美拉德反應對魚糜漂洗液回收蛋白酶解物結構的影響

王漢玲，陳麗麗，杜雨芊，丁小強，趙利*，袁美蘭，白春清

(1.江西科技師范大學 生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發(fā)分中心(南昌)，南昌 330013；2.南昌市食品化妝品監(jiān)督所，南昌 330038)

美拉德反應對魚糜漂洗液回收蛋白酶解物結構的影響

王漢玲1，陳麗麗1，杜雨芊2，丁小強1，趙利1*，袁美蘭1，白春清1

(1.江西科技師范大學 生命科學學院，國家淡水魚加工技術研發(fā)分中心(南昌)，南昌 330013；2.南昌市食品化妝品監(jiān)督所，南昌 330038)

文章以魚糜漂洗液回收蛋白酶解物為原料，與葡萄糖反應制備美拉德反應產(chǎn)物，并采用紅外光譜、熒光光譜、氣質聯(lián)用以及掃描電鏡等分析技術對酶解物及美拉德反應產(chǎn)物的結構和風味成分進行了分析。研究結果發(fā)現(xiàn)：酶解物美拉德反應產(chǎn)物在激發(fā)波長347 nm、發(fā)射波長425 nm處有最大熒光強度；同時，紅外光譜分析結果顯示：酶解物美拉德反應產(chǎn)物在3700～3200 cm-1處吸收峰變寬，其結果符合美拉德反應產(chǎn)物的光譜特征，說明酶解物與葡萄糖之間發(fā)生了美拉德反應。掃描電鏡分析中也顯示酶解物美拉德反應前后表面結構有明顯不同，這些都表明美拉德反應對蛋白酶解物有一定的影響。

美拉德反應；魚蛋白酶解物；紅外；電子鼻；氣質聯(lián)用

美拉德反應又稱糖基化反應，是一種非酶褐變，其本質是指羰基與氨基經(jīng)縮合、聚合等一系列復雜的反應。此反應最早是由法國化學家Louis-Camille Maillard發(fā)現(xiàn)，后來美國化學家Hodge把這個反應正式命名為“美拉德反應”，并將其反應歷程進行了歸納[1-3]。美拉德反應根據(jù)反應物及反應條件的不同，反應產(chǎn)物也有所不同，但其過程大致可分為3個階段，即反應初期、反應中期、反應末期，并且每個反應階段又包含若干反應，特別是在美拉德反應末期，反應原理極其復雜。目前，人們對美拉德反應產(chǎn)物中小分子化合物生成機理比較清楚，但對于美拉德反應中生成大分子聚合物的機理仍知之甚少。

對于美拉德反應原理及其產(chǎn)物的研究，人們常采用高效液相色譜、氣質聯(lián)用、核磁共振、光譜吸收、電子鼻等技術對蛋白類物質美拉德反應前后進行分析。本文以回收蛋白酶解物為研究對象，對其美拉德反應前后的光譜吸收、掃描電鏡、揮發(fā)性成分進行分析，初步探討美拉德反應對回收蛋白酶解物結構的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Quanta 250掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；Spectrum Two傅立葉變換紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司；電子鼻 法國Alpha M.O.S公司；BSA224S-CW型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；7890A氣相色譜-5975C質譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 傅立葉-紅外光譜測定

采用KBr壓片法[4]。取適量干燥后的樣品，然后加入一定量的KBr，用瑪瑙研缽將其研成均勻粉末，將其壓制成薄片。將樣品薄片放入紅外光譜(FT-IR)儀中進行全波段掃描(4000～400 cm-1)，掃描次數(shù)為32次，同時用純的KBr作為背景。

1.2.2 熒光光譜測定

根據(jù)Morales[5]的方法并稍作修改，將待測樣品用pH值為8.5，0.2 mo1/L的硼酸鹽緩沖液配成濃度為1 mg/mL的樣品溶液，用熒光分光光度儀在340 nm激發(fā)波長下(狹縫5 nm)進行發(fā)射波長掃描。

1.2.3 掃描電鏡測定

取適量凍干樣品均勻粘在雙面膠的一面，然后把雙面膠附在樣品柱上，用離子濺射鍍膜儀在表面噴金。將處理好的樣品置于樣品盒中，在15 kV加速電壓、低真空條件下用掃描電子顯微鏡觀察微觀結構[6]。

