紫外誘變選育耐酸酵母菌株及其特性研究

楊小沖，陳忠軍*，趙 潔，丁鵬澤，賈美芳，高 欣，胡佳星

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

紫外誘變選育耐酸酵母菌株及其特性研究

楊小沖，陳忠軍*，趙 潔，丁鵬澤，賈美芳，高 欣，胡佳星

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

以實驗室保存的耐酸酵母菌株YM1-1為出發(fā)菌株，在其對數(shù)生長期進行紫外誘變處理，經(jīng)過三級篩選后，最終篩得一株在pH 1.8強酸環(huán)境中仍可存活的突變菌株YM1-1E。在其特性研究中發(fā)現(xiàn)，菌株YM1-1E最適生長溫度和pH值分別為36℃和5.5，能耐受500 mg/L SO2、14%乙醇和65%的葡萄糖溶液。突變菌株YM1-1E在pH值為2.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵6 d后，發(fā)酵液酒精度為4.5%vol，糖醇轉(zhuǎn)化率為46.39%，可溶性固形物含量為9.7%，較出發(fā)菌株YM1-1相比，產(chǎn)酒精能力提升了25%。

耐酸；酵母菌；紫外誘變；特性

酵母菌株作為一種真菌類的單細胞微生物，主要生長在偏酸性、含糖且潮濕的環(huán)境中，最適生長溫度與pH值分別為25～30℃和pH 4.5～5.5[1]，常應用于酒精發(fā)酵工業(yè)當中。而在釀造行業(yè)中，在前期發(fā)酵過程中酵母菌株產(chǎn)生有機酸并不斷累積[2]，使得發(fā)酵醪液pH進一步降低。在強酸環(huán)境下，酵母菌株的代謝逐漸受到影響，增殖速度放慢、存活率降低、發(fā)酵性能受到抑制等，導致發(fā)酵原料利用不充分，生產(chǎn)成本大大增加。馮文婧等[3]通過構(gòu)建人工耐酸系統(tǒng)并對獲取的耐酸菌株長期馴化，篩得一株能夠耐受pH 2.5酸性環(huán)境的酵母菌株WJ-2?，F(xiàn)如今大部分工業(yè)菌株在pH＜3.0的條件下已難以生存[4]，遠遠不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，因此耐酸酵母菌株的選育極為重要。

目前，為獲得滿足生產(chǎn)需求的目的菌株，常采用自然選育、誘變育種、全局轉(zhuǎn)錄工程等技術(shù)手段來改造菌株[5]，隨著越來越多新型育種方式如高能粒子流、重離子輻照、常壓室溫等離子體（atmosphericandroom-temperatureplasma，ARTP）育種[6-7]等技術(shù)手段的開發(fā)，使準確、高效選育耐酸酵母菌株成為可能。而紫外誘變由于設備簡單、安全可靠、易操作、無毒害等特點備受關注。本研究采用紫外誘變育種技術(shù)，對酵母菌株YM1-1進行誘變處理，選育在pH≤2.5的高酸條件下仍能保持旺盛代謝活動的酵母菌株，并對其生物學特性及發(fā)酵特性進行了研究。以期獲得能夠在高酸環(huán)境中保持良好發(fā)酵性能的酵母菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗菌株：本實驗室保藏在pH 3.0條件下的野生耐酸酵母菌株YM1-1。

葡萄糖：上海山浦化工有限公司；大豆蛋白胨、瓊脂（生化試劑）：天津市英博生化試劑有限公司；酵母浸膏（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）、無水乙醇：國藥集團化學試劑有限公司；硫酸銨、亞硫酸、磷酸二氫鉀：天津化學試劑三廠；硫酸鎂：天津市致遠化學試劑有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，大豆蛋白胨10 g，酵母浸膏10 g，水1 000 mL，pH=6.0，115 ℃滅菌20 min。

YPD固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，大豆蛋白胨10 g，酵母浸膏10g，瓊脂20g，水1000mL，pH=6.0，115℃滅菌20min。

TTC上層培養(yǎng)基[8]：TTC 0.05 g，葡萄糖0.5 g，瓊脂1.5 g，水100 mL，pH自然，煮沸滅菌2 min。

TTC下層培養(yǎng)基[8]：即為YPD固體培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基[9]：葡萄糖360 g，酵母浸膏10 g，大豆蛋白胨20 g，硫酸銨1 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂1 g，水1 000 mL，pH=2.5，115℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

