牡蠣共生菌Chaetomium globosum ML4發(fā)酵液的化學(xué)成分及其體外抗腫瘤活性研究

萬(wàn)丹　陳曦　朱力　王鳳舞　孔桂美　曹桂云　申麗

[摘要]采用硅膠柱色譜、Sephadex LH20凝膠柱色譜、制備薄層色譜和高效液相色譜等方法對(duì)牡蠣共生菌Chaetomium globosum ML4發(fā)酵液的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，獲得5個(gè)化合物。利用高分辨質(zhì)譜、核磁共振譜及文獻(xiàn)比對(duì)的方法，將上述化合物分別鑒定為chaetoglobosin V（1），chaetoglobosin Vb（2），tyrosol（3），5methyluracil（4），uracil（5）。采用MTT法測(cè)定化合物對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721的體外細(xì)胞毒活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物1對(duì)SMMC7721細(xì)胞具有明顯的增殖抑制活性，其IC50為605 mg·L-1，陽(yáng)性對(duì)照藥順鉑的IC50為1996 mg·L-1。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，化合物1可引起SMMC7721細(xì)胞G2期細(xì)胞周期阻滯，并能誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡；SMMC7721細(xì)胞中Bcl2/Bax的比值下降，Caspases3，8，9的表達(dá)增加，Akt蛋白的表達(dá)和磷酸化水平下降。上述結(jié)果表明，化合物1對(duì)SMMC7721細(xì)胞的體外抗腫瘤活性與誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2期阻滯以及細(xì)胞凋亡相關(guān)；其誘導(dǎo)凋亡作用同時(shí)涉及線粒體途徑和死亡受體途徑，且與PI3K/Akt信號(hào)通路活性下降相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]牡蠣； 共生菌； Chaetomium globosum； 化學(xué)成分； 抗腫瘤活性

[Abstract]Isolation and purification of chemical constituents of liquid culture of symbiotic Chaetomium globosum ML4 of oyster was performed through silica gel column chromatography， gel filtration over Sephadex LH20， preparative TLC and HPLC Five compounds were obtained and their structures were determined as chaetoglobosin V（1）， chaetoglobosin Vb（2）， tyrosol（3）， 5methyluracil（4）and uracil（5）， respectively， based on HRMS and NMR data and comparison with literatures In vitro cytotoxicity of compounds against human hepatocellular carcinoma cell line SMMC7721 were measured byMTT method， and results showed that compound 1 could obviously inhibit the proliferation of SMMC7721 cells with an IC50 value of 605 mg·L-1， while the IC50 value of positive control cisplatin was 1996 mg·L-1 Further studies discovered that compound 1 could lead to G2 phase arrest in SMMC7721 cells and induce SMMC7721 cells apoptosis The ratio of Bcl2/Bax in SMMC7721 cells was decreased The expression of protein Caspases3，8，9 was improved and the expression and phosphorylation level of Akt were reduced Aforementioned results revealed that in vitro antitumor activity of compound 1 against SMMC7721 cells were related to G2 phase cell cycle arrest and inducedapoptosis The inducedapoptosis was involved in both the mitochondrial pathway and the death receptor pathway and connected with activity decline of PI3K/Akt signaling pathway

[Key words]oyster； symbiotic microorganism； Chaetomium globosum； chemical constituents； antitumor activity

牡礪是一種常見(jiàn)的海洋貝類動(dòng)物，具有很高的食用和藥用價(jià)值，在中醫(yī)藥領(lǐng)域具有相當(dāng)重要的地位。作為一種傳統(tǒng)的中藥材，中國(guó)古代醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)《神農(nóng)本草經(jīng)》、《海藥本草》、《本草綱目》等對(duì)牡礪均有記載。中醫(yī)臨床的重要經(jīng)典著作《傷寒論》和《金匾要略》中共有14個(gè)方劑涉及海洋藥物，其中有11個(gè)方劑用到牡礪[1]。牡蠣的藥用價(jià)值與其所含的化學(xué)成分密切相關(guān)[2]。研究表明，很多從海洋動(dòng)物中分離得到的活性物質(zhì)實(shí)際是由其共生微生物所產(chǎn)生[34]，牡蠣共生菌也極有可能產(chǎn)生與牡蠣相同或相似的藥理活性成分。

