丁苯酞對(duì)血管性癡呆大鼠記憶能力及海馬CA1區(qū)Caspase—3表達(dá)的影響

毛西京　朱博馳　于挺敏

[摘要] 目的 觀察丁苯酞對(duì)血管性癡呆大鼠記憶能力及海馬CA1區(qū)凋亡基因Caspase-3表達(dá)的影響，探討丁苯酞對(duì)血管性癡呆的保護(hù)作用。方法 將80只SPF級(jí)健康Wistar大鼠按隨機(jī)區(qū)組法分為4個(gè)組，每組20只：血管性癡呆模型組（VD組）、血管性癡呆模型+丁苯酞氯化鈉注射液組（NBP治療組）、假手術(shù)+丁苯酞氯化鈉注射液組（NBP對(duì)照組）、假手術(shù)組（Sham組），每組再分為4個(gè)亞組：術(shù)后1、2、4、8周，每個(gè)亞組5只。永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備VD大鼠模型。NBP對(duì)照組和NBP治療組大鼠術(shù)后1 d開(kāi)始給予丁苯酞氯化鈉注射液腹腔注射，劑量為5 mg/（kg·d），Sham組和VD組大鼠給予生理鹽水腹腔注射（0.2 mL/d）。各組大鼠連續(xù)腹腔注射給藥7 d。術(shù)后8周亞組大鼠，在術(shù)前、術(shù)后4周和術(shù)后8周進(jìn)行記憶能力測(cè)試（Morris水迷宮）。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)（1、2、4、8周），留取海馬組織，采用免疫組化法觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3的表達(dá)。 結(jié)果 NBP治療組大鼠逃避潛伏期較VD組大鼠明顯縮短（P < 0.05）。VD組和NBP治療組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)灰度明顯高于Sham組（P < 0.05）；術(shù)后4周和8周時(shí)，NBP治療組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯低于VD組大鼠相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)（P < 0.05）。VD大鼠術(shù)后8周時(shí)海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)灰度明顯高于術(shù)后1周時(shí)（P < 0.05）。 結(jié)論 NBP對(duì)VD大鼠記憶能力有明顯改善作用，考慮與其抑制VD大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3過(guò)度表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 丁苯酞；血管性癡呆；海馬；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R743 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）10（a）-0009-04

[Abstract] Objective To study the effects of 3-n-butylphthalide （NBP） on memory and Caspase-3 expression in the hippocampal CA1 region of vascular dementia rats， in order to explore protective effects and mechanisms of NBP on rats with vascular dementia （VD）. Methods A total of 80 SPF Wistar rats were divided into vascular dementia models group （VD group）， vascular dementia models + NBP injection group （NBP treatment group）， sham surgery + NBP injection group （NBP control group）， sham surgery group （Sham group）， according to random group method. Then each group was divided into four subgroups （n = 5）： 1， 2， 4， and 8 weeks after surgery. VD models were established by ligating bilateral common carotid artery. Then the rats in the NBP treatment group and NBP control group were intraperitoneally injected with NBP 5 mg/（kg·d） for 7 consecutive days. The rats in the VD group and Sham group were intraperitoneally injected with saline （0.2 mL/d） for 7 consecutive days. Memory ability of 8 weeks subgroup rats were tested by Morris water maze at 4 and 8 weeks after surgery. At 1， 2， 4， and 8 weeks after surgery， the rats in each group were decapitated. The brains were obtained， and then hippocampus were isolated. Caspase-3 expression in the hippocampal CA1 region were determined by immunohistochemistry. Results Compared with VD group， escape latency in the NBP treatment group were significantly shorter （P < 0.05）. At 1， 2， 4 and 8 weeks after surgery， Caspase-3 expression in the VD group and NBP treatment group were significantly increased than those in the Sham group （P < 0.05）. Compared with VD group， Caspase-3 expression in the NBP treatment group were significantly lower at 4 and 8 weeks after surgery （P < 0.05）. In VD group， Caspase-3 expression at 8 weeks after surgery was significantly higher than at 1 weeks （P < 0.05）. Conclusion NBP can improve the memory ability of VD rats， which may be connected with the overexpression of caspase-3 in the hippocampus CA1 region of VD rats.endprint

