紅薯淀粉廢水中乳酸菌的篩選及其對食源性致病菌的抑制作用

張可可，王雅棋，張 莉，劉吉雨，王 倫，曾曉瑜，于少猛，張廣樂，席 宇*

（1.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001；2.河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001；3.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，河南 鄭州 450002）

紅薯淀粉廢水中乳酸菌的篩選及其對食源性致病菌的抑制作用

張可可1，3，王雅棋1，張 莉2，劉吉雨1，王 倫1，曾曉瑜1，于少猛1，張廣樂2，席 宇1*

（1.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450001；2.河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001；3.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，河南 鄭州 450002）

從采集的紅薯淀粉廢水中分離出3株乳酸菌SPDJ3、SPEJ7和SPEJ9。通過培養(yǎng)特征、形態(tài)特征，生理生化特征及基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析的檢測，菌株SPDJ3和SPEJ7被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株SPEJ9被鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）。3株乳酸菌發(fā)酵上清液對供試8株食源性致病菌均有抑菌作用，菌株SPDJ3對福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）抑制效果較強，抑菌圈直徑為（30.37±0.15）mm，菌株SPEJ7和SPEJ9對蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）抑制效果較強，抑菌圈直徑分別為（29.43±0.21）mm和（28.27±0.25）mm。

乳酸菌；食源性致病菌；篩選；16S rDNA序列分析；抑菌作用

食源性致病菌引起的食物中毒和食源性疾病是全世界食品安全面臨的首要問題[1-4]。最近10年，我國由食源性致病菌引起的食品安全事件比例高達60%以上[5]。因此針對食源性致病菌檢測[6-9]和控制[10-11]的研究對食品安全質(zhì)量保障具有重要意義[2]。食品加工過程中食源性致病菌的防控措施主要分物理、化學和生物3類。與物化方法相比，不破壞食品品質(zhì)和不產(chǎn)生藥物殘留的生物法被認為是一種理想、安全和高效的控制方法[10]。生物法主要利用天然生物抗菌劑，如植物提取物[12-14]和微生物發(fā)酵產(chǎn)物[15-16]，抑制或者殺死食源性致病菌。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物在食品行業(yè)有廣泛的應用[17-18]，對不同來源乳酸菌的分離鑒定及其抗菌物質(zhì)的研究一直是國內(nèi)外研究者的研究熱點[19-20]。

紅薯淀粉廢水中含有高濃度有機物，在廢水處理過程中對其進行資源化利用很有必要[21-22]，盡管從紅薯淀粉廢水中分離乳酸菌或利用紅薯淀粉發(fā)酵制備乳酸已有報道[23-24]，但利用乳酸菌發(fā)酵紅薯淀粉廢水制備抗菌物質(zhì)尚鮮見文獻報道。本研究從采集的自然發(fā)酵變酸的紅薯淀粉廢水中分離鑒定了3株乳酸菌，并采用牛津杯雙層平板擴散法研究了這3株菌對常見的食源性致病菌的抑制活性，旨在為開發(fā)利用乳酸菌控制食源致病菌提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 廢水樣品及試劑

紅薯淀粉廢水：采集于河南省南陽市某紅薯淀粉加工廠淀粉生產(chǎn)過程中初次沉淀池（大漿池）和二次沉淀池（二漿池）的上層漿水。瓊脂粉：美國Sanland公司；CaCO3（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；0.5%堿性復紅染色液：北京陸橋技術(shù)股份有限責任公司。

1.1.2 菌株

供試食源性致病菌名稱、菌株編號及來源見表1。

表1 供試食源性致病菌指示菌株及其來源Table 1 Indicator strains and sources of foodborne pathogenic bacteria used in the experiments

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯、營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限責任公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SYQ-DSX-280B手提式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SBA-40E生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市實驗設備廠；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；Avanti J-25低溫高速離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；BS223S電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；0.22μm一次性針頭濾器：北京智杰方遠科技有限公司；牛津杯[內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，外徑（7.8±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm]：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的富集培養(yǎng)及分離

將采集的紅薯淀粉加工廢水上清液5 mL無菌操作接入裝液量為45 mL/150 mL MRS液體培養(yǎng)基中，混合均勻，37℃靜置培養(yǎng)24h后采用生物傳感分析儀檢測培養(yǎng)液是否產(chǎn)生L-乳酸，如有L-乳酸產(chǎn)生，取5 mL上述培養(yǎng)液無菌操作繼續(xù)加入裝液量為45 mL/150 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)24 h，梯度稀釋后分別取0.2 mL稀釋液涂布于CaCO3含量1.5%的MRS瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)48 h，選取鈣透明圈明顯的菌落進行劃線純化獲得純培養(yǎng)，4℃保藏于MRS瓊脂斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分離菌株的鑒定