前期實(shí)驗(yàn)中，王鳳舞博士從青島海域的牡蠣中分離得到一株球毛殼菌Chaetomium globosum（菌株編號(hào)ML4）。本課題組對(duì)其發(fā)酵液的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化，得到5個(gè)化合物chaetoglobosin V（1），chaetoglobosin Vb（2），tyrosol（3），5methyluracil（4），uracil（5），化合物1結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，chaetoglobosin V（1）對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC7721具有明顯的體外抗腫瘤活性；該活性與誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞G2期細(xì)胞周期阻滯以及細(xì)胞凋亡相關(guān)；還發(fā)現(xiàn)，chaetoglobosin V（1）的誘導(dǎo)凋亡作用同時(shí)涉及線粒體途徑和死亡受體途徑，且受到PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控。endprint

1材料

AVANCE600核磁共振儀、AVANCE Ⅲ HD 400核磁共振儀和UHRTOF maXis 超高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，德國(guó)Bruker公司；Primaide高效液相色譜儀和UV3900紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本日立公司；Isolera one快速純化制備液相色譜儀，瑞典Biotage公司；Thermo Series Ⅱ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；ELX800多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；JYZY5 Western blot電泳儀，美國(guó)BioRad公司；5475R超速低溫離心機(jī)和5415D小型高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司等。

LaChrom C18色譜柱（46 mm×150 mm，5 μm），日本日立公司；Poroshell 120 ECC18色譜柱（46 mm×150 mm，5 μm），美國(guó)安捷倫公司；柱色譜硅膠（200～300目），青島海洋化工廠分廠；GF254硅膠預(yù)制板（20 cm×20 cm），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Silica gel 60 F254鋁板（20 cm×20 cm），德國(guó)Merck公司；Sephadex LH20，瑞典Pharmacia Biotech；氘代丙酮和氘代DMSO，美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories；氘代甲醇，青島騰龍微波科技公司；色譜純甲醇，美國(guó)TEDIA化學(xué)試劑有限公司；人肝癌細(xì)胞株SMMC7721，上海中科院細(xì)胞研究所；RPMI1640培養(yǎng)基，美國(guó)GIBCO公司；新生牛血清，上海洛神生物技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT），美國(guó)Amresco公司；碘化丙錠（PI），上海江萊生物有限公司；FITC Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，美國(guó)BD公司；胰蛋白酶和PVDF膜，北京索萊寶科技有限公司；兔抗人Bcl2，Bax，Caspase3，Caspase8，Akt，pAkt和βactin的單克隆抗體，小鼠抗人Caspase9的單克隆抗體和羊抗兔IgG抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔抗小鼠IgG抗體，北京博士德公司；脫脂奶粉，北京普利萊公司；蛋白質(zhì)Marker，美國(guó)Ferments公司；Super ECL Plus超敏發(fā)光液，北京普利萊公司；順鉑，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；其余試劑均為分析純。

2方法

21菌株來(lái)源和發(fā)酵液的提取與分離菌株ML4是王鳳舞博士2014年從青島膠州灣海域牡蠣中分離得到的一株真菌，根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)特征以及18S rDNA序列比較，鑒定其為球毛殼菌Ch. globosum [5]。該菌種現(xiàn)保存到中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)為CGMCC No6571。

Ch. globosum ML4采用液體發(fā)酵法[5]。發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取3次、減壓蒸餾去除溶劑后得粗浸膏32 g。粗浸膏經(jīng)硅膠柱色譜分離，梯度洗脫（氯仿甲醇 100∶0～0∶100）得到7個(gè)組分。Fr3（020 g）經(jīng)Sephadex LH20凝膠柱色譜（氯仿甲醇1∶1）分離得到Fr36（5810 mg）和Fr37（1553 mg）。Fr36經(jīng)HPLC（LaChrom C18色譜柱，220 nm，甲醇水 50∶50，08 mL·min-1）分離純化得到化合物2（13 mg，tR =199 min）和化合物1（12 mg，tR =319 min）。Fr37經(jīng)HPLC（LaChrom C18色譜柱，220 nm，甲醇水 40∶60，08 mL·min-1）分離純化得到化合物3（05 mg，tR =155 min）。Fr4（020 g）經(jīng)Sephadex LH20凝膠柱色譜（氯仿甲醇1∶1）分離得到的Fr46（5670 mg），先經(jīng)TLC制備、再經(jīng)HPLC（Poroshell 120 ECC18色譜柱，205 nm，甲醇水 30∶70，08 mL·min-1）進(jìn)一步純化得到化合物4（20 mg，tR =23 min）。Fr5（028 g）經(jīng)硅膠柱色譜得到的Fr54（114 mg）經(jīng)Sephadex LH20凝膠柱色譜（氯仿甲醇1∶1）分離得到Fr546（550 mg），F(xiàn)r546經(jīng)TLC制備、再經(jīng)HPLC（LaChrom C18色譜柱，254 nm，甲醇水 20∶80，08 mL·min-1）純化得到化合物5（15 mg，tR =21 min）。

