永春老醋耐酸微生物分離純化及葡萄醋發(fā)酵應(yīng)用

李 巖，宋 佳，夏夢(mèng)雷，馬應(yīng)倫，鄭 宇*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京 100081；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；3.福建永春老醋醋業(yè)有限責(zé)任公司，福建 泉州 362600）

永春老醋耐酸微生物分離純化及葡萄醋發(fā)酵應(yīng)用

李 巖1，宋 佳2，夏夢(mèng)雷2，馬應(yīng)倫3，鄭 宇2*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 研究生院，北京 100081；2.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；3.福建永春老醋醋業(yè)有限責(zé)任公司，福建 泉州 362600）

該研究對(duì)永春老醋發(fā)酵過程樣品中主要微生物進(jìn)行了分離純化，從中篩選出3株具有較高耐酸性菌株YCA-6、YCL-5和YCL-6，經(jīng)16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)分別屬于巴氏醋桿菌（Acetobacter pastemianu）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。利用乳酸菌和醋酸菌混合微生物菌株進(jìn)行葡萄醋的靜置液態(tài)發(fā)酵，利用Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)其添加比例進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)其有機(jī)酸組成進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，菌株YCA-6、YCL-5和YCL-6接種量分別為3.0%、5.0%和5.0%的條件下混合進(jìn)行葡萄醋靜置發(fā)酵獲得的葡萄醋總酸（以醋酸計(jì)）約為6.5 g/100 mL。

永春老醋；醋酸菌；乳酸菌；葡萄醋

食醋是人們?nèi)粘ｏ嬍持兄匾乃嵝哉{(diào)味品，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，食醋對(duì)保健養(yǎng)生有多種功效（如消除疲勞，增進(jìn)食欲、幫助消化、平衡血液酸堿度、調(diào)節(jié)血脂血糖、降血壓、提高肝功能等）[1]。我國(guó)大部分傳統(tǒng)食醋采用固態(tài)發(fā)酵的工藝[2]，歐美國(guó)家普遍采用液態(tài)深層發(fā)酵[3]。

傳統(tǒng)的食醋釀造多采用開放式的發(fā)酵方式，過程有多種微生物參與，微生物的代謝產(chǎn)物與原料分解產(chǎn)物共同形成了發(fā)酵食品特有的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)特征品質(zhì)[4]。福建永春老醋又名福建紅曲醋，是我國(guó)四大名醋之一，主要以紅曲、糯米、白糖和芝麻為原料，采用傳統(tǒng)液態(tài)發(fā)酵法，經(jīng)過多年陳釀而成，其產(chǎn)品酸而不澀、酸中帶甜，具有一種令人愉快的香氣[5-7]。采用非培養(yǎng)法與培養(yǎng)法對(duì)永春老醋發(fā)酵過程中細(xì)菌菌群進(jìn)行研究，結(jié)果表明紅曲醋中的微生物主要有醋酸菌、乳酸菌、霉菌、酵母等，其中產(chǎn)酸微生物主要是醋酸菌和乳酸菌，如巴氏醋桿菌（Acetobacter pastemianu）、醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）、甲醇酸單胞菌（Acetobacter methanolica）、斯氏葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter swingsii）、歐羅巴葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter europaeus）等；希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）等[8-10]。

近年來隨著人們生活水平的提高和生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)步，以水果作為原料生產(chǎn)的果醋及果醋飲料受到市場(chǎng)的青睞，消費(fèi)量逐年攀升[11]。果醋是以水果或濃縮果汁為原料生產(chǎn)的酸性調(diào)味品，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，而且具有保健功能。其中蘋果醋及蘋果醋飲料是消費(fèi)量最大的產(chǎn)品[12]。目前，果醋的發(fā)酵生產(chǎn)主要利用純種醋酸菌，采用自吸式發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，該生產(chǎn)工藝雖然發(fā)酵效率高、過程容易控制[13-14]，但也存在產(chǎn)品風(fēng)味單一、同質(zhì)化嚴(yán)重等問題[15]。本試驗(yàn)對(duì)永春老醋發(fā)酵過程主要微生物進(jìn)行純化，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化微生物組合，利用混合微生物進(jìn)行葡萄醋的液態(tài)靜置發(fā)酵，以期改善果醋風(fēng)味，開發(fā)新產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 微生物