1.2.4 電子鼻測定

電子鼻傳感器由6個高靈敏金屬氧化物傳感元件組成，其分別對不同揮發(fā)性物質靈敏。電子鼻工作原理：傳感器與樣品中的揮發(fā)性物質接觸時會發(fā)生氧化還原反應，使傳感元件的導電性發(fā)生變化而呈現(xiàn)不同的感應信號，從而對不同的揮發(fā)性物質進行區(qū)分[7]。

表1 化學傳感器及其對應的敏感物質類型Table 1 Chemical sensors and their corresponding sensitive substances

本實驗以干燥空氣為載氣，流速為150 mL/min。準確量取5 g樣品，40 ℃密封加熱15 min，采用頂空抽樣的方式檢測，檢測時間為60 s，傳感器清洗時間為150 s，每類樣品重復6次。

1.2.5 揮發(fā)性成分的測定

固相微萃取條件：將3 g干燥好的樣品置于15 mL封閉式固相微萃取頂空瓶中，50 ℃水浴5 min，用預先活化好的85 μm聚丙烯酸酯(polyacrylate，PA)萃取頭插入頂空瓶中吸附20 min；萃取后，迅速將萃取頭插入氣相色譜儀進樣口處，于250 ℃解吸附5 min。

氣相色譜條件：色譜毛細管柱為DB-5MS柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；起始溫度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速度升至150 ℃，然后以20 ℃/min的速度升至300 ℃，保持4 min。進樣口溫度250 ℃，無分流進樣；載氣為高純氦氣，柱前壓為50 kPa。

質譜條件：電離方式為EI，離子源溫度為230 ℃，電子能量為70 eV；溶劑延遲2 min，2.5 min后采集信號；掃描質量范圍為35～450 m/z。

數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)經(jīng)計算機與Nist譜庫和Wiley譜庫比對后，再結合有關文獻進行人工譜圖解析，各化合物的峰面積按歸一化法進行定量分析。

2 結果與討論

2.1熒光光譜分析

圖1 酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物熒光光譜分析Fig.1 Fluorescence spectrometric analysis of enzymatic hydrolysates and their Maillard reaction products

在激發(fā)波長為 340～370 nm，發(fā)射波長為 420～440 nm時，美拉德反應產(chǎn)物具有典型的熒光光譜特征[8]?；厥盏鞍酌附馕锛懊览路磻a(chǎn)物的熒光光譜見圖1，美拉德反應產(chǎn)物在發(fā)射波長為420 nm處熒光強度最大，符合美拉德反應產(chǎn)物的熒光光譜特征，且明顯高于酶解產(chǎn)物。這是由于在美拉德反應初級階段，生成的初級產(chǎn)物與相鄰的蛋白質或肽發(fā)生交聯(lián)反應，生成具有熒光特性的化合物[9]。

2.2 電子鼻分析

2.2.1 原始檢測數(shù)據(jù)分析

6個傳感器對酶解物和美拉德反應產(chǎn)物的雷達圖見圖2。

圖2 酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物的雷達圖Fig.2 Radar charts of enzymatic hydrolysates and their Maillard reaction products

電子鼻技術是目前發(fā)展較為成熟的技術，它不僅能識別氣體的不同成分，而且還可以對氣體的整體成分進行綜合分析，因此電子鼻技術在識別復雜氣體成分，比較不同樣品氣味組成成分及氣味濃度方面具有明顯的優(yōu)勢[10]。

由圖2可知，兩者的雷達圖相差較大，且美拉德反應產(chǎn)物的傳感器響應信號較強。說明酶解物與還原糖反應后，揮發(fā)性物質成分有所改變，而且揮發(fā)性物質的濃度有所增大。

2.2.2 主成分分析

圖3 酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物的PCA分析Fig.3 Principal component analysis of enzymatic hydrolysates and their Maillard reaction products

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)是將傳感器獲取的感應信號進行數(shù)據(jù)轉換和降維，并對降維后的特征向量進行線性分類[11]。由圖3可知，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的方差貢獻率分別為99.57%，0.41%，累計方差貢獻率為99.98%，這說明2個主成分包含了揮發(fā)性物質的大部分信息，較好地反映了酶解物及美拉德反應產(chǎn)物中揮發(fā)性物質的信息。酶解物樣品聚集于PCA圖中的右半?yún)^(qū)，而美拉德反應產(chǎn)物樣品聚集于PCA圖的左半?yún)^(qū)域，兩者沒有重疊，表明酶解物與酶解物美拉德反應產(chǎn)物的揮發(fā)性物質差異明顯。