PB-10賽多利斯pH酸度計：德國賽多利斯公司；SE602F電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實驗設備廠；752紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；PAL-1糖度儀：日本ATAGO公司；WZB數(shù)顯折光儀：上海儀電物理光學儀器有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺：濟南來保醫(yī)療器械有限公司；SPX-160BF-2生化培養(yǎng)箱精密液晶型：上海福瑪實驗設備有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；TG16-WS臺式高速離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化和菌懸液的制備

菌株活化：將酵母菌株YM1-1接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)48 h后，按照2%的接種量，將其接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)上述操作再次進行傳代培養(yǎng)，以下試驗所用菌株均為第三代菌液。

菌懸液的制備：取10 mL第三代菌液于4 000 r/min離心3 min后棄除上清液，并用生理鹽水將菌泥洗滌3次，置于裝有小玻璃珠的錐形瓶中振蕩15 min，通過平板菌落計數(shù)方法將菌懸液活菌濃度調(diào)節(jié)為1×108CFU/mL。

1.3.2 突變菌株的篩選

菌株的誘變處理：將30W的紫外燈源提前預熱30min，根據(jù)紫外誘變預試驗結(jié)果，選擇致死率為80%[10]的輻照時間，將對數(shù)生長期菌株YM1-1的菌懸液置于距紫外燈源25 cm處誘變處理100 s。

耐酸性菌株篩選：將誘變處理的菌懸液按照5%的接種量接種到pH值為1.8的YPD液體培養(yǎng)基中，28℃避光培養(yǎng)48 h后，將菌懸液劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取長勢較好、菌落較大的單菌落，于28℃斜面保藏。

TTC法篩選[11]：采用劃線法將耐酸性能較好的突變菌株接種于TTC下層培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)48 h后，在TTC下層培養(yǎng)基表面覆蓋一層TTC上層培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)3 h后，觀察培養(yǎng)基的顯色情況。根據(jù)TTC顯色原理，培養(yǎng)基顯色越明顯，顏色越深，表明菌株的產(chǎn)酒精能力越強[12]，從中篩選出產(chǎn)酒精能力強的突變菌株。

杜氏小管法篩選：將TTC法篩選出的產(chǎn)酒精能力較強的突變菌株，按照5%的接種量分別接種到裝有杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，分別在12 h、24 h、36 h、48 h記錄各試管中杜氏小管的產(chǎn)氣情況[13]。

1.3.3 生物學特性試驗

（1）最適生長溫度試驗：將最終篩選出的突變菌株按照5%的接種量接入YPD液體培養(yǎng)基中，分別于20℃、28℃、36℃、44℃、52℃恒溫培養(yǎng)48 h，并設置三組平行試驗，在波長600 nm處測定其吸光度值。

（2）SO2耐受試驗[14]：將亞硫酸添加到已滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，使得YPD液體培養(yǎng)基中SO2質(zhì)量濃度分別為50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L，并依次接入5%的突變菌株，同時設置三組平行試驗，于28℃恒溫培養(yǎng)48 h后，在波長600 nm處測定菌懸液的吸光度值。

（3）乙醇耐受試驗：將篩選出的突變菌株按照5%的接種量分別接種到乙醇含量為6%、8%、10%、12%、14%、16%的YPD液體培養(yǎng)基中，并設置三組平行試驗。于28℃培養(yǎng)48 h，觀察并記錄杜氏小管中的產(chǎn)氣情況。

（4）葡萄糖耐受試驗：將篩選出的突變菌株按照5%的接種量分別接種到葡萄糖含量為10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%的YPD固體培養(yǎng)基中，并設置三組平行試驗，于28℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察并記錄菌株的生長狀況。

（5）最適生長pH試驗[15]：將篩選出的突變菌株按照5%的接種量，分別接種到pH值為1.5、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的YPD液體培養(yǎng)基中，并設置三組平行試驗。于28℃恒溫培養(yǎng)48 h后，在波長600 nm處測定其吸光度值。

1.3.4 發(fā)酵特性試驗[16]