22MTT法測(cè)定化合物體外細(xì)胞毒活性SMMC7721細(xì)胞在含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC7721細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，常規(guī)貼壁培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入2 μL待測(cè)化合物（少量DMSO助溶，DMSO終濃度01%），陰性對(duì)照組（negative control，NC）和空白組分別加入等體積DMSO和培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)孵育4 h。然后棄去培養(yǎng)液，每孔滴加150 μL DMSO，37 ℃振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔吸光度。

23流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC7721細(xì)胞接種在6孔板中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。然后每孔分別加入等量的化合物，干預(yù)48 h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃保存過(guò)夜，至少固定18 h。上機(jī)測(cè)試前，2 400 r·min-1離心10 min除去乙醇，將細(xì)胞重懸于04 mL碘化丙錠染液中（其中含RNaseA），37 ℃保溫30 min（碘化丙錠染液終濃度為50 mg·L-1，RNaseA終濃度為20 mg·L-1），然后用400目網(wǎng)篩過(guò)濾。最后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，應(yīng)用ModFit LT30軟件分析細(xì)胞周期中各期細(xì)胞所占總細(xì)胞的百分率。endprint

24流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率采用Annexin V/PI雙染技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC7721細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為80×105個(gè)/mL，每孔05 mL接種于6孔板中，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加藥物20 μL于孔內(nèi)，處理48 h；胰酶消化，收集細(xì)胞至15 mL離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，并用PBS洗滌2遍；吸棄上清，每管加入500 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞；每管中加入5 μL AnnexinV和10 μL PI混勻，避光室溫孵育15 min；300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，混懸均勻，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

25Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)取加藥處理后的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，以預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入相應(yīng)體積的1×SDS蛋白裂解液，冰上放置30 min。以刮棒刮下細(xì)胞，沸水浴10 min，然后4 ℃12 000 r·min-1離心10 min。取上清，用改良Lowry法進(jìn)行蛋白定量。調(diào)整樣品蛋白質(zhì)濃度使其相等，保證每個(gè)樣品孔蛋白上樣量一致。蛋白質(zhì)經(jīng)SDSPAGE后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。PVDF膜以5%脫脂奶粉封閉4 h后，加入一抗過(guò)夜。經(jīng)洗滌后，再加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫下反應(yīng)3～4 h。每步反應(yīng)結(jié)束均用TBST洗滌3次，每次10 min。最后顯影，用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

26統(tǒng)計(jì)分析方法采用SPSS 170進(jìn)行單因素方差分析，組間差異采用t檢驗(yàn)法比較，P<005為差異有顯著性，P<001為差異有非常顯著性。

