觀察參麥對膿毒癥患者外周血淋巴細胞抗凋亡因子Bcl—2及促凋亡因子caspase—3的影響

陳偉　謝敏　李燚　吳瑩輝　鄭承鐸　高藝萍　林淑萍　莊菁

【摘要】 目的：探討研究參麥注射液治療膿毒血癥患者的臨床效果。方法：選擇2015年12月-2016年12月于筆者所在醫(yī)院接受治療的80例膿毒血癥患者作為研究對象，采用隨機數(shù)字抽取表法將80例患者分為對照組（40例）和試驗組（40例），其中對于對照組患者依據(jù)膿毒癥指南給予標準治療，試驗組患者在對照組治療基礎上選用參麥注射治療，對兩組患者的外周血淋巴細胞中抗凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子caspase-3含量及5、28 d全因死亡率等進行比較。結果：經(jīng)過治療后，雖然試驗組患者Bcl-2表達水平高于對照組組，且caspase-3含量低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。試驗組患者5 d全因死亡率為10.0%，28 d全因死亡率為25.0%，對照組患者5 d全因死亡率為12.5%，28 d全因死亡率為25.0%，數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論：暫未發(fā)現(xiàn)參麥注射液可以有效影響B(tài)cl-2、caspase-3及5、28 d全因死亡率，且對臨床癥狀的改善效果不明顯。

【關鍵詞】 膿毒癥； 凋亡； 系統(tǒng)性炎癥反應綜合征； 補償性抗炎癥反應綜合征； 參麥

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.20.077 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2017）20-0149-05

膿毒癥死亡率約30%，嚴重膿毒癥死亡率高達50%，膿毒性休克死亡率約80%[1]，發(fā)展中國家每年有0.2‰～0.3‰人罹患膿毒癥，美國每年約100萬人感染膿毒癥[1-2]。已有臨床及實驗室證據(jù)證明升高抗凋亡相關因子，如Bcl-2及降低促凋亡因子caspase-3可提高膿毒癥試驗動物的生存率，而參麥有效成分可升高Bcl-2及降低caspase-3，故本課題以膿毒癥患者為研究對象，分別設立膿毒血癥參麥干預組、膿毒血癥對照組，用酶聯(lián)免疫法檢測不同時間段各組患者外周血淋巴細胞中抗凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子caspase-3含量，通過以上不同的方法在時間和空間上探膿毒血癥白細胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和演變過程，以及使用參麥調控后的變化現(xiàn)象，了解凋亡現(xiàn)象在膿毒血癥發(fā)病過程中所起的作用及其與白細胞凋亡的關系，應用其規(guī)律及時給予干預促使凋亡得到緩解。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機在筆者所在醫(yī)院接受治療的膿毒血癥患者作為研究對象，共80例，且所有患者均于2015年12月-2016年12月入院治療，所有患者均滿足文獻[3]2001年美國胸科醫(yī)師協(xié)會/危重病醫(yī)學會（ACCP/SCCM）診斷標準。采用隨機數(shù)字抽取表法將患者分為對照組與觀察組，每組40例患者，其中對照組男24例，女16例，年齡最小61例，最大78歲，平均（69.15±5.62）歲；觀察組男25例，女15例，年齡最小61例，最大79歲，平均（69.23±5.44）歲。兩組患者的基本資料，包含性別、年齡、急性生理學與慢性健康狀況評分等在內的指標比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），可以進行對比研究。所有患者皆排除藥物禁忌證，且無家族性遺傳精神病史，均自愿簽署本次試驗知情同意書并或院內倫理委員會論證批準。

1.2 納入標準

（1）年齡：60～80歲的成年患者；（2）急性生理學與慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ（APACHEⅡ）≥10分，且≤20分；（3）MODS評分≤5分；（4）起病后未應用除參麥外的免疫增強藥物。

1.3 排除標準

（1）對參麥過敏；（2）治療未超過24 h死亡或出院者；（3）合并非感染性炎癥性疾?。齻?、創(chuàng)傷、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬關節(jié)病、哮喘、炎癥性腸病等）；（4）病毒血癥；（5）真菌血癥；（6）寄生蟲血癥；（7）腫瘤患者；（8）合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括腦血管意外及神經(jīng)炎癥等；（9）重度營養(yǎng)不良；（10）因病情需要行腹膜透析或連續(xù)性血液凈化治療等。