2.2.3 判別函數(shù)分析

利用判別函數(shù)分析(Discrimination Function Analysis，DFA)對酶解物及美拉德反應產(chǎn)物的數(shù)據(jù)進行線性變換并建立判別模型[12]，見圖4。

圖4 酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物的判別函數(shù)分析Fig.4 Discrimination function analysis of enzymatic hydrolysates and their Maillard reaction products

橫坐標、縱坐標分別對應于第1，2線性判別函數(shù)，且第1線性判別函數(shù)的累積判別效率為 88.72%，而且兩者沒有重疊，這說明利用第1線性判別函數(shù)能夠很好地區(qū)分酶解物與美拉德反應產(chǎn)物的揮發(fā)性物質。

2.3掃描電鏡分析

圖5 酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物的掃描電鏡圖(×6000倍) Fig.5 Scanning electron microscopy images of enzymatic hydrolysates and their Maillard reaction products(×6000 times)

注：A，B分別為酶解物、酶解物美拉德反應產(chǎn)物。

蛋白質的表面結構影響著蛋白質的功能性質，其變化對蛋白質功能性質的改變起著重要的作用[13]。本實驗利用掃描電鏡(Scanning Electron Microscopy，SEM)對冷凍干燥后的酶解物及美拉德反應產(chǎn)物進行了觀察。由圖5可知，酶解物有明顯的片狀結構，而美拉德反應產(chǎn)物呈現(xiàn)出較為明顯的顆粒狀態(tài)，這說明酶解物經(jīng)美拉德反應后，表面結構發(fā)生了一定的改變。

2.4傅立葉-紅外光譜分析

回收蛋白酶解物與葡萄糖美拉德反應前后的紅外光譜圖見圖6。

圖6 酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物的紅外光譜圖Fig.6 FT-IR of enzymatic hydrolysates and their Maillard reaction products

2.5 揮發(fā)性成分分析

采用氣質聯(lián)用對回收蛋白酶解物及美拉德反應產(chǎn)物的揮發(fā)性物質進行測定，結果見表2。

表2 酶解物及其美拉德反應產(chǎn)物中揮發(fā)性物質組成及相對含量Table 2 Volatile components composition and the relative content of enzymatic hydrolysates and their Maillard reaction products

續(xù) 表

續(xù) 表

酶解物及美拉德反應產(chǎn)物中共檢測出80種揮發(fā)性成分，主要包括吡嗪類、烷烴類、酮類、醛類等化合物。酶解物的揮發(fā)性成分中，主要以烷烴類、酮類、醛類為主，分別占到45.93%，22.9%，18.57%。酶解物美拉德反應產(chǎn)物的揮發(fā)性成分中，主要以吡嗪類、醇類、烷烴類為主，分別占到59.28%，11.41%，8.93%，這說明吡嗪類化合物是酶解物美拉德反應產(chǎn)物中主要的揮發(fā)性物質，這與盧傳靜等將鰱魚多肽與還原糖發(fā)生美拉德反應進行SPME-GC-MS檢測分析的結果相似。

3 結論

熒光光譜分析表明：美拉德反應產(chǎn)物在激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長420 nm處有最大熒光強度，符合美拉德反應產(chǎn)物的熒光特征。掃描電鏡分析表明：酶解物經(jīng)美拉德反應后，表面結構發(fā)生了一定的變化。

傅立葉-紅外光譜分析表明：美拉德反應產(chǎn)物在1110～1050 cm-1處的C—N鍵的變形振動及3500～3000 cm-1處的N—H鍵的變形振動出現(xiàn)較強吸收峰，表明酶解物-葡萄糖之間發(fā)生美拉德反應。

酶解物及美拉德反應產(chǎn)物中共檢測出80種揮發(fā)性成分，主要包括吡嗪類、烷烴類、酮類、醛類等化合物。酶解物的揮發(fā)性成分中，主要以烷烴類、酮類、醛類為主；酶解物美拉德反應產(chǎn)物的揮發(fā)性成分中，主要以吡嗪類、醇類、烷烴類為主。

[1]Hodge J E.Dehydrated foods，chemistry of browning reactions in model systems[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1953,1:928-943.

