松果菊苷對(duì)db/db小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響

唐鳳娟+郝亞榮++張雪++秦建

[摘要] 目的 探討松果菊苷（ECH）對(duì)db/db小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響及其作用機(jī)制。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將21只8周齡體重40～48 g的健康雄性db/db小鼠分為db/db+ECH組[n = 11，ECH灌胃300 mg/（kg·d）]和db/db組（n = 10，給予相應(yīng)體積的生理鹽水灌胃）。以同窩出生的db/m小鼠為正常對(duì)照組，即db/m組（n = 9，給予相應(yīng)體積的生理鹽水灌胃）。每周檢測(cè)小鼠的體重。連續(xù)干預(yù)10周后處死小鼠，留取肝臟組織標(biāo)本，檢測(cè)小鼠肝濕重、睪丸周圍脂肪重量，提取肝臟總RNA用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)三組小鼠肝臟中過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）和脂肪酸氧化的限速酶肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（CPT-1）的mRNA表達(dá)水平，肝組織蘇木精-伊紅（HE）、油紅O染色評(píng)價(jià)病理學(xué)變化。處死三組小鼠前1 d禁食12 h后經(jīng)眼眶后取血，利用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平。 結(jié)果 與db/m組比較，db/db組小鼠體重、肝濕重、睪丸周圍脂肪重量增加，血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C升高，HDL-C降低（P < 0.05或P < 0.01），肝臟組織中肝細(xì)胞腫脹，空泡變性，大量的脂質(zhì)沉積；ECH干預(yù)后可降低db/db小鼠體重，肝濕重及睪丸周圍脂肪重量，也可以降低db/db小鼠血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平（P < 0.05或P < 0.01），改善肝組織病理改變和脂質(zhì)沉積情況，上調(diào)肝臟組織PPAR-α和CPT-1表達(dá)（P < 0.05）。 結(jié)論 ECH對(duì)db/db小鼠肝臟具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)肝臟組織中PPAR-α和CPT-1表達(dá)從而改善脂質(zhì)代謝有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 非酒精性脂肪肝；db/db小鼠；松果菊苷；過氧化物酶體增殖物激活受體α

[中圖分類號(hào)] RR285.5；R589.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）10（b）-0019-05

Effects of echinacoside on liver lipid metabolism in db/db mice

TANG Fengjuan1 HAO Yarong1 ZHANG Xue1 QIN Jian2

1.Department of Geriatrics， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China； 2.Central Laboratory， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of echinacoside （ECH） on liver lipid metabolism in db/db mice and its mechanism. Methods Twenty-one healthy male db/db mice aged 8 weeks and weighing from 40 to 48 g were divided into db/db+ECH group [n = 11， ECH， 300 mg/（kg·d）] and db/db group （n = 10， given the corresponding volume of saline） by random number table， db/m mice born with same littermates were served as normal control group， that was db/m group （n = 9， given corresponding volume of normal saline）. The weight of the mice was measured weekly. The mice were sacrificed 10 weeks after the intervention. The liver tissues were sacrificed and the wet weight of the liver and the weight of the fat around the testes were measured. The total RNA of the liver was extracted and the mRNA of peroxisome proliferator-activated receptor α （PPAR-α） and carnitine palmitoyl transterase-1 （CPT-1） were detected by real-time quantitative PCR. Liver tissue hematoxylin-eosin （HE）， oil red O staining were used to evaluate pathologic changes. The levels of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate transaminase （AST）， triglyceride （TG）， serum total cholesterol （TC）， high density lipoprotein cholesterol （HDL-C） and low density lipoprotein cholesterol （LDL-C） were measured by automatic biochemical analyzer after fasting for 12 hours and 1 d before the rats were sacrificed. Results Compared with db/m group， the body weight， wet weight of liver and testicular fat around the weight in the db/db group were increased， and the levels of ALT， AST， TG， TC， LDL-C in serum were increased and HDL-C in serum was decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， liver tissue showed liver cell swelling， vacuolar degeneration， a lot of lipid deposition； ECH intervention could reduce body weight， liver wet weight and testicular fat around the weight of db/db mice， decrease the levels of ALT， AST， TG， TC， LDL-C and increase the level of HDL-C （P < 0.05 or P < 0.01）， improve the pathological changes of liver tissue and lipid deposition， and up-regulate the expression of PPAR-α and CPT-1 in liver tissue （P < 0.05）. Conclusion Echinacoside has protective effect on liver of db/db mice， and its mechanism may be related to up-regulating the expression of PPAR-α and CPT-1 in liver tissue and improving lipid metabolism.endprint