3結(jié)果

31結(jié)構(gòu)鑒定化合物1白色粉末；HRESIMS m/z 551251 4 [M+Na]+，567245 4 [M+K]+，分子式C32H36N2O5（C32H36N2O5Na理論值551251 6）；1HNMR（DMSOd6，600 MHz）δ：1089（1H，s，1′NH），888（1H，s，19OH），821（1H，s，2NH），744（1H，d，J=78 Hz，H4′），733（1H，d，J=84 Hz，H7′），706（1H，t，J=72 Hz，H6′），704（1H，s，H2′），697（1H，t，J=72 Hz，H5′），628（1H，dd，J=156，108 Hz，H13），517（1H，t，J=132 Hz，H14），469（1H，d，J=72 Hz，7OH），385（1H，s，H7），355（1H，dd，J=180，78 Hz，H22a），338（1H，m，H3），294（1H，s，H4），279（1H，s，H17），272（1H，dd，J=144，54 Hz，H10a），255（1H，dd，J=132，72 Hz，H15a），243（1H，dd，J=174，54 Hz，H22b），241（1H，s，H21），231（1H，dd，J=144，102 Hz，H10b），230（1H，m，H16），214（1H，t，J=102 Hz，H8），185（3H，s，H25），179（1H，dd，J=240，108 Hz，H15b），152（3H，s，H12），111（3H，s，H11），064（3H，d，J=66 Hz，H24）；13CNMR（DMSOd6，150 MHz）δ：2095（C23），2020（C20），1738（C1），1481（C19），1449（C18），1360（C1′a），1337（C6），1317（C13），1313（C14），1269（C3′a），1255（C5），1234（C2′），1208（C6′），1183（C5′），1179（C4′），1113（C7′），1098（C3′），677（C7），630（C9），569（C3），534（C8），487（C4），418（C17），408（C22），400（C21），379（C15），316（C10），311（C16），168（C11），153（C24），143（C12），119（C25）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：2087（C23），2027（C20），1750（C1），1476（C18），1464（C19），1364（C1′a），1351（C14），1325（C6），1300（C13），1268（C5），1267（C3′a），1233（C2′），1222（C6′），1196（C5′），1183（C4′），1115（C7′），1109（C3′），691（C7），632（C9），574（C3），540（C8），496（C4），430（C17），413（C22），399（C21），384（C15），326（C10），319（C16），174（C11），156（C24），141（C12），122（C25）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]對(duì)照，故鑒定化合物1為chaetoglobosin V。

化合物2白色粉末；HRESIMS m/z 551251 1 [M+Na]+，分子式C32H36N2O5（C32H36N2O5Na理論值551251 6）；1HNMR（acetoned6，600 MHz）δ：1013（1H，s，1′NH），756（1H，d，J=78 Hz，H4′），740（1H，d，J=78 Hz，H7′），728（1H，s，2NH），716（1H，s，H2′），710（1H，t，J=72 Hz，H6′），702（1H，t，J=78 Hz，H5′），624（1H，dd，J=150，102 Hz，H13），522（1H，m，H14），408（1H，d，J=84 Hz，H7），366（1H，d，J=72 Hz，7OH），360（1H，m，H3），350（1H，dd，J=156，54 Hz，H22a），324（1H，s，H4），287（1H，m，H10a），261（1H，dd，J=138，90 Hz，H10b），241（1H，s，H21），230（1H，d，J=144 Hz，H15a），227（1H，t，J=96 Hz，H8），225（1H，s，H17），216（1H，d，J=150 Hz，H22b），206（3H，s，H25），199（1H，dd，J=240，120 Hz，H15b），167（1H，m，H16），163（3H，s，H12），128（3H，s，H11），108（3H，d，J=66 Hz，H24）；13CNMR（acetoned6，150 MHz）δ：2129（C23），2044（C20），1763（C1），1515（C18），1477（C19），1386（C1′a），1356（C6），1353（C14），1326（C13），1293（C3′a），1281（C5），1255（C2′），1232（C6′），1207（C5′），1202（C4′），1133（C7′），1126（C3′），710（C7），671（C9），595（C3），561（C17），556（C8），523（C21），518（C4），462（C15），454（C22），446（C16），341（C10），230（C24），184（C11），178（C25），156（C12）； 13CNMR（C5D5N，150 MHz）δ：2125（C23），2042（C20），1758（C1），1517（C18），1468（C19），1377（C1a），1349（C6），1337（C14），1321（C13），1281（C3′a），1269（C5），1247（C2′），1218（C6′），1194（C5′），1190（C4′，1122（C7′），1115（C3′），698（C7），664（C9），584（C3），550（C8），550（C17），511（C21），510（C4），448（C15），446（C16），435（C22），337（C10），220（C24），175（C11），171（C25），150（C12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7] 對(duì)照，故鑒定化合物2為chaetoglobosin Vb。endprint

化合物3白色粉末；1HNMR（CD3OD，600 MHz）δ：701（2H，d，J=84 Hz，H4，H8），668（2H，d，J=84 Hz，H5，H7），367（2H，t，J=42 Hz，H1），270（2H，t，J=72 Hz，H2）；13CNMR（CD3OD，150 MHz）δ：1568（C6），1309（C3，C4，C8），1162（C5，C7），646（C1），395（C2）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8] 對(duì)照，故鑒定化合物3為酪醇（tyrosol）。