1.4 剔除標準

（1）病歷資料嚴重不完整，影響統(tǒng)計分析結果；（2）未能按試驗方案規(guī)定實施的病例；（3）出現(xiàn)頭痛、不安、皮膚不適、流涎、嘔吐并發(fā)癥等或對參麥過敏甚至發(fā)生過敏性休克嚴重不良事件及其他原因致使繼續(xù)試驗困難。

1.5 治療方法

所有患者入院后均及時均予生命征監(jiān)護，必要時行機械通氣，血流動力學監(jiān)測，對患者每小時尿量做好記錄，并行血常規(guī)、生化、血氣分析、肝腎功能、累計臟器數(shù)目等檢查；置入深靜脈導管以監(jiān)測ScvO2和/或CVP；將實驗室檢查結果、基礎疾病、年齡等信息輸入電腦，應用軟件進行APACHEⅡ評分、MODS評分。兩組患者均給予常規(guī)治療，如液體復蘇、抗感染、臟器支持、營養(yǎng)支持等治療。常規(guī)治療后，給予對照組采用膿毒癥指南實施標準治療，隨后在診斷膿毒癥第1、3、7、10天抽取新鮮外周血10 ml。隨后應用ELISA檢測Bcl-2和caspase-3。試驗組在對照組治療基礎上選用參麥注射液40 ml加入250 ml 0.9%氯化鈉注射液中進行治療，控制60 ml/h速度靜脈滴注，滴注過程中監(jiān)測生命體征，試驗組患者于診斷膿毒癥當天以及使用參麥干預后（藥敏試驗陰性）第1、3、7、10天抽取新鮮外周血10 ml。應用ELISA檢測Bcl-2和caspase-3。

1.6 觀察指標

對兩組患者的外周血淋巴細胞中抗凋亡因子Bcl-2、促凋亡因子caspase-3含量及5、28 d全因死亡率等進行比較。

1.7 統(tǒng)計學處理

對于本次治療期間所記錄的數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者Bcl-2、caspase-3含量比較endprint

通過分析表1可知，經(jīng)過治療后，試驗組患者Bcl-2表達水平高于對照組患者Bcl-2表達水平，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。試驗組患者caspase-3陽性細胞個數(shù)低于對照組患者caspase-3陽性細胞個數(shù)，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 兩組患者5、28 d全因死亡率比較

試驗組患者5 d死亡例數(shù)為4例，全因死亡率為10.0%，28 d死亡例數(shù)為10例，全因死亡率為25.0%；對照組患者5 d死亡例數(shù)為5例，全因死亡率為12.5%，28 d死亡例數(shù)為10例，全因死亡率為25.0%。兩組患者5、28 d全因死亡率數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 討論

3.1 有證據(jù)顯示，參麥可能改變膿毒癥患者的caspase-3和Bcl-2水平，并有可能提高膿毒癥患者生存率

3.1.1 膿毒癥病理生理機制分為兩個階段-“前炎癥階段”及“免疫抑制階段” 1991年，北美國家一致同意將膿毒癥定義為已知感染灶的針對損傷或感染的宿主免疫反應（系統(tǒng)性炎癥反應綜合征，SIRS）[3]，即膿毒癥是宿主對源于腹部、皮膚、肺和/或泌尿系感染的免疫反應綜合征。其機制包括兩個階段：（1）前炎癥階段，指體內免疫系統(tǒng)釋放炎癥因子抗擊感染。（2）免疫抑制階段，即CARS（補償性抗炎癥反應綜合征）緊隨SIR之后[4]。

3.1.2 針對膿毒癥第一階段-“前炎癥階段”的治療，臨床試驗證明效果欠佳，目前研究集中在針對第二階段-“免疫抑制”階段的治療 學界一度認為這兩個階段發(fā)生在不同時間，故起初大部分試驗主要針對前炎癥階段，其根據(jù)是大量前炎癥階段釋放的炎癥介質會導致器官損傷。目前多數(shù)針對感染的抗生素的應用常?？梢允够颊叨冗^疾病的急性期，但發(fā)病數(shù)天甚至數(shù)周后的死亡率逐漸引起醫(yī)療界重視。