[Key words] Nonalcoholic fatty liver disease； db/db mice； Echinacoside； Peroxisome proliferator-activated receptor α

非酒精性脂肪性肝病是除酒精和其他明確損肝因素所致的以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪堆積為主要特征的一系列疾病，包括肝細(xì)胞的脂肪沉積、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化[1]。近年來隨著人們生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病已成為最常見的慢性肝病，非酒精性脂肪性肝病也是肝硬化與肝癌發(fā)生的一個(gè)重要原因[2-3]。非酒精性脂肪性肝病的有效防治可阻止和改善疾病的進(jìn)程及預(yù)后。但對(duì)于該病至今尚缺乏有效的治療方法，因此，非酒精性脂肪性肝病早期的發(fā)現(xiàn)、診斷和預(yù)防工作顯得尤為重要。

目前為止，非酒精性脂肪肝尚無理想的治療藥物，臨床上主要使用調(diào)血脂藥如他汀類對(duì)其進(jìn)行治療，但其一方面毒副作用明顯，另一方面會(huì)加重脂質(zhì)在肝臟中的沉積，容易引起和加重肝損傷。因此，近年來從植物資源中尋找高效、安全的天然產(chǎn)物來改善和治療非酒精性脂肪性肝病及代謝綜合征已成為研究的一大熱點(diǎn)。松果菊苷（echinacoside，ECH）是從管花肉蓯蓉根部提取分離得到，為管花肉蓯蓉的活性部位蓯蓉總苷中含量最高的苯乙醇苷類化合物[4]。近年，ECH在對(duì)保護(hù)肝臟、抗炎的藥理作用已得到證實(shí)[5-6]。但鮮有關(guān)于ECH抗非酒精性脂肪性肝病的藥理作用及其機(jī)制研究。本研究通過給予db/db小鼠ECH治療，觀察ECH對(duì)db/db小鼠脂質(zhì)代謝的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

遺傳背景為C57BLKS/J的雄性db/db小鼠和db/m小鼠由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供[SCXK（蘇）2015-0001]，分籠飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物中心（SPF級(jí)），每籠4～5只，室溫18～24℃，相對(duì)濕度60%，每日光照12 h，實(shí)驗(yàn)期間自由攝食、飲水，喂養(yǎng)普通飼料，不運(yùn)用任何降糖藥物。

1.2 儀器與試劑

電子天平（METTER TOLEDO公司）；全自動(dòng)顯微鏡BX63（日本Olympus公司）；基因擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀（7500序列檢測(cè)系統(tǒng)）（美國(guó)ABI公司）；全自動(dòng)生化檢測(cè)儀AU2700、Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)。

ECH（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)150623）、4%多聚甲醛（谷歌生物科技有限公司，批號(hào)WB1101）、TRIZOL試劑（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)15596-026）；油紅O染液（上海晶都生物技術(shù)有限公司，批號(hào)JD-0699）；蘇木精染液（深圳市康初源有限公司，批號(hào)H1328）；伊紅染液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)G11002）；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)047A）；熒光定量PCR試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)820A）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

同窩出生6周齡小鼠經(jīng)檢疫1周及適應(yīng)飼養(yǎng)1周。隨機(jī)編號(hào)將db/db小鼠分為兩組：令1～10號(hào)為糖尿病對(duì)照組（db/db組，n = 10），11～21號(hào)為ECH治療組（db/db+ECH組，n = 11）。選取db/m小鼠9只作為正常對(duì)照組（db/m組，n = 9），于8周齡時(shí)分別作如下干預(yù)：db/m組和db/db組每日按照0.05 mL/10 g體重進(jìn)行生理鹽水灌胃10周。db/db+ECH組按松果菊300 mg/（kg·d）灌胃，共10周。每周檢測(cè)三組小鼠體重，觀察小鼠的攝食、飲水以及活動(dòng)等情況。干預(yù)10周后用2%戊巴比妥鈉0.1 mL/10 g體重腹腔注射麻醉小鼠，眼眶后采血，迅速分離血清，于-80℃冰箱保存待測(cè)。心臟灌流后，分離小鼠肝臟，稱取肝臟濕重、腹部及睪丸周圍脂肪重量。留取肝臟組織，一部分用4%多聚甲醛固定，用于做石蠟切片病理檢查，一部分新鮮組織做冰凍切邊后用于油紅O染色，剩余的肝臟組織置于液氮1 h后保存在-80℃，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.4 小鼠的一般情況