化合物4白色粉末；HRESIMS m/z 149032 3[M+Na]+，分子式C5H6N2O2（C5H6N2O2Na理論值149032 1）；1HNMR（DMSOd6，600 MHz）δ：1082（2H，br s，1NH，3NH），724（1H，d，J=12 Hz，H6），172（3H，d，J=12 Hz，5CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9] 對(duì)照，故鑒定化合物4為5甲基尿嘧啶（5methyluracil）。

化合物5白色粉末；1HNMR（DMSOd6，600 MHz）δ：1083（2H，br s，1NH，3NH），738（1H，d，J=78 Hz，H6），541（1H，d，J=78 Hz，H5）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9] 對(duì)照，故鑒定化合物5為尿嘧啶（uracil）。

32化合物的體外細(xì)胞毒活性采用MTT法測(cè)定化合物對(duì)SMMC7721細(xì)胞的體外細(xì)胞毒活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物1能劑量依賴性地抑制SMMC7721細(xì)胞的增殖，其IC50為605 mg·L-1，而陽(yáng)性對(duì)照藥順鉑的IC50為1996 mg·L-1，見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組相比1）P<005，2）P<001（圖2～6同）。

33化合物1對(duì)SMMC7721細(xì)胞的細(xì)胞周期影響細(xì)胞增殖受細(xì)胞周期的精密調(diào)控，細(xì)胞周期調(diào)控的異常成為腫瘤產(chǎn)生的一種內(nèi)因。為探討化合物1對(duì)SMMC7721細(xì)胞的增殖抑制作用是否與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)，本研究采用一定濃度的化合物1處理SMMC7721細(xì)胞48 h，然后收集細(xì)胞，經(jīng)乙醇固定、PI染色，然后進(jìn)行細(xì)胞周期分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物1干預(yù)后，SMMC7721細(xì)胞的G2期細(xì)胞比例由陰性對(duì)照（NC）的（073±055）%分別增加至（199±084）%，（403±138）%，（783±456）%，（1252±324）%，（2404±651）%。這表明，化合物2可導(dǎo)致SMMC7721細(xì)胞的G2期細(xì)胞增多，即G2期細(xì)胞周期阻滯，見(jiàn)圖2。

34化合物1對(duì)SMMC7721細(xì)胞凋亡率的影響腫瘤不僅是細(xì)胞增殖失控和細(xì)胞分化異常的結(jié)果，更與腫瘤細(xì)胞凋亡失衡有著密切的關(guān)系[10]。為探究化合物1對(duì)SMMC7721細(xì)胞的增殖抑制作用是否與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)，本研究采用一定濃度的化合物1處理SMMC7721細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，檢

測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物1能劑量依賴性地促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞凋亡，與陰性對(duì)照組相比，藥物處理組細(xì)胞凋亡率（包括早期凋亡和晚期凋亡）分別上升至（728±405）%，（1308±745）%，（1439±775）%，（1629±682）%，（2116±552）%，見(jiàn)圖3。

35化合物1對(duì)SMMC7721細(xì)胞中Bcl2和Bax表達(dá)的影響bcl2基因家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)者，Bcl2蛋白家族包括2個(gè)蛋白亞群，一類抑制細(xì)胞凋亡（抗凋亡蛋白），如：Bcl2，BclxL等；另一類促進(jìn)細(xì)胞凋亡（促凋亡蛋白），如：Bax，Bad，Bim，Bid等。研究發(fā)現(xiàn)，bcl2原癌基因是抑制凋亡的主要基因，多種腫瘤組織中bcl2基因高表達(dá)[11]。Bcl2/Bax的比值在凋亡過(guò)程中具有重要意義，Bcl2和Bax可通過(guò)形成同源或異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[12]。本研究采用一定濃度的化合物1處理SMMC7721細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞蛋白，采用Western blot分析Bcl2和Bax的含量，以未加藥孔蛋白作陰性對(duì)照（NC），βactin為內(nèi)參。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化合物1處理后，SMMC7721細(xì)胞中Bcl2表達(dá)明顯下降，Bax表達(dá)略微上升，Bcl2/Bax比值明顯下降，見(jiàn)圖4，提示Bax可通過(guò)形成同源二聚體促進(jìn)SMMC7721細(xì)胞凋亡。