分離微生物樣品取自永春老醋發(fā)酵陳釀階段：福建永春老醋醋業(yè)有限責(zé)任公司；葡萄酒果酒專用酵母SY：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

耐酸醋酸菌分離培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏0.5 g/L，蛋白胨0.5 g/L，碳酸鈣5 g/L，瓊脂25 g/L，醋酸30 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)3.5%。

耐酸乳酸菌分離培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，無水乙酸鈉5 g/L，吐溫80 1 g/L，檸檬酸銨2 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.25 g/L，碳酸鈣3 g/L，醋酸30 g/L，瓊脂25 g/L，pH 6.2～6.8。

種子液培養(yǎng)基：葡萄酒（乙醇體積分?jǐn)?shù)3.5%，添加葡萄糖10 g/100 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄酒（乙醇體積分?jǐn)?shù)6.0%，總酸0.6～1.0 g/100 mL，還原糖10 g/100 mL）。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖：天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉：北京化學(xué)試劑公司；酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀：天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸銅：上海金山亭新化工試劑廠；無水乙醇、吐溫-80、氫氧化鈉、乙酸鈉、檸檬酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳（均為分析純）：天津市元立化工有限公司；碳酸鈣：天津市天大化學(xué)試劑廠；濃縮葡萄汁：某飲料公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YJ-875S醫(yī)用凈化臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；WS2-134-75電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠；1X2-1LLJ100普通光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司；WYT-4手持糖度折光儀：上海精密儀器儀表有限公司；SBA-40C生物傳感儀：山東省科學(xué)院。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 醋酸菌和乳酸菌的篩選

將樣品原液、10倍及102倍樣品稀釋液涂布于加有30g/L醋酸的分離培養(yǎng)基中篩選耐酸菌株，培養(yǎng)溫度30℃，挑取單菌落劃線于相應(yīng)的新的平板中，進(jìn)行純化。

利用添加30 g/L初始醋酸的葡萄醋發(fā)酵培養(yǎng)基，采用液態(tài)培養(yǎng)方法篩選具有較好耐酸性的醋酸菌和乳酸菌。將活化好的乳酸菌和醋酸菌分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃條件下靜置發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間7d，500mL搖瓶裝液量200mL。

1.3.2 微生物的鑒定

通過革蘭氏染色，在油鏡下觀察并記錄菌體形態(tài)，并參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第九版）》對(duì)不同形態(tài)的細(xì)菌進(jìn)行保藏。利用細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)分析。

1.3.3 葡萄酒發(fā)酵

用無菌水將濃縮葡萄汁含糖量調(diào)至200～220 g/L，將活化好的SY酵母（稀釋后的葡萄汁25℃條件下活化30min）液按照接種量2 g/kg（以活性干酵母粉質(zhì)量計(jì)）加入葡萄汁中混合均勻，在25℃條件下密閉發(fā)酵。待發(fā)酵液中還原糖含量基本穩(wěn)定不變、氣泡消失則終止發(fā)酵，葡萄酒置于4℃保藏備用。

1.3.4 葡萄醋發(fā)酵

用無菌水將葡萄酒乙醇體積分?jǐn)?shù)稀釋為6.0%，補(bǔ)加葡萄糖至還原糖10 g/100 mL，將活化好的乳酸菌和醋酸菌分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃條件下靜置發(fā)酵，500 mL搖瓶裝液量200 mL，發(fā)酵時(shí)間30 d，每隔24 h搖晃混勻。

1.3.5 葡萄醋發(fā)酵微生物添加比例的優(yōu)化

利用Design-Expert設(shè)計(jì)Box-Behnken 3因素3水平優(yōu)化試驗(yàn)，在發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間30 d，500 mL搖瓶裝液量200 mL的條件下優(yōu)化醋酸菌YCA-6，乳酸菌YCL-5和YCL-6的接種量，以感官評(píng)分（Y）作為響應(yīng)值，通過回歸方程構(gòu)建擬合因素與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系，尋求最優(yōu)的變量組合，其因素編碼水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.6 測(cè)定方法