[2]Hanmoungjai P, Pyle D L, Niranjan K.Enzymatic process for extracting oil and protein from rice bran[J].Journal of the American Oil Chemists' Society,2001,78(8):817-821.

[3]Hourigan J A, Chesterman C F. Application of carbohydrases in extracting protein from rice bran[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,1997,74(2):141-146.

[4]Jing H, Kitts D D. Chemical and biochemical properties of casein-sugar Maillard reaction products[J].Food and Chemical Toxicology,2002,40(7):1007-1015.

[5]Marcone M F,Kakuda Y,Yada R Y.Salt-soluble seed globulins of dicotyledonous and monocotyledonous plants II. Structural characterization[J].Food Chemistry,1998,63(2):265-274.

[6]Humblet-Hua K N P, Scheltens G, Van Der Linden E,et al. Encapsulation systems based on ovalbumin fibrils and high methoxyl pectin[J].Food Hydrocolloids,2011,25(4):569-576.

[7]聶雪梅，劉仲明，張水華，等.電子鼻及其在食品領域的應用[J].傳感器技術，2004，23(10)：1-3.

[8]Obayashi H, Nakano K, Shigeta H, et al. Formation of crossline as a fluorescent advanced glycation end productin vitroandin vivo[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,1996,226(1):37-41.

[9]Contreras-Calderón J, Guerra-Hernández E, García-Villanova B. Utility of some indicators related to the Maillard browning reaction during processing of infant formulas[J].Food Chemistry,2009,114(4):1265-1270.

[10]Gardner J W, Bartlett P N. A brief history of electronic noses[J].Sensors and Actuators B:Chemical,1994,18(1-3):210-211.

[11]宋偉，劉璐，支永海，等.電子鼻判別不同儲藏條件下糙米品質的研究[J].食品科學，2010，31(24)：360-365.

[12]谷風林.酪蛋白美拉德產(chǎn)物的制備、性質及在煙草中的應用研究[D].無錫：江南大學，2010.

[13]穆利霞.大豆蛋白-糖接枝改性及其結構與功能特性研究[D].廣州：華南理工大學，2010.

[14]盧傳靜.美拉德反應修飾的鰱魚肽理化性質及其在酥性餅干中的應用[D].青島：中國海洋大學，2014.

[15]薛瑾.茶多酚-蛋白納米復合物的研究[D].無錫：江南大學，2014.

[16]孫常雁.乳清蛋白肽美拉德反應產(chǎn)物的制備及其抗氧化作用機理研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學，2014.

聲明

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EffectofMaillardReactiononStructureofProteinHydrolysatesfromSurimiWashLiquid

WANG Han-ling1, CHEN Li-li1, DU Yu-qian2, DING Xiao-qiang1, ZHAO Li1*,YUAN Mei-lan1, BAI Chun-qing1

(1.College of Life Science，Jiangxi Science and Technology Normal University，National Freshwater Fish Processing Technology Research and Development Branch Center(Nanchang)，Nanchang 330013,China；2.Nanchang Food and Cosmetics Supervision Institute,Nanchang 330038,China)

In this paper,take protein hydrolysates from Surimi wash liquid as raw materials and with glucose to prepare Maillard reaction product. The reaction product is analyzed by infrared spectroscopy, fluorescence spectroscopy, GC/MS and scanning electron microscopy. The structure and flavor components of the product are analyzed. The results show that the product has the maximum fluorescence intensity at the excitation wavelength of 347 nm and the emission wavelength of 425 nm.Meanwhile, the results of infrared spectroscopy show that the absorption peak of the product is in the range of 3700～3200 cm-1.The results are in agreement with the spectral characteristics of the Maillard reaction product, which indicates that the Maillard reaction occurs between hydrolysate and glucose. Scanning electron microscopy also shows that the surface structure of the amphipathic Maillard reaction is significantly different, which indicates that the Maillard reaction has a certain effect on the protein hydrolyzates.

Maillard reaction；fish protein hydrolysates；infrared；electronic nose；gas chromatography-mass spectrometry

TS201.21

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.013

1000-9973(2017)11-0063-06