觀察并記錄實(shí)驗(yàn)期間小鼠的攝食、飲水、體重、行為和皮毛等一般情況。

1.5 肝功能與血脂水平

用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.6 肝臟HE染色和油紅O染色

HE染色：處死小鼠后立即分離肝臟，4%多聚甲醛中固定24 h后，脫水，石蠟包埋，切片厚度4 μm，進(jìn)行HE染色，在200×光鏡下觀察肝組織脂肪變及炎癥情況，并行NASH評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[7]制訂的標(biāo)準(zhǔn)。油紅O染色：肝臟組織有OCT包埋后，行冰凍切片，切片厚度為5 μm。用60%異丙醇洗后再水洗，然后采用油紅O工作液染色1 min，60%異丙醇分化30 s，水洗后以蘇木精染色30 s，水洗至顯微鏡下觀察清晰顏色，風(fēng)干后用中性樹脂封片。

1.7 RT-PCR檢測(cè)

取各組小鼠肝臟組織100 mg，Trizol法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后用SYBR Green擴(kuò)增cDNA，每個(gè)樣本加入3個(gè)復(fù)孔。擴(kuò)增條件：①預(yù)變性95℃ 30 s；②PCR反應(yīng)95℃ 5 s、60℃ 40 s，總共40個(gè)循環(huán)；③溶解95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s。選取管家基因β-actin作為內(nèi)參照，使用ABI7500軟件2-△△CT法處理數(shù)據(jù)[8]，引物序列見表1。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

研究數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組資料間比較采用單因素方差分析，兩兩比較，方差齊采用LSD法，方差不齊采用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。endprint

2 結(jié)果

2.1 小鼠的一般情況及ECH對(duì)小鼠體重、肝濕重以及睪丸周圍脂肪重量的影響

實(shí)驗(yàn)過程中db/m組小鼠攝食與飲水正常，皮毛光滑。與db/m組比較，db/db組和db/db+ECH組小鼠水與食物攝入量增加，活動(dòng)度降低，皮毛顏色變黑。db/db組小鼠在第8周時(shí)體重是db/m組小鼠的近2倍[（43.34±1.70）g比（21.51±1.71）g，P < 0.01]。干預(yù)10周后，db/db組小鼠體重明顯高于db/m組（P < 0.01），而db/db+ECH組小鼠體重較db/db組明顯下降（P < 0.01）（圖1）。三組小鼠干預(yù)10周后肝臟濕重、睪丸周圍脂肪重量差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），與db/m組比較，db/db組小鼠肝臟濕重、睪丸周圍脂肪重量明顯升高（P < 0.01），與db/db組比較，db/db+ECH組小鼠肝臟濕重、睪丸周圍脂肪明顯下降（P < 0.05）（表2）。實(shí)驗(yàn)過程中ECH治療組小鼠死亡1只（被咬死）。

與db/m組比較，**P < 0.01；與db/db組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；ECH：松果菊苷

圖1 ECH對(duì)db/db小鼠體重的影響

2.2 ECH對(duì)db/db小鼠血脂水平以及肝功能的影響

與db/m組比較，db/db組小鼠TC、TG、LDL、ALT、AST和明顯升高（P < 0.05），而HDL-C明顯降低（P < 0.01）。與db/db組比較，db/db+ECH組小鼠TC、TG、ALT、AST明顯降低（P < 0.01），HDL-C顯著升高（P < 0.01）（圖2）。

2.3 ECH對(duì)db/db小鼠肝臟形態(tài)學(xué)的影響

HE染色顯示，db/m組小鼠肝組織染色正常，肝細(xì)胞排列整齊，胞漿分布均勻。db/db組肝細(xì)胞體積增大，表現(xiàn)為腫脹和大小不等的脂滴。中肝葉是可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的，在肝門區(qū)有病灶性壞死，非酒精性脂肪性肝病活動(dòng)度評(píng)分3～7分，60%達(dá)到非酒精性脂肪性肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)（圖3A）。與db/db組比較，db/db+ECH組小鼠肝細(xì)胞體積減小，細(xì)胞內(nèi)脂滴減少，炎性浸潤(rùn)減輕（圖3A）。油紅染色顯示，db/m組小鼠肝細(xì)胞脂滴少，無脂質(zhì)變性。db/db組小鼠肝細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重脂質(zhì)變性，觀察到不同大小的脂質(zhì)空泡，在門靜脈竇區(qū)有顯著意義。經(jīng)ECH治療后小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積明顯減輕（P < 0.01，圖3B）。

