水解酪素并使明膠液化，能夠還原石蕊牛奶和硝酸鹽，伏-普（V-P）反應(yīng)呈陽(yáng)性，不具有卵磷脂酶活性，不能水解馬尿酸鹽和酪氨酸，不能利用葡萄糖產(chǎn)氣。

2.3 拮抗菌株D2WM的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

對(duì)菌株D2WM進(jìn)行分子鑒定，將測(cè)得的16S rDNA序列（片段長(zhǎng)度為1 439 bp）與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST分析，選取9株菌株用ClustalX 2.1進(jìn)行多序列比對(duì)分析，利用MEGA 6.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建和聚類分析，如圖2所示。菌株D2WM（登錄號(hào)為KU973511）與GenBank中登錄號(hào)為HM107808.1[解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） strain 15]菌株的同源性達(dá)到99%。依據(jù)16S rDNA分類標(biāo)準(zhǔn)，一般認(rèn)為16S rDNA序列同源性大于97%，可認(rèn)為屬于同一個(gè)種。結(jié)合上述形態(tài)和部分生理生化特征，可初步判定拮抗菌株D2WM屬于解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。

2.4 拮抗菌株D2WM的拮抗作用分析

采用平板對(duì)峙法和發(fā)酵菌液培養(yǎng)法開(kāi)展解淀粉芽孢桿菌D2WM與多種油茶病原菌拮抗作用研究。由圖3可知，解淀粉芽孢桿菌D2WM對(duì)油茶炭疽病、油茶膠孢炭疽病、油茶葉斑病、油茶軟腐病、油茶黑斑病和油茶潰瘍病6種油茶病害致病菌均有較好的拮抗作用，尤其是對(duì)油茶炭疽病病菌、葉斑病病菌、黑斑病病菌的拮抗效果明顯。由表1可知，解淀粉芽孢桿菌D2WM對(duì)油茶主要病害致病菌的抑菌率均高于95%，尤其是對(duì)葉斑病病菌的抑菌率達(dá)到100.00%。上述結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌D2WM的抗菌譜較廣，是1株針對(duì)油茶主要病害的高效生防菌株。endprint

另外，本研究還考察了解淀粉芽孢桿菌D2WM發(fā)酵液對(duì)細(xì)菌性軟腐病菌歐文氏菌的拮抗作用。由圖4可知，D2WM發(fā)酵液的10倍稀釋液對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種、胡蘿卜軟腐歐文氏菌黑脛亞種、菊歐文氏菌3個(gè)亞種的抑菌圈直徑均大，抑制效果較好，其無(wú)菌水對(duì)照處理組均未出現(xiàn)抑菌圈。

2.5 拮抗菌株D2WM的拮抗物質(zhì)特性研究

2.5.1 酸堿穩(wěn)定性研究 由圖5可知，D2WM菌株發(fā)酵液的無(wú)菌濾液酸堿耐受范圍較廣，在pH值為1～11范圍內(nèi)對(duì)軟腐病病原菌均有一定的抑制效果，并且在pH值為9時(shí)，其抑制效果最佳，證明偏堿性的環(huán)境更有利于無(wú)菌濾液中的有效成分發(fā)揮拮抗作用。

2.5.2 熱穩(wěn)定性研究 由圖6可知，D2WM菌株發(fā)酵液的無(wú)菌濾液在20～60 ℃范圍內(nèi)保留抑菌活性。試驗(yàn)同時(shí)得到未經(jīng)處理的無(wú)菌濾液在室溫25 ℃條件下的抑菌圈直徑為（31.2±0.4）mm。結(jié)果表明，溫度大于40 ℃時(shí)會(huì)減弱無(wú)菌濾液的拮抗效果，當(dāng)溫度高于80 ℃時(shí)，抑菌活性喪失，說(shuō)明該無(wú)菌濾液中的有效成分不耐高溫。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)油茶主要病害的拮抗菌進(jìn)行雙重篩選，最終獲得1株能同時(shí)高效拮抗油茶主要病害和歐文氏菌的解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）D2WM。該菌株分離自油茶健康植株根際土壤，經(jīng)檢測(cè)無(wú)致病性，具有較穩(wěn)定的生防作用。現(xiàn)有報(bào)道中解淀粉芽孢桿菌多見(jiàn)于對(duì)真菌的抑制，王英國(guó)等從堆肥中分離到1株解淀粉酶芽孢桿菌，通過(guò)產(chǎn)生抗菌多肽類物質(zhì)拮抗尖孢鐮刀菌、草莓蛇病菌、毛霉和黑曲霉等多種真菌[14]。勾長(zhǎng)龍等分離獲得1株對(duì)人參根腐病病原菌拮抗作用較強(qiáng)的解淀粉芽孢桿菌HB-3，其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)人參根腐病病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有顯著的抑制作用[15]。同時(shí)也有利用解淀粉芽孢桿菌對(duì)采后柑橘綠霉病的生防效果的相關(guān)研究等[16]。本研究篩選得到的解淀粉芽孢桿菌對(duì)油茶的6種主要病害真菌均有較好的抑制作用，同時(shí)還能較好地抑制細(xì)菌性軟腐病歐文氏菌的3個(gè)亞種，說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌確實(shí)是理想的生防菌株來(lái)源。

研究表明，解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生抑菌蛋白類、脂肽類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類、寡肽酶、肽類和聚酮化合物等[17-21]。本研究對(duì)解淀粉芽孢桿菌D2WM的抑菌物質(zhì)特性研究表明，其無(wú)菌濾液耐酸堿范圍較廣，在偏堿性條件下的抑菌活性更高，但是其熱穩(wěn)定性較差，推測(cè)其抑菌物質(zhì)成分中含有蛋白類[18]。下一步將分別采用有機(jī)溶劑提取法和硫酸銨沉淀法從菌株發(fā)酵液中制備出抑菌物質(zhì)粗提液和粗蛋白液，并對(duì)活性粗提物進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析[22-23]，為揭示拮抗菌的物質(zhì)基礎(chǔ)和拮抗機(jī)制奠定基礎(chǔ)。另外，該拮抗菌株液體培養(yǎng)代謝產(chǎn)物只需要在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～20 h即可獲得較好的拮抗效果，相對(duì)于一般細(xì)菌、真菌大大縮短了培養(yǎng)時(shí)間，降低了生產(chǎn)成本[6]。

目前，對(duì)油茶主要病害和細(xì)菌性軟腐病普遍通過(guò)種植抗性品種和化學(xué)防治來(lái)控制，過(guò)多地使用化學(xué)殺菌劑有危害人類身體健康、藥物殘留破壞生態(tài)環(huán)境、引發(fā)病原物產(chǎn)生抗藥性、影響產(chǎn)品質(zhì)量和食用安全等諸多缺點(diǎn)，不利于綠色可持續(xù)發(fā)展[4]。尋求安全、高效和經(jīng)濟(jì)的生物源農(nóng)藥已成為當(dāng)前防治細(xì)菌性軟腐病和油茶病害的熱點(diǎn)和當(dāng)務(wù)之急，其中拮抗微生物在植物病害生物防治中起到十分重要的作用。本研究首次報(bào)道了單一微生物菌劑同時(shí)防治多種油茶病原真菌和歐文氏菌的3個(gè)亞種，在油茶真菌病害及蔬菜細(xì)菌性軟腐病的無(wú)公害防治上有一定的應(yīng)用潛力。

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