36化合物1對(duì)SMMC7721細(xì)胞Caspases蛋白的影響Caspases蛋白是一族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要

作用的效應(yīng)蛋白，它們一般通過(guò)蛋白水解激活或失活底物蛋白實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)[13]。其中，Caspase3 是細(xì)胞凋亡中最重要的執(zhí)行者之一，它的激活是凋亡發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的一步。目前，細(xì)胞凋亡有2條主要的途徑，即Caspase9參與的線粒體凋亡途徑和Caspase8參與的死亡受體途徑[14]。為確認(rèn)化合物1對(duì)SMMC7721細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用是否與上述2條凋亡途徑相關(guān)，本研究采用一定濃度的化合物1處理SMMC7721細(xì)胞48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Caspases3，8，9的表達(dá)均明顯上升，見(jiàn)圖5，這說(shuō)明化合物1誘導(dǎo)的SMMC7721細(xì)胞凋亡同時(shí)涉及線粒體凋亡途徑和死亡受體途徑。

37化合物1對(duì)SMMC7721細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路活性的影響PI3K（phosphoinositide 3 kinase，磷脂酰肌醇3激酶）/Akt（也被稱為蛋白激酶B，protein kinase B，PKB）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)多種蛋白的磷酸化而參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等[15]。Akt是原癌基因cakt的表達(dá)產(chǎn)物，也是PI3K分子下游重要的靶蛋白。PI3K/Akt信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路活性常異常增高[16]。為了解化合物1對(duì)SMMC7721細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路活性的影響，本研究采用一定濃度的化合物1處理SMMC7721細(xì)胞48 h后，采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Akt和pAkt的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SMMC7721細(xì)胞中Akt和pAkt水平均明顯下降見(jiàn)圖6，可推測(cè)化合物1通過(guò)下調(diào)Akt蛋白的表達(dá)和降低Akt的磷酸化活性而誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡。endprint

4結(jié)論

特殊生態(tài)環(huán)境下的微生物與特殊的次生代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，因此，微生物源新藥或先導(dǎo)化合物的篩選將更多注意力集中于特殊生境微生物。C globosum ML4是從青島海域的牡蠣中分離獲得的一株海洋真菌，其為適應(yīng)外部特殊環(huán)境，自身形成極為特殊的基因類型和生理機(jī)制，有著不同的遺傳背景和代謝途徑，能夠產(chǎn)生特殊的次生代謝產(chǎn)物。本研究從C globosum ML4發(fā)酵液中分離獲得5個(gè)化合物，其中chaetoglobosin V（1）和chaetoglobosin Vb（2）是細(xì)胞松弛素化合物。細(xì)胞松弛素化合物因具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抑制HIV蛋白酶、免疫抑制、抑制乙酰膽堿酯酶和神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)等多種藥理活性[1718]，而引起科研人員的廣泛關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn)，chaetoglobosin V（1）對(duì)SMMC7721細(xì)胞具有一定的體外抗腫瘤活性，其可劑量依賴性引起SMMC7721細(xì)胞G2期阻滯、誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡；chaetoglobosin V（1）還可下調(diào)SMMC7721細(xì)胞中抑凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)、上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)SMMC7721細(xì)胞中Caspases3，8，9蛋白表達(dá)增加、Akt蛋白的表達(dá)和磷酸化水平皆下降，這說(shuō)明chaetoglobosin V（1）對(duì)SMMC7721細(xì)胞的體外抗腫瘤活性與G2期細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡相關(guān)；其誘導(dǎo)凋亡作用與Bcl2和Bax相關(guān)，涉及線粒體途徑和死亡受體途徑，且與PI3K/Akt信號(hào)通路活性下降相關(guān)。其抗腫瘤機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中主要起負(fù)調(diào)控作用，可以阻遏腫瘤細(xì)胞迅速生長(zhǎng)，不少腫瘤的發(fā)生機(jī)制與凋亡受阻密切相關(guān)[10，19]。研究發(fā)現(xiàn)，廣泛用于肝癌、胃癌、卵巢癌、食道癌和肺癌等的化療藥物長(zhǎng)春新堿、喜樹(shù)堿、5氟尿嘧啶和順鉑等，可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)治療癌癥[20]。因此，研究藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，可以為癌癥的治療以及新藥開(kāi)發(fā)提供新思路。

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[責(zé)任編輯丁廣治]endprint