[Key words] 3-n-butylphthalide； Vascular dementia； Hippocampus； Cell apoptosis

丁苯酞（3-n-butylphthalide，NBP）是治療急性期腦梗死的國(guó)家級(jí)一類新藥[1]。臨床和基礎(chǔ)研究均發(fā)現(xiàn)NBP對(duì)血管性癡呆（vascular dementia，VD）具有良好的治療和干預(yù)效果[2-5]，但其作用機(jī)制還缺乏深入的研究。VD發(fā)生的最常見(jiàn)病因是腦血管病后的長(zhǎng)期慢性腦缺血，細(xì)胞凋亡則是最重要的病理機(jī)制[6-7]。天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinases，Caspases）是細(xì)胞凋亡的具體介導(dǎo)者和執(zhí)行者[8]，其中Caspase-3則是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子和凋亡信號(hào)傳遞的共同通路[9-10]。本研究在制備VD大鼠模型的基礎(chǔ)上，觀察NBP對(duì)VD大鼠記憶能力的改善作用，同時(shí)檢測(cè)大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3的表達(dá)變化，探討NBP對(duì)VD大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

SPF級(jí)Wistar大鼠80只，雌雄各半，體重（210+10）g，購(gòu)于吉林大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（吉）2003-001。丁苯酞氯化鈉注射液（生產(chǎn)廠家：石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司）。大鼠抗激活型Caspase-3多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物公司。Morris水迷宮XR-XM101，上海欣軟信息科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)區(qū)組法分為4個(gè)組，每組20只：血管性癡呆模型組（VD組）、血管性癡呆模型+丁苯酞注射劑組（NBP治療組）、假手術(shù)+丁苯酞注射劑組（NBP對(duì)照組）、假手術(shù)組（Sham組）。每組又分為4個(gè)亞組：術(shù)后1、2、4、8周，每個(gè)亞組5只。

1.3 VD大鼠模型制備

采用永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備VD大鼠模型。術(shù)前禁食、禁水8 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，頸前正中做一個(gè)長(zhǎng)約1 cm的縱形切口，逐層分離各層組織結(jié)構(gòu)，分離出頸總動(dòng)脈，以1號(hào)絲線永久結(jié)扎頸總動(dòng)脈，同法結(jié)扎另一側(cè)頸總動(dòng)脈。Sham組和NBP對(duì)照組大鼠操作與VD組和NBP治療組大鼠一致，但不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈。

1.4 藥物干預(yù)

NBP對(duì)照組和NBP治療組大鼠清醒后，腹腔注射丁苯酞氯化鈉注射液，劑量為5 mg/（kg·d），Sham組和VD組大鼠腹腔注射生理鹽水（0.2 mL/d）。連續(xù)給藥7 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大鼠記憶能力測(cè)試 用Morris水迷宮進(jìn)行大鼠記憶能力的檢測(cè)（各組術(shù)后8周亞組的大鼠，在術(shù)前、術(shù)后4周和術(shù)后8周進(jìn)行測(cè)試）。Morris水迷宮是一個(gè)高50 cm、直徑120 cm的圓柱水池，將水迷宮劃分四個(gè)象限，將一個(gè)高30 cm、直徑12 cm的透明圓柱型有機(jī)玻璃平臺(tái)置于其中一個(gè)象限中心，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間平臺(tái)位置和水迷宮內(nèi)外參照物都要保持不變。池壁四個(gè)象限各選擇一個(gè)入水點(diǎn)，相鄰兩個(gè)入水點(diǎn)間距基本均等，向池內(nèi)注入自來(lái)水，加入奶粉使池水混濁不清，水面高出平臺(tái)2～3 cm，水溫在25℃左右。第一次實(shí)驗(yàn)預(yù)先訓(xùn)練大鼠，使其在水迷宮中自由游動(dòng)2 min，并在平臺(tái)上站立20 s，適應(yīng)環(huán)境。測(cè)試時(shí)將大鼠分別從水迷宮的4個(gè)入水點(diǎn)放入水中，記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期，將其作為大鼠記憶能力的指標(biāo)，如果大鼠在1 min沒(méi)未找到平臺(tái)則由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)其找到平臺(tái)，逃避潛伏期記為1 min。