有機(jī)酸組成分析：采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定葡萄醋中有機(jī)酸組成。樣品處理：將樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取2 mL稀釋液于2mLEP管內(nèi)，以12000r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后取上清液，濾液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。HPLC檢測(cè)條件：參考文獻(xiàn)[16]中的方法，HPLC檢測(cè)條件如下：Aminex HPX-87H色譜柱（7.8 mm×300 mm）；柱溫：30℃；流速：0.6 mL/min；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)：215 nm；流動(dòng)相：5 mmol/mL硫酸；運(yùn)行時(shí)間為21 min。

總酸的測(cè)定：應(yīng)用酸堿滴定法對(duì)發(fā)酵液中的酸進(jìn)行測(cè)定[12]。乙醇含量：采用SBA生物傳感儀測(cè)定。糖度：采用手持折光儀進(jìn)行測(cè)定。

感官評(píng)價(jià)：隨機(jī)抽取10名食品專業(yè)學(xué)生組成評(píng)分小組按照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)葡萄醋進(jìn)行打分，滿分10分，取平均值作為評(píng)分結(jié)果，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 葡萄醋感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of grape vinegar

2 結(jié)果與分析

2.1 永春老醋中耐酸微生物的篩選及菌種鑒定

通過平板分離的方法，從永春老醋樣品中分別獲得出具有較高醋酸耐受性的醋酸菌9株，乳酸菌7株，并利用添加了30 g/L醋酸的葡萄酒培養(yǎng)基比較其醋酸耐酸性，結(jié)果如圖1所示。

圖1 醋酸菌（A）、乳酸菌（B）菌株耐酸性比較Fig.1 Acid resistance comparison of acetic acid bacteria(A)and lactic acid bacteria(B)

根據(jù)圖1各菌株的耐酸性，選擇醋酸菌YCA-6，乳酸菌YCL-5和YCL-6進(jìn)一步分析。在顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如表3所示。

同時(shí)利用PCR方法擴(kuò)增其16S rDNA進(jìn)行測(cè)序分析，通過GenBank數(shù)據(jù)庫比對(duì)，初步證明醋酸菌YCA-6屬于巴氏醋桿菌（Acetobacter pastemianu）、乳酸菌YCL-5屬于瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、乳酸菌YCL-6屬于干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）。

表3 菌體形態(tài)觀察及種屬鑒定Table 3 Morphology and species identification of strains

2.2 混合微生物發(fā)酵葡萄醋接種量?jī)?yōu)化

設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)，以感官評(píng)分作為響應(yīng)值，優(yōu)化醋酸菌YCA-6、乳酸菌YCL-5和YCL-6的接種量，結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。由表5可知，模型項(xiàng)P=0.001 0，說明模型顯著性差異良好，模型擬合較好，可信度極高。失擬差P=0.060 4＞0.05，說明所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例較小，結(jié)果可靠。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.948 6，校正系數(shù)R=0.882 6。說明模型可以解釋94.86%的感官品評(píng)，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為6.73%，信噪比為9.397，試驗(yàn)的可靠性高。由回歸模型和方差分析得知，方程一次項(xiàng)A、C，方程二次項(xiàng)A2、C2，交互項(xiàng)AB對(duì)感官評(píng)分的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；方程二次項(xiàng)B2對(duì)感官評(píng)分的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；方程一次項(xiàng)B，交互項(xiàng)AC、BC對(duì)感官評(píng)分的影響不顯著（P＞0.05）。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments

表5 回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果Table 5 Regression coefficients and significance test results for the constructed quadratic polynomial model equation

為了進(jìn)一步研究相關(guān)因素之間的交互作用和各菌株最優(yōu)的接種量，利用Design-Expert軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到相應(yīng)的響應(yīng)面及等高線圖如圖2所示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到感官評(píng)分（Y）響應(yīng)面的回歸模擬方程：Y=9.20-0.69A+0.29B+0.85C-1.03AB-0.40AC+0.20BC-1.39A2-0.84B2-1.16C2。通過方程求解可得A、B、C對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)值為A=-0.52，B=0.55，C=0.50，修正后接種量分別為醋酸菌YCA-6 3.0%，乳酸菌YCL-5 5.0%，乳酸菌YCL-6 5.0%，在此條件下發(fā)酵獲得的葡萄醋感官評(píng)分最高為9.7分。