形態(tài)觀察：分離菌株在MRS瓊脂平板上37℃培養(yǎng)24 h后，觀察菌落形態(tài)，利用0.5%堿性復紅染色液進行單染色，顯微鏡觀察細胞形態(tài)及排列并拍照。

生理生化特征：分離菌株的生理生化特性參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》方法進行檢測[25]。

分子生物學鑒定：分離菌株16S rDNA序列的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增及擴增序列測定委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行。16SrDNA基因序列進行BLAST比對，選取同源性較高及一些乳桿菌的16S rDNA序列進行匹配排列，MEGA 6.05軟件鄰接法進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.3.3 分離菌株對指示菌株抑制作用的檢測

將篩選的乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24 h，10 000 r/min、4℃離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm一次性針頭濾器過濾，濾液抑菌活性檢測采用牛津杯雙層平板擴散法[26]進行，實驗設置3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅薯淀粉廢水中乳酸菌的分離及其形態(tài)特征

表2 紅薯淀粉廢水中乳酸菌的分離Table 2 Isolation of lactic acid bacteria from sweet potato starch wastewater

紅薯淀粉廢水中乳酸菌的分離結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，從采集大漿池漿水樣品中共分離出3株菌：SPDJ1～SPDJ3。其中菌株SPDJ3在含CaCO3的MRS瓊脂平板上菌落周圍產(chǎn)生明顯的溶鈣圈，且MRS液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生L-乳酸，初步表明菌株SPDJ3為一株乳酸菌。二漿池漿水樣品中共分離出9株菌：SPEJ1～SPEJ9，菌株SPEJ1、SPEJ2、SPEJ6、SPEJ7和SPEJ9菌落周圍均產(chǎn)生溶鈣圈，僅菌株SPEJ7和SPEJ9相應的MRS液體培養(yǎng)基中檢測出L-乳酸。因此，菌株SPEJ7和SPEJ9為2株乳酸菌。

菌株SPDJ3、SPEJ7和SPEJ9的菌落形態(tài)和單染色鏡檢結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，菌株SPDJ3菌落呈白色，圓形隆起，表面濕潤，不透明，邊緣較整齊，菌體為短桿狀，兩端鈍圓，鏈狀或成簇排列；菌株SPEJ7菌落呈乳白色，圓形濕潤，邊緣整齊，質(zhì)地均勻，菌體呈兩端鈍圓桿狀，鏈狀或成簇排列；菌株SPEJ9菌落呈銀白色，菌落較小，圓形隆起不透明，表面濕潤，菌體呈細桿狀，成簇排列。

圖1 菌株SPDJ3、SPEJ7和SPEJ9的菌落特征及菌體形態(tài)Fig.1 Colony characteristics and bacterial morphology of strains SPDJ3,SPEJ7 and SPEJ9

2.2 分離菌株生理生化特性檢測

表3 分離的3株乳酸菌的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of 3 isolated lactic acid bacteria strains

分離的3株乳酸菌SPDJ3、SPEJ7和SPEJ9的生理生化特征見表3。由表3可知，3株菌株過氧化氫酶，接觸酶反應和硝酸鹽還原實驗均為陰性，不產(chǎn)生H2S和吲哚，不可能液化明膠，并且發(fā)酵葡萄糖均能產(chǎn)酸，但均不產(chǎn)氣。菌株SPDJ3和SPEJ7生理生化特征高度相似，能同化鼠李糖之外的所有供試碳源，因此可初步推斷出菌株SPDJ3和SPEJ7為一種菌。菌株SPEJ9不能利用阿拉伯糖、棉籽糖、木糖和鼠李糖。綜合生理生化特征可初步確定3株菌為乳桿菌屬菌株。

2.3 分離菌株分子生物學鑒定

菌株SPDJ3、SPEJ7和SPEJ9基于16S rDNA序列相似性的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。由圖2可知，菌株SPDJ3、SPEJ7和多株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）處于一個分支，菌株SPEJ9與副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）處于一個分支，置信度均為100。因此，結(jié)合3株菌的菌落特征、形態(tài)特征和生理生化特性，菌株SPDJ3和SPEJ7鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株SPEJ9鑒定為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）。

圖2 菌株SPDJ3、SPEJ7和SPEJ9基于16S rDNA序列相似性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence similarity of strains SPDJ3,SPEJ7 and SPEJ9