將出發(fā)菌株YM1-1與篩選出的突變菌株按照5%的接種量分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并設置三組平行試驗，于28℃，130 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵，每24 h測定一次發(fā)酵醪液CO2失質(zhì)量，發(fā)酵6 d后，測定各發(fā)酵醪液中的殘?zhí)橇?、酒精度、pH及可溶性固形物含量。

1.3.5 遺傳穩(wěn)定性試驗[17]

將篩選出的突變菌株進行5次傳代培養(yǎng)，并將每代突變菌株菌懸液按照5%的接種量接種于pH 2.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并設置三組平行試驗，28℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)6 d后，測定每代突變菌株的產(chǎn)酒精能力，從而驗證菌株的突變性能是否能夠穩(wěn)定遺傳。

1.3.6 檢測方法

殘?zhí)橇浚菏褂帽銛y式糖度儀測定發(fā)酵醪液中的殘?zhí)呛?；pH值：采用pH酸度計對發(fā)酵醪液的pH值進行測定；可溶性固形物：使用數(shù)顯折光儀測定發(fā)酵醪液中可溶性固形物含量；酒精度：參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]中規(guī)定的方法進行測定；CO2失質(zhì)量[19]：每隔24 h對發(fā)酵醪液進行精確稱量，起止兩次稱量的質(zhì)量之差即為發(fā)酵醪液的CO2失質(zhì)量；糖醇轉(zhuǎn)化率[20]：按照參考文獻[20]中的方法測定后進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 正向突變菌株篩選

2.1.1 耐酸性篩選

菌株YM1-1菌懸液經(jīng)紫外誘變處理后，接種到pH值為1.8的YPD液體培養(yǎng)基中進行耐酸性篩選，根據(jù)突變菌株在YPD固體培養(yǎng)基中生長情況，最終篩選出6株耐酸性能較強的突變菌株，分別編號為YM1-1A、YM1-1B、YM1-1C、YM1-1D、YM1-1E、YM1-1F，并以此6株突變菌株作為后續(xù)試驗菌株。

2.1.2 TTC法篩選

6株突變菌株在TTC上層培養(yǎng)基中的顯色情況如表1所示。

表1 6株突變菌株TTC篩選試驗結(jié)果Table 1 Results of TTC screening tests of 6 mutant yeast strains

由表1可知，菌株YM1-1A、YM1-1E、YM1-1F的顯色反應最明顯，顏色均呈深紅色，表明該3株突變菌株的產(chǎn)酒精能力最強；其次為YM1-1C菌株，顯色為紅色；菌株YM1-1B顯色反應不明顯，呈粉紅色，表明其產(chǎn)酒精能力最弱。因此，對突變菌株YM1-1A、YM1-1E、YM1-1F進一步篩選。

2.1.3 杜氏小管法篩選

將突變菌株YM1-1A、YM1-1E、YM1-1F接種到裝有杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基，觀察其產(chǎn)氣情況，結(jié)果如表2所示。

表2 3株突變菌株杜氏小管試驗篩選結(jié)果Table 2 Results of Duchenne tubule tests of 3 mutant yeast strains

由表2可知，培養(yǎng)12 h后突變菌株YM1-1A與YM1-1E的產(chǎn)氣速度較快，當培養(yǎng)至24 h時，突變菌株YM1-1E所產(chǎn)CO2氣體已將杜氏小管充滿；當培養(yǎng)至36 h時，突變菌株YM1-1A所產(chǎn)CO2才將杜氏小管充滿，而突變菌株YM1-1F培養(yǎng)至48 h時杜氏小管仍未被CO2氣體充滿，經(jīng)過分析可得知產(chǎn)氣性能依次為菌株YM1-1E＞YM1-1A＞YM1-1F，故將突變菌株YM1-1E作為后續(xù)試驗菌株，對其進行生物學特性研究。

2.2 菌株生物學特性

2.2.1 最適生長溫度試驗

突變菌株YM1-1E在不同溫度的生長狀況如圖1所示。

圖1 突變菌株YM1-1E在不同溫度下的生長狀況Fig.1 Growth status of mutant strain YM1-1E at different temperatures

由圖1可知，隨著溫度升高，突變菌株YM1-1E的菌液OD600nm值先增大后減小，當培養(yǎng)溫度為36℃時，菌液OD600nm值達到最大，培養(yǎng)溫度繼續(xù)上升，菌液OD600nm值呈現(xiàn)遞減趨勢，可能是由于溫度過高使得酵母菌細胞內(nèi)酶的活性受到抑制甚至失活，從而影響酵母菌的增殖。因此，突變菌株YM1-1E的最適生長溫度為36℃。