近年來，許多降低炎癥反應的治療措施如抗內毒素，抗TNF-α、抗IL-1beta和抗TLR-4等得到廣泛研究，但均無法在臨床起效[5-7]，進一步研究顯示膿毒癥的兩個病理生理階段常常同時存在，此外，盡管膿毒癥的前炎癥階段與早期死亡率相關，但其晚期死亡率常與膿毒癥的第二階段免疫抑制階段呈相關性[8]，而且超過70%的患者死亡發(fā)生在起病3 d后[9]。

免疫抑制在老年患者中比較普遍，因為高齡患者免疫系統(tǒng)更加薄弱，導致抗感染能力減弱[10-11]。免疫抑制的主要表現(xiàn)是淋巴細胞丟失，免疫抑制會導致低毒微生物或條件致病菌感染，如窄食單胞、假單胞、不動桿菌、腸桿菌或病毒感染，如巨細胞病毒、單純皰疹病毒[12-14]。

3.1.3 在免疫抑制階段抗擊凋亡的治療措施（升高Bcl-2及降低caspase-3）可使膿毒癥動物模型得到緩解 多項動物實驗及人類試驗觀察到膿毒癥中存在淋巴細胞、樹突細胞、胃腸上皮細胞、胸腺細胞丟失，這些免疫細胞的丟失主要是細胞程序性壞死，即外源性死亡受體及內源性的線粒體介導的細胞凋亡[15-19]，免疫抑制狀態(tài)是由免疫效應細胞發(fā)生凋亡介導的[20]，當促及抑制凋亡的信號及分子，如Fas、FasL、B cell lymphoma-2（Bcl-2）、Bid 和caspase-3等受到限制或促進時，膿毒癥的動物模型試驗顯示膿毒癥得到緩解[21-25]，多項研究提示淋巴細胞丟失可能只是膿毒癥免疫抑制的部分機制[26-27]，而且，隨著對膿毒癥淋巴細胞丟失的研究的加深，筆者了解到單純針對某一個炎癥因子或介質的治療可能不足以改善膿毒癥患者的預后或降低死亡率，故本試驗采用參麥這種混合中藥方劑，探討其多方位控制免疫細胞凋亡現(xiàn)象后對膿毒癥預后的影響。

3.1.4 凋亡與凋亡調節(jié)因子BCL-2、Bax、caspase-3 （1）凋亡：細胞凋亡，為一種細胞程序性死亡。相對于細胞壞死（necrosis），細胞凋亡是細胞主動實施的。細胞凋亡一般由生理或病理性因素引起。而細胞壞死則主要為缺氧造成，兩者可以很容易通過觀察區(qū)分開來。在細胞凋亡過程中，細胞縮小，DNA被核酸內切酶降解成180～200 bp片段屬于有層次之斷裂（可以通過凝膠電泳證明），而細胞壞死時，細胞腫脹，細胞膜被破壞，通透性改變。細胞器散落到細胞間質，需要巨噬細胞去清除，結果是該局部組織發(fā)炎。相比起細胞壞死，細胞凋亡是更常見的細胞死亡形式[28]。（2）Bcl-2、Bax：Bcl-2基因（即B細胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一種原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，并且近年來的一些研究已開始揭示這一作用的機制[29]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Bcl-2蛋白家族按功能可分為兩類，一類是像Bcl-2一樣具有抑制凋亡作用，如哺乳動物的Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、A1、線蟲Ced-9、牛痘病毒E1B119kD等，而另一類具有促進凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bax、Bak、Bik/Nbk、Bid和Harakiri。最初在血液淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)Bcl-2能抑制細胞死亡，隨后陸續(xù)在其他一些細胞中也發(fā)現(xiàn)Bcl-2的這種作用。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，除這些之外尚存在Bcl-2不敏感的凋亡途徑[30]。