2.4 分離菌株對常見食源性致病菌抑制作用的檢測

分離的3株菌株對指示菌株的抑菌結(jié)果見表4。由表4可知，3株菌對供試8株食源性致病菌均有抑制作用。菌株SPDJ3對蠟樣芽胞桿菌和福氏志賀氏菌抑制效果較強，抑菌圈直徑分別為（29.03±0.06）mm和（30.37±0.15）mm，對金黃色葡萄球菌抑制效果較差，抑菌圈直徑為（15.03±0.15）mm；盡管菌株SPDJ3和SPEJ7的鑒定結(jié)果均為植物乳桿菌，菌株SPEJ7對蠟樣芽胞桿菌和福氏志賀氏菌的抑菌圈直徑分別為（29.43±0.21）mm和（25.97±0.15）mm，對腸炎沙門氏菌抑菌圈直徑為（12.73±0.21）mm，抑制效果相對較差。菌株SPEJ9對8株食源性致病菌均有良好的抑制作用，對阪崎腸桿菌的抑制作用較小，抑菌圈直徑為（18.20±0.20）mm，對蠟樣芽胞桿菌抑制作用最強，抑菌圈直徑為（28.27±0.25）mm。這3株乳酸菌對蠟樣芽孢桿菌均表現(xiàn)了良好的抑制效果，因此在生物防控食品中的蠟樣芽孢桿菌具有潛在的應用前景和開發(fā)價值。

表4 分離的3株乳酸菌對指示菌株的抑菌實驗結(jié)果Table 4 Antibacterial results of 3 strains of lactic acid bacteria against the indicator strains

3 結(jié)論

從紅薯淀粉廢水中分離了3株乳酸菌SPDJ3、SPEJ7和SPEJ9，經(jīng)培養(yǎng)特征、菌體形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA基因序列同源性等特征綜合檢測。結(jié)果表明，菌株SPDJ3和SPEJ7為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum），菌株SPEJ9為副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）。初步研究表明Lactobacillus plantarumSPDJ3和SPEJ7及Lactobacillus paracaseiSPEJ9這3株乳酸菌均對蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌等8種常見食源性致病菌具有不同的抑制作用。

[1]徐方旭，劉詩揚，蘭桃芳，等.食源性致病菌污染狀況及其應對策略[J].食品研究與開發(fā)，2014，35（1）：98-101.

[2]MARTINOVIC′T,ANDJELKOVIC′U,GAJDO?IK M ?,et al.Foodborne pathogens and their toxins[J].J Proteomics,2016,147(9):226-235.

[3]ALVAREZ-ORDó?EZ A,BROUSSOLLE V,COLIN P,et al.The adaptive response of bacterial food-borne pathogens in the environment,host and food:implications for food safety[J].Int J Food Microbiol,2015,213(11):99-109.

[4]VOJKOVSKá H,MY?KOVá P,GELBíCˇOVá T,et al.Occurrence and characterization of food-borne pathogens isolated from fruit,vegetables and sprouts retailed in the Czech Republic[J].Food Microbiol,2017,63(5):147-152.

[5]吳清平，李玉冬，張菊梅.常見食源性致病菌代謝組學研究進展[J].微生物學通報，2016，43（3）：609-618.

[6]黃小林，許恒毅，熊勇華，等.磁性納米材料在食源性致病菌分離中應用的研究進展[J].食品科學，2014，35（11）：280-285.

[7]周 莉，王 永，王法云，等.食品中金黃色葡萄球菌概況及新型檢測技術(shù)研究進展[J].中國釀造，2016，35（2）：1-4.

[8]WANG B B,WANG Q,CAI Z X,et al.Simultaneous,rapid and sensitive detection of three food-borne pathogenic bacteria using multicolor quantum dot probes based onmultiplex fluoroimmunoassay in food samples[J].LWT-Food Sci Technol,2015,61(2):368-376.

[9]FERRARIO C,LUGLI G A,OSSIPRANDI M C,et al.Next generation sequencing-based multigene panel for high throughput detection of foodborne pathogens[J].Int J Food Microbiol,2017,256(9):20-29.

[10]石金鑫，白鳳翎，呂欣然，等.乳酸菌拮抗食源性致病菌研究進展[J].食品工業(yè)科技，2014，35（20）：383-387.

[11]劉 咪，張偉松，何財安，等.葡萄皮花色苷對幾種常見食源性致病菌的抑制作用[J].中國食品學報，2014，14（11）：70-75.

[12]高錦洪，陳智慧，冀 琳，等.植物源提取物對金黃色葡萄球菌的抗菌作用[J].中國釀造，2014，33（2）：13-16.