2.2.2 SO2耐受試驗

突變菌株YM1-1E在不同質(zhì)量濃度SO2環(huán)境中的生長狀況如圖2所示。

圖2 突變菌株YM1-1E SO2耐受試驗結(jié)果Fig.2 Results of SO2tolerance tests of mutant strain YM1-1E

由圖2可知，當SO2質(zhì)量濃度為50～200 mg/L時，突變菌株YM1-1E的菌液OD600nm值在2.0左右，表明菌株YM1-1E生長良好，隨著SO2質(zhì)量濃度的繼續(xù)增大，菌液OD600nm值呈現(xiàn)遞減趨勢，表明菌株YM1-1E的生長受到抑制；當SO2質(zhì)量濃度為600 mg/L時，菌株YM1-1E停止生長。因此，突變菌株YM1-1E最高可耐受SO2質(zhì)量濃度為500 mg/L，與王東玉[21]所篩選的酵母菌株SO2耐受性（400 mg/L）相比，表明菌株YM1-1E具有較強的SO2耐受能力。

2.2.3 乙醇耐受試驗

突變菌株YM1-1E在不同乙醇含量的YPD液體培養(yǎng)基中的生長狀況如表3所示。

表3 突變菌株YM1-1E乙醇耐受試驗結(jié)果Table 3 Result of alcohol tolerance tests of mutant strain YM1-1E

由表3可知，隨著乙醇含量的增加，突變菌株YM1-1E的產(chǎn)氣量逐漸較少，這可能是由于乙醇對突變菌株YM1-1E的毒害[22]作用增大，使突變菌株YM1-1E的生理代謝和呼吸作用逐漸受到抑制；當乙醇含量為8%時，突變菌株YM1-1E產(chǎn)氣已不能將杜氏小管充滿；當乙醇含量為16%時，突變菌株YM1-1E則不再產(chǎn)氣。因此，突變菌株YM1-1E最高可耐受14%的乙醇。

2.2.4 糖耐受試驗

突變菌株YM1-1E在不同葡萄糖含量的YPD固體培養(yǎng)基中生長情況如表4所示。

表4 突變菌株YM1-1E耐糖試驗結(jié)果Table 4 Results of glucose tolerance tests of mutant strain YM1-1E

由表4可知，當葡萄糖含量為10%～30%時，菌株YM1-1E長勢良好，菌落較大；繼續(xù)增加葡萄糖含量，突變菌株YM1-1E生長開始受到抑制，可能是由于較高含量的葡萄糖使溶液滲透壓較大，細胞失水情況加重，從而抑制菌體的生長。當葡萄糖含量為65%時，突變菌株YM1-1E仍可存活，表明突變菌株YM1-1E具有較強的葡萄糖耐受能力。由此可知，突變菌株YM1-1E可耐受65%的葡萄糖溶液。

2.2.5 最適生長pH試驗

突變菌株YM1-1E在不同pH的YPD液體培養(yǎng)基中的生長情況如圖3所示。

圖3 突變菌株YM1-1E在不同pH值下的生長狀況Fig.3 Growth status of mutant strain YM1-1E at different pH values

由圖3可知，在pH值為2.0～5.5時，隨著pH值的上升，突變菌株YM1-1E菌液OD600nm值逐漸增大；當培養(yǎng)基pH值為5.5時，菌液OD600nm值達到最大為2.37，表明突變菌株YM1-1E在pH為5.5的條件下生長情況最佳；繼續(xù)增加培養(yǎng)基pH值，菌液OD600nm值開始下降。因此，突變菌株YM1-1E的最適生長pH值為5.5。

2.3 發(fā)酵特性試驗

將突變菌株YM1-1E與出發(fā)菌株YM1-1分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃發(fā)酵6 d后，檢測發(fā)酵醪液的殘?zhí)橇俊⒕凭?、pH、CO2失質(zhì)量、糖醇轉(zhuǎn)化率及可溶性固形物含量，結(jié)果如表5所示。

表5 突變菌株YM1-1E發(fā)酵特性試驗結(jié)果Table 5 Results of fermentation characteristics tests of mutant strain YM1-1E