Bcl-2是第一個被確認有抑制凋亡作用的基因[31]，Bc1-2抑制氧自由基的產(chǎn)生或起到抗氧化劑的作用而阻斷細胞凋亡[32]。Bcl-2是一種直接調節(jié)細胞凋亡的線粒體膜蛋白，其C末端含有1個由l9個氨基酸組成的疏水跨膜區(qū)，作為信號錨定序列，負責定位和插入到線粒體外膜，抑制細胞凋亡，其表達可對抗細胞內外的氧自由基對細胞的毒害與損傷作用，其在細胞內表達增強可以抑制或防止多種因素或因子誘發(fā)的細胞凋亡，延長細胞的壽命，是許多生理或病理凋亡的關鍵性調節(jié)因子。

Bax是最早發(fā)現(xiàn)的促凋亡因子，其中21%的氮基酸與Bcl-2同源。Bax分子結構中含有類似于抗凋亡成員的疏水C端，然而亞細胞分級和免疫組織化學實驗均表明Bax在正常細胞中主要定位于細胞漿。雖然在線粒體上也發(fā)現(xiàn)有部分Bax存在，但Bax分子并非插入線粒體外膜內而是附著于線粒體表面[33]。endprint

Bcl-2家族成員復雜的相互作用通過控制線粒體外膜的透化作用（MOMP）而實現(xiàn)的。Bax在組織器官中的表達比Bcl-2更加廣泛，主要分布在線粒體外膜上。正常情況Bax位于胞質，在凋亡信號誘導下，胞質內的Bax接到死亡信息使其構象發(fā)生改變，由胞質移位并插入到線粒體膜中，并在此形成微孔結構的低聚物Bax-Bax同源二聚體，然后激動MOMP[34]，開啟線粒體通透性轉換孔引起線粒體跨膜電位下降，釋放凋亡前因子包括細胞色素C、omi/htra2、Smac/DIABLO和核酸內切酶G，釋放的細胞色素C與凋亡蛋白活化因子（apoptosis proteinase activating factor-1，Apaf-1）、dATP及caspase-9前體結合形成凋亡小體而發(fā)生凋亡[35]。Bcl-2存在于線粒體外膜，其表達可競爭性地與Bax蛋白結合，形成比Bax/Bax同源二聚體更穩(wěn)定的Bax/Bcl-2異源二聚體，從而“中和”Bax/Bax誘導凋亡的作用，終止細胞凋亡的發(fā)生。決定細胞命運的關鍵因素是抑制與促進二者間的比率，Bc1-2、Bax分別是凋亡抑制和促進因子，其比值與細胞凋亡的發(fā)生直接相關，如二者表達量平衡則細胞生存期正常；當Bcl-2表達量較高時，形成異源二聚體Bcl-2/Bax，抑制細胞凋亡；當Bax表達量較高時，形成同源二聚體Bax/Bax，通過抑制Bcl-2的抗凋亡作用而促進細胞凋亡的發(fā)生[36]。因此有學者將Bc1-2和Bax的比值稱作“凋亡開關”[37]。（3）caspase-3：caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降[38]。

3.1.5 參麥主要有效成分（Rb1，Rg）可升高Bcl-2及降低caspase-3 本試驗采用正大青春寶藥業(yè)有限公司提供的無溶媒半成品參麥注射液，每毫升試劑含50 mg生藥（25 mg人參和25 mg麥冬，內容含人參皂苷Rg1，3274 μg；人參皂苷Re，2326 μg；人參皂苷 Rf，823 μg；人參皂苷Rc，1331 μg；人參皂苷Rd，782 μg；人參皂苷Rb1，3302 μg；人參皂苷Rb2，1312 μg；人參皂苷 Ro，2603 μg；麥冬皂苷D，10.3 μg）。