[13]馬春景，趙麗華，楊 帆，等.三種百合科蔥屬植物對五種食源性致病菌抑菌效果的比較[J].食品工業(yè)科技，2014，35（11）：52-56.

[14]聶相珍，申麗媛.葡萄皮渣多酚提取及其對五種食源性致病菌的抑制作用[J].中國釀造，2016，35（9）：101-105.

[15]周文杰，楊 建，張瑞娟，等.Bacillus amyloliquefaciensC-1胞外發(fā)酵產(chǎn)物對食源性致病菌抑菌活性的初步研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26（1）：123-127.

[16]孫 卉，師俊玲.枯草芽孢桿菌CCTCC M207209對食源性病原菌的抑制作用[J].中國釀造，2009，28（6）：35-37.

[17]REIS J A,PAULA A T,CASAROTTI S N,et al.Lactic acid bacteria antimicrobial compounds:characteristics and applications[J].Food Eng Rev,2012,4(2):124-140.

[18]BARBOSA A A T,MANTOVANI H C,JAIN S.Bacteriocins from lactic acid bacteria and their potential in the preservation of fruit products[J].Crit Rev Biotechnol,2017,37(7):852-864.

[19]ABO-AMER A E.Inhibition of foodborne pathogens by a bacteriocinlike substance produced by a novel strain ofLactobacillus acidophilus isolated from camel milk[J].Appl Biochem Microbiol,2013,49(3):270-279.

[20]MALHEIROS P S,CUCCOVIA I M,FRANCO B D G M.Inhibition of Listeria monocytogenes in vitroand in goat milk by liposomal nanovesiclescontainingbacteriocins produced byLactobacillus sakeisubsp.sakei 2a[J].Food Control,2016,63(5):158-164.

[21]XU S J,BAI Z H,JIN B,et al.Bioconversion of wastewater from sweet potato starch production toPaenibacillus polymyxabiofertilizer for tea plants[J].Sci Rep,2014,4(4131):1-7.

[22]LIN L I,ZHANG Q M,YANG J H.Treatment of wastewater of sweet potato starch with combined microbial flocculation[J].Environ Sci Technol,2006,29(7):75-76.

[23]張莉力，許云賀，李新華.對甘薯淀粉具有絮凝活性的乳酸菌的分離鑒定及其特性[J].食品科學，2010，31（7）：228-231.

[24]YEN H W,CHEN T J,PAN W C,et al.Effects of neutralizing agents on lactic acid production byRhizopus oryzaeusing sweet potato starch[J].World J Microbiol Biotechnol,2010,26(3):437-441.

[25]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001：289-294.

[26]Lü X,HU P,DANG Y,et al.Purification and partial characterization of a novel bacteriocin produced byLactobacillus caseiTN-2 isolated from fermented camel milk(Shubat)of Xinjiang Uygur Autonomous Region,China[J].Food Control,2014,43(9):276-283.

Screening of lactic acid bacteria from sweet potato starch processing wastewater and its antibacterial activity against food-borne pathogenic bacteria

ZHANG Keke1,3,WANG Yaqi1,ZHANG Li2,LIU Jiyu1,WANG Lun1,ZENG Xiaoyu1,YU Shaomeng1,ZHANG Guangle2,XI Yu1*
(1.School of Life Sciences,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China;2.College of Biological Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China;3.Research Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Techniques,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

Three strains of lactic acid bacteria SPDJ3,SPEJ7 and SPEJ9 were isolated from the collected sweet potato starch wastewater.Based on the cultural,morphological,physiological and biochemical characteristics and phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence,strains SPDJ3 and SPEJ7 were identified asLactobacillus plantarum,strain SPEJ9 was identified asLactobacillus paracasei.The fermentation supernatant liquid of the 3 strains showed antibacterial effect on 8 tested strains of food-borne pathogenic bacteria,strain SPDJ3 had strong antibacterial effect onShigella flexneri,the diameter of the inhibition zone was(30.37±0.15)mm.However,the bacteriostatic effects of strain SPEJ7 and SPEJ9 onBacillus cereuswere stronger,and the diameters of the inhibition zones were(29.43±0.21)mm and(28.27±0.25)mm,respectively.

lactic acid bacteria;food-borne pathogens;screening;16S rDNA sequence analysis;antibacterial activity

Q815

0254-5071（2017）10-0032-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.008

2017-06-17

國家自然科學基金項目（31401918）；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃資助項目（201710459068）

張可可（1988-），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物學。

*通訊作者：席 宇（1976-），男，講師，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵與優(yōu)化。