由表5可知，發(fā)酵結(jié)束后，出發(fā)菌株YM1-1與突變菌株YM1-1E的發(fā)酵醪液中殘?zhí)橇糠謩e為18.9°Bx與16.8°Bx，出發(fā)菌株YM1-1的殘?zhí)橇可愿哂谕蛔兙闥M1-1E，表明在同一培養(yǎng)條件下突變菌株YM1-1E的降糖能力強于出發(fā)菌株YM1-1。突變菌株YM1-1E發(fā)酵液酒精度為4.5%vol，較出發(fā)菌株YM1-1（3.6%vol）相比，提高了25%，說明突變菌株YM1-1E具有較強的糖醇轉(zhuǎn)化能力，其糖醇轉(zhuǎn)化率為47.37%，但實際上卻稍低于出發(fā)菌株YM1-1，可見突變菌株YM1-1E在高酸環(huán)境中消耗過多的糖分以保持其較旺盛的代謝活動，從而抵抗外界環(huán)境的不利影響。綜合可知，突變菌株YM1-1E的發(fā)酵性能優(yōu)于出發(fā)菌株YM1-1，在實際生產(chǎn)中具有潛在的應用價值。

2.4 遺傳穩(wěn)定性試驗

將突變菌株YM1-1E連續(xù)5次傳代培養(yǎng)后，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃、130 r/min的條件下發(fā)酵6 d，菌株產(chǎn)酒精情況如圖4所示。

圖4 突變菌株YM1-1E遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果Fig.4 Results of genetic stability tests of mutant strain YM1-1E

由圖4可知，將突變菌株YM1-1E連續(xù)傳代培養(yǎng)后，5代菌株平均產(chǎn)酒精度為4.43%vol。其中2代菌株產(chǎn)酒精度最高為4.60%vol，5代菌株的酒精度基本維持在4.5%vol左右，表明突變菌株YM1-1E的突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳。

3 結(jié)論

本研究以野生型耐酸酵母菌株YM1-1為出發(fā)菌株進行紫外誘變處理，最終獲得一株在pH 1.8強酸條件下仍可存活的突變菌株YM1-1E，并對其生物學特性及發(fā)酵特性進行了研究。結(jié)果表明，突變菌株YM1-1E的最適生長溫度及pH值分別為36℃和5.5，乙醇耐受力為14%，SO2耐受力為500 mg/L，在葡萄糖含量為65%的環(huán)境下仍可以正常生長。發(fā)酵特性研究結(jié)果表明，在pH 2.5的酸性條件下發(fā)酵6 d后，突變菌株YM1-1E發(fā)酵醪液中酒精度為4.5%vol，糖醇轉(zhuǎn)化率為46.39%。遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，菌株YM1-1E的產(chǎn)酒精性能能夠穩(wěn)定遺傳。該研究在改善釀造行業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量，提高社會與經(jīng)濟效益，豐富我國的菌種資源庫等方面有著十分重要的意義。

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Breeding of acid-resistant yeast strain by UV mutation and its characteristics

YANG Xiaochong,CHEN Zhongjun*,ZHAO Jie,DING Pengze,JIA Meifang,GAO Xin,HU Jiaxing
(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

Using acid-resistant yeast strain YM1-1 preserved in laboratory as original strain,strain YM1-1 during the logarithmic growth phase was treated with ultraviolet mutagenesis.A mutant strain which could still survive in pH 1.8 acid environment was screened and obtained by three level screening.The results of its characteristic research showed that the optimum growth temperature and pH of strain YM1-1E were 36℃and 5.5,respectively,and could tolerate 500 mg/L SO2,14%alcohol and 65%glucose solution.Mutant strain YM1-1E was fermented in a fermentation medium with pH 2.5 for 6 d,then the alcohol content of fermentation broth was 4.5%vol,the conversion rate of sugar and alcohol was 46.39%,the soluble solid content was 9.7%.Compared with original strain YM1-1,the alcohol production capacity of mutant strain YM1-1E was increased by 25%.

acid resistance;yeast;ultraviolet mutagenesis;characteristics

TS261.1

0254-5071（2017）10-0109-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.023

2017-07-05

楊小沖（1990-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物學。

*通訊作者：陳忠軍（1971-），女，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程與食品微生物學。