Jiang[39]發(fā)現(xiàn)人參可通過降低caspase-3和9的表達減輕皮質酮在PC12細胞誘發(fā)的凋亡。Zhao[40]發(fā)現(xiàn)人參的主要有效成分人參皂苷Rg1可減輕capase依賴的肝細胞凋亡。Bing[41]通過大鼠試驗證實人參中的酸性多糖可以有效降低capase-3的表達。紅參提取物可通過抑制Fas表達降低胚細胞凋亡[42]。2015年Huang[43]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1抑制脊髓缺血再灌注損傷所致的神經(jīng)細胞凋亡。2014年Liu[44]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1可抑制Beta淀粉蛋白誘發(fā)的神經(jīng)細胞凋亡。同年，Yan[45]等發(fā)現(xiàn)人參皂苷 Rb1可通過上調Bcl-2/Bax ratio和抑制caspase-3和9減少缺血誘發(fā)的心肌細胞凋亡。2014年，Park[46]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3通過激活caspase3、8、9誘發(fā)細胞凋亡。2013年Tian[47]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1可通過上調Bcl-xl及下調caspase3達到保護鼠前庭及聽神經(jīng)的目的。2012年，Chen[48]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1通過降低caspase-3基因的表達抗凋亡，而人參皂苷Rg1通過降低Fas基因表達減少凋亡。2005年Xu[49]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Re可通過上調Bcl-2，抑制caspase-3來抵抗MPTP誘發(fā)的帕金森鼠黑質神經(jīng)細胞凋亡。2002年，Liu等[50]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Re可通過上調Bcl-2/Bax抑制心肌細胞凋亡。

3.2 本試驗暫未發(fā)現(xiàn)參麥可影響膿毒癥患者外周淋巴細胞caspase-3及Bcl-2水平，暫未發(fā)現(xiàn)參麥可影響膿毒癥患者生存率

本次研究采用酶聯(lián)免疫法檢測不同時間段各組工作外周血淋巴細胞中抗凋亡因子Bcl-2及促凋亡因子caspase-3含量，用于探討參麥注射液對治療膿毒血癥患者的治療效果的指標。研究結果顯示，經(jīng)過治療后，試驗組患者Bcl-2表達水平高于對照組患者Bcl-2表達水平，比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。試驗組患者caspase-3含量低于對照組患者caspase-3含量，比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明雖然采用膿毒癥標準治療和增加參麥注射治療對Bcl-2表達水平、caspase-3含量等影響比較差異不明顯，但采用增加參麥注射治療的效果更好一點。此外試驗組患者5 d死亡例數(shù)為4例，全因死亡率為10.0%，28 d死亡例數(shù)為10例，全因死亡率為25.0%；對照組患者5 d死亡例數(shù)為5例，全因死亡率為12.5%，28 d死亡例數(shù)為10例，全因死亡率為25%.兩組患者5、28 d全因死亡率數(shù)據(jù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。分析原因如下：第一，有證據(jù)顯示參麥有效成分可以通過提高Bcl-2及降低caspase-3抑制凋亡[42-43，48，51]。但本試驗結果與上述結論不符，考慮原因為：（1）目前研究Bcl-2及caspase-3與T淋巴細胞凋亡較多[51-56]，而研究Bcl-2及caspase-3與B淋巴細胞凋亡的較少[54-55]，目前上述兩種指標在T及B淋巴細胞中的表達差別還不清楚，而本試驗并未將兩種淋巴細胞分離檢驗，不排除因含量差別導致陰性結果。（2）上述實驗多研究人參中某一單一成分對相關指標的影響，而參麥注射液是含有多種復雜成分的中成藥，成分之間可能會有交叉反應，進而影響實驗結果，尤其目前對于麥冬對凋亡的相關研究較少，麥冬對人參中可能影響凋亡的相關成分的影響目前尚無報道。第二，在免疫抑制階段抗擊凋亡的治療措施（升高Bcl-2及降低caspase-3）可使膿毒癥動物模型得到緩解，應可能影響膿毒癥患者的死亡率，但本試驗與上述結論不符，考慮原因為：研究顯示，膿毒癥的前炎癥階段與早期死亡率相關，晚期死亡率與膿毒癥的第二階段免疫抑制階段相關[8]，但膿毒癥的兩個病理生理階段“前炎癥階段”及“免疫抑制階段”常常同時存在，本試驗采用參麥抑制細胞凋亡雖主要針對免疫抑制階段，如果時間上兩階段有重疊，那么對死亡率的影響可能還包括5 d以內的死亡率，這是本試驗未做統(tǒng)計的。endprint

綜上所述，本試驗提示，將參麥注射液應用在膿毒癥患者治療中，對于Bcl-2、caspase-3及5、28 d全因死亡率暫未發(fā)現(xiàn)有顯著的影響。

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（收稿日期：2017-03-16）endprint