1.5.2 標(biāo)本采集及免疫組化 術(shù)后1、2、4、8周，各組大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟灌流5 min，取腦，分離海馬，10%中性福爾馬林液固定48 h，PBS洗脫3次，80%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明后，石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片。免疫組化采用SP法操作（Caspase-3多克隆抗體稀釋度為1∶100）。每張組織切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（400倍鏡下），測(cè)定陽(yáng)性表達(dá)灰度值，并計(jì)算每個(gè)視野下的陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)所占細(xì)胞總數(shù)的比率，細(xì)胞表達(dá)平均灰度=視野灰度×陽(yáng)性細(xì)胞比率，以5個(gè)視野的平均值表示。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠記憶能力測(cè)試結(jié)果

同組內(nèi)比較，NBP治療組和VD組大鼠術(shù)后4周和8周逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于術(shù)前（P < 0.05），術(shù)后4周和8周逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；NBP對(duì)照組和Sham組各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。組間比較，術(shù)前各組逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；術(shù)后4周和8周，VD組大鼠和NBP治療組大鼠逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于Sham組（P < 0.05），NBP治療組大鼠逃避潛伏期較VD組大鼠明顯縮短（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 Caspase-3蛋白在各組大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)特征

Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯示為黃棕色顆粒，主要定位于細(xì)胞漿。VD組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目較少，排列紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，Caspase-3表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，NBP治療組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷明顯減小，Caspase-3表達(dá)顯著減弱。見(jiàn)圖1（封四）。

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3蛋白的表達(dá)情況

VD組和NBP治療組大鼠術(shù)后1、2、4周和8周時(shí)海馬CA1區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)灰度明顯高于同期Sham組（P < 0.05）；NBP治療組大鼠4周和8周時(shí)海馬CA1區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯低于同期VD組大鼠（P < 0.05）。同組內(nèi)比較，VD組大鼠術(shù)后8周大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)灰度明顯高于術(shù)后1周（P < 0.05）。見(jiàn)表2。endprint

3 討論

永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法符合VD發(fā)病病理基礎(chǔ)，與人類VD的發(fā)生具有最大程度的相似性[11-12]，因此本研究VD大鼠模型采用此法制備。免疫組化結(jié)果顯示：VD組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較少，排列紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性；而NBP治療組大鼠損傷明顯減輕。Morris水迷宮可以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)大鼠記住周圍環(huán)境中幫助其定位水下平臺(tái)線索的能力[13]。本研究結(jié)果顯示：VD組和NBP治療組術(shù)后4周和術(shù)后8周水迷宮逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于術(shù)前（P < 0.05），說(shuō)明VD模型大鼠記憶力受損，造模成功。術(shù)后4周，NBP治療組大鼠逃避潛伏期較VD組大鼠明顯縮短（P < 0.05）；術(shù)后8周，NBP治療組大鼠逃避潛伏期也較VD組大鼠明顯縮短（P < 0.05），說(shuō)明NBP對(duì)VD大鼠的空間記憶和空間定位能力具有改善作用。

Caspases是細(xì)胞凋亡的具體介導(dǎo)者和執(zhí)行者[8]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子和凋亡信號(hào)傳遞的共同通路，它的表達(dá)情況不僅可以反映細(xì)胞凋亡的水平，同時(shí)還可以提示凋亡因素的存在[14-18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：VD組大鼠1、2、4周和8周時(shí)海馬CA1區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯升高，且隨著時(shí)間呈逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，8周時(shí)VD組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)最強(qiáng)。Caspase-3蛋白的過(guò)度表達(dá)可以引起大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。NBP治療組大鼠在4周和8周時(shí)海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)較VD組明顯下降（P < 0.05），說(shuō)明NBP可以抑制VD組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3的過(guò)度表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)在制備VD大鼠的基礎(chǔ)上，應(yīng)用NBP給予干預(yù)治療，可以改善VD大鼠記憶能力。觀察不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：VD組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯升高，且隨著時(shí)間呈逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，8周時(shí)VD組大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)最強(qiáng)，證實(shí)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素Caspase-3蛋白參與VD的發(fā)病過(guò)程。NBP干預(yù)治療后，VD大鼠在4周和8周時(shí)海馬CA1區(qū)Caspase-3表達(dá)明顯下降，提示NBP可以抑制VD大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3的過(guò)度表達(dá)，從而減弱腦缺血造成的遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

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（收稿日期：2017-06-22 本文編輯：李岳澤）endprint