圖2 醋酸菌YCA-6、乳酸菌YCL-5、乳酸菌YCL-6接種量交互作用對(duì)葡萄醋感官品質(zhì)影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between acetic acid bacteria YCA-6,lactic acid bacteria YCL-5 and YCL-6 inoculum on grape vinegar evaluation quality

2.3 混合微生物發(fā)酵葡萄醋有機(jī)酸組成分析

圖3 混合微生物發(fā)酵葡萄醋過程曲線Fig.3 Fermentation curves of grape vinegar with mixed microorganisms

利用得出的最佳接種量進(jìn)行混菌靜置葡萄醋發(fā)酵，發(fā)酵過程曲線如圖3所示。由圖3可知，發(fā)酵約35 d完成，乙醇含量＜0.5 g/100 mL，總酸度為6.5 g/100 mL（以醋酸計(jì)），還原糖含量（6.00±0.26）g/100 mL。

利用HPLC對(duì)葡萄醋有機(jī)酸組成進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4所示。生產(chǎn)的葡萄醋中其主要的有機(jī)酸是醋酸（55.11±0.07）g/L，此外還含有蘋果酸、乳酸、檸檬酸等多種有機(jī)酸，賦予葡萄醋豐富的口感。利用該方法生產(chǎn)的葡萄醋酸甜適中，口感柔和，并且具有葡萄特有的香氣。

圖4 葡萄醋中有機(jī)酸組成Fig.4 Organic acids constitute of the grape vinegar

3 結(jié)論

本研究從永春老醋發(fā)酵過程樣品中篩選到了具有較高醋酸耐受性的巴氏醋桿菌（Acetobacterpastemianu）YCA-6，瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）YCL-5和干酪乳桿菌（Lactobacilluscasei）YCL-6，并將其應(yīng)用于葡萄醋的靜置液態(tài)發(fā)酵。利用Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化了這3株菌的添加比例，結(jié)果表明，菌株YCA-6，YCL-5和YCL-6在接種量3.0%，5.0%和5.0%的條件下發(fā)酵獲得的葡萄醋品質(zhì)最好。在此條件下進(jìn)行葡萄醋靜置發(fā)酵，發(fā)酵周期約35 d，葡萄醋總酸約為6.5 g/100 mL（以醋酸計(jì)），醋酸是其主要的有機(jī)酸，此外還含有蘋果酸、乳酸、檸檬酸等多種有機(jī)酸，同時(shí)含有約6.0 g/100 mL的糖，賦予葡萄醋豐富的口感。利用該工藝生產(chǎn)的葡萄醋，酸甜適中，口感柔和，具有葡萄特有的香氣。

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Separation and purification of acid tolerant microorganisms from Yongchun aged vinegar and their application on grape vinegar fermentation

LI Yan1,SONG Jia2,XIA Menglei2,MA Yinglun3,ZHENG Yu2*
(1.Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,School of Biological Engineering,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China;3.Fujian Yongchun Laocu Vinegar Industry Co.,Ltd.,Quanzhou 362600,China)

The main microorganism in Yongchun aged vinegar fermentation was isolated and purified,three strains(YCA-6,YCL-5 and YCL-6)with high acid tolerance were screened.With 16S rDNA sequence analysis,results showed that the strains were identified asAcetobacter pastemianu,Lactobacillus helveticus,Lactobacillus casei,respectively.Using lactic acid bacteria and acetic acid bacteria mixed microorganism for static liquid fermentation,the strains addition ratio was optimized by Box-Behnken experiments,and the organic acid composition of grape vinegar was analyzed.The results showed that the optimized inoculum for grape vinegar fermentation with strains YCA-6,YCL-5 and YCL-6 were 3.0%,5.0%and 5.0%,respectively.Under the conditions,the total acid(in acetic acid)of grape vinegar with mixed strains static fermentation was 6.5 g/100 ml.

Yongchun aged vinegar;acetic acid bacteria;lactic acid bacteria;grape vinegar

TS264.2

0254-5071（2017）10-0120-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.025

2017-07-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31201406）；天津市科技支撐計(jì)劃（16YFZCNC00650）

李 巖（1982-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵調(diào)味品生產(chǎn)技術(shù)。

*通訊作者：鄭 宇（1980-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵過程和微生物功能分析。