2.4 ECH對(duì)db/db小鼠肝臟組織中PPAR-α和CPT-1的mRNA表達(dá)水平的影響

應(yīng)用Takara RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行mRNA定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：db/db組小鼠肝臟組織PPAR-α和CPT-1水平顯著低于db/m組小鼠（P < 0.01）；經(jīng)ECH治療10周后，小鼠肝臟組織PPAR-α和CPT-1表達(dá)水平較db/db組明顯升高（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

非酒精性脂肪性肝病是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，與肥胖、高脂血癥、2型糖尿病等多種因素密切相關(guān)[9]。非酒精性脂肪性肝病與高尿酸血癥以及痛風(fēng)也密切相關(guān)[10]。本研究所研究的動(dòng)物db/db小鼠是由于在瘦素受體基因中發(fā)生異常的剪接導(dǎo)致瘦素受體發(fā)生缺失突變而產(chǎn)生肥胖、高血糖、高胰島素、脂肪肝等表現(xiàn)，常用于非酒精性脂肪性肝病的實(shí)驗(yàn)研究[11]。

本研究利用ECH給予db/db小鼠灌胃治療，觀察ECH對(duì)糖尿病小鼠肝脂質(zhì)代謝的影響，結(jié)果顯示，db/db組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、ALT、AST顯著高于db/m組，血清HDL-C顯著低于db/m組；病理檢查顯示，db/db組小鼠肝臟組織出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、空泡變性、脂質(zhì)沉積和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與db/db組小鼠比較，db/db+ECH組小鼠血清TC、TG、LDL-C、ALT、AST顯著降低，血清HDL-C顯著升高，并且病理檢查顯示db/db+ECH組肝細(xì)胞空泡細(xì)胞數(shù)目明顯減少，胞質(zhì)含脂肪滴減少，脂肪肝得到明顯的改善，證實(shí)ECH能減輕db/db肝臟脂肪變性，對(duì)db/db小鼠肝臟具有保護(hù)作用。

過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位[12]。PPAR-α活化后促進(jìn)脂質(zhì)代謝的主要機(jī)制有：調(diào)控很多線粒體和過氧化物酶體脂肪酸β氧化的很多關(guān)鍵酶，如CPT-1等[13]；促進(jìn)長(zhǎng)鏈、支鏈脂肪酸氧化[14]；活化后調(diào)節(jié)脂蛋白的合成和組裝，減少極低密度脂蛋白的量[15]；活化后間接調(diào)節(jié)膽汁酸的合成，促進(jìn)膽固醇排泄[16]；活化后可抑制炎癥基因的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪性肝病患者或是長(zhǎng)期過度攝食富含大量脂類食物的動(dòng)物模型中，PPAR-α在肝臟的表達(dá)顯著降低[17-18]。Everett等[19]在用PPAR-α基因敲出鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，其肝臟游離脂肪酸含量顯著增多，脂質(zhì)代謝明顯紊亂，肝臟出現(xiàn)明顯的脂肪變性。這些發(fā)現(xiàn)都說明PPAR-α在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。CPT-1是脂肪酸β氧化中的限速酶，在脂肪肝病中起著非常重要的作用[20]。本研究結(jié)果顯示，db/db組小鼠肝臟組織中PPAR-α、CPT-1 mRNA水平較db/m組明顯降低；在db/db+ECH組小鼠肝臟組織中PPAR-α、CPT-1 mRNA水平較db/db組顯著升高，說明ECH可以調(diào)節(jié)TG和TC的生物合成和吸收，影響db/db小鼠的脂質(zhì)代謝，并通過調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)水平來保護(hù)肝臟功能。

綜上所述，本研究表明ECH對(duì)db/db小鼠的肝功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)肝臟組織中PPAR-α和CPT-1表達(dá)從而改善脂質(zhì)代謝有關(guān)。

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（收稿日期：2017-06-23 本文編輯：張瑜杰）endprint