煙蚜繭蜂繁蜂棚蚜霉病病原鑒定及防治研究

周挺，陳濤，張瀛，林天然，林勇，林水良，顧鋼

1 福建省煙草公司，煙草科學(xué)研究所，福建福州北環(huán)中路133號(hào) 350003；2 福建省三明市煙草公司，煙草科學(xué)研究所，福建三明江濱南路166號(hào)365000；3 福建省龍巖市煙草公司，煙草科學(xué)研究所，福建龍巖龍巖大道288號(hào)364000；4 福建省南平市煙草公司，煙草科學(xué)研究所，福建南平江濱中路389號(hào)353000

煙蚜繭蜂繁蜂棚蚜霉病病原鑒定及防治研究

周挺1，陳濤2，張瀛2，林天然3，林勇4，林水良2，顧鋼1

1 福建省煙草公司，煙草科學(xué)研究所，福建福州北環(huán)中路133號(hào) 350003；2 福建省三明市煙草公司，煙草科學(xué)研究所，福建三明江濱南路166號(hào)365000；3 福建省龍巖市煙草公司，煙草科學(xué)研究所，福建龍巖龍巖大道288號(hào)364000；4 福建省南平市煙草公司，煙草科學(xué)研究所，福建南平江濱中路389號(hào)353000

為探明繁蜂棚中蚜霉病的病原種類及防治技術(shù)，采集繁蜂棚中感病蚜蟲(chóng)和空氣中的真菌，通過(guò)顯微形態(tài)學(xué)和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）擴(kuò)增證實(shí)繁蜂棚內(nèi)寄生蚜蟲(chóng)的病原真菌為蚜蟲(chóng)枝孢霉（Cladosporium aphidis）；密封試驗(yàn)箱內(nèi)的消毒試驗(yàn)結(jié)果表明：在0.5 g/m3和1 g/m3劑量下，三氯異氰尿酸的總殺菌率可達(dá)92.31%和92.31%，對(duì)蚜蟲(chóng)枝孢霉的殺滅率分別達(dá)80.00%和83.33%；二氧化氯的總殺菌率可達(dá)97.88%和83.35%，對(duì)蚜蟲(chóng)枝孢霉的殺滅率分別達(dá)100%和93.33%；利用含三氯異氰尿酸鈉的熏蒸劑熏蒸繁蜂棚，對(duì)蚜霉病的防治效率達(dá)69.65%。

煙蚜繭蜂；大棚；熏蒸；蚜蟲(chóng)枝孢霉；蚜霉病

我國(guó)烤煙生產(chǎn)中每年煙蚜危害面積約150000 hm2，造成直接經(jīng)濟(jì)損失約7224萬(wàn)元，煙蚜還可傳播多種植物病毒，帶來(lái)更為嚴(yán)重的間接經(jīng)濟(jì)損失[1]。利用蟲(chóng)生真菌和天敵昆蟲(chóng)防治蚜蟲(chóng)是重要的生物防治措施，可有效避免化學(xué)防治帶來(lái)的諸多問(wèn)題。近年來(lái)煙草行業(yè)在利用煙蚜繭蜂防治煙蚜技術(shù)方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步[2]，并從2014年起在全國(guó)煙區(qū)大面積推廣應(yīng)用。蚜繭蜂的規(guī)?；敝呈菬熝晾O蜂防治煙蚜的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，由于南方煙區(qū)冬、春季白天繁蜂棚內(nèi)溫度10℃～25℃，濕度較大，較適于蚜蟲(chóng)枝孢霉的生長(zhǎng)和分生孢子的形成[4-5]，容易造成棚內(nèi)蚜霉病的發(fā)生和流行，成為高效繁蜂的制約因素[3]。通風(fēng)和噴施殺菌劑可以在一定程度上減少蚜霉病的發(fā)生，但棚內(nèi)空氣中的病菌還會(huì)繼續(xù)引起蚜霉病的發(fā)生。在封閉空間采用藥劑熏蒸措施，可有效殺滅空氣中的病原物，具有高效、簡(jiǎn)便、低殘留、低成本的特點(diǎn)。本研究的目的是探明繁蜂棚內(nèi)蚜霉菌種類，尋找高效、簡(jiǎn)便、低殘留、低成本的蚜霉病防治方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

藥劑：97%三氯異氰尿酸（TCCA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；10%二氧化氯（CLO2，山東華實(shí)藥業(yè)有限公司）；“煙霧彈”（三氯異氰尿酸鈉煙熏劑，哈爾濱康龍獸藥有限公司）。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.2 蚜霉病的病原鑒定

1.2.1 蚜霉病的采集和鑒定

煙蚜繭蜂繁育大棚中采集被病原菌寄生死亡的蚜蟲(chóng)個(gè)體，75%酒精中浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗3遍，置PDA平板上，28℃培養(yǎng)。長(zhǎng)出菌落后，轉(zhuǎn)移至新鮮PDA平板，挑取菌落邊緣菌絲，置載玻片上制成臨時(shí)玻片標(biāo)本，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲及分生孢子形態(tài)，進(jìn)行菌株形態(tài)學(xué)鑒定。

采用CTAB法提取菌體DNA[6]，利用真菌rDNA通用引物 ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） 進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，以無(wú)菌水做擴(kuò)增模板為陰性對(duì)照。

PCR產(chǎn)物送英杰生命技術(shù)有限公司（Invitrogen）測(cè)序，采用計(jì)算機(jī)分析軟件MEGA3.1及NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行拼接和比對(duì)分析。

1.2.2 空氣中真菌的采集和鑒定

繁蜂棚內(nèi)制作0.125 m3的密封試驗(yàn)箱，將PDA平板置于密封試驗(yàn)箱內(nèi)部，10 min后取出，28℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3 熏蒸效果檢驗(yàn)

將灼熱的鋁盒（Φ=8 cm）置于密封試驗(yàn)箱內(nèi)部，供試藥劑TCCA和CLO2分別設(shè)1 g/m3及0.5 g/m32個(gè)處理，均勻?yàn)⒃阡X盒上，迅速封閉試驗(yàn)箱，12 h后將PDA平板置于箱內(nèi)10 min后密封取出，每處理重復(fù)3次，以未熏蒸的密封試驗(yàn)箱作為對(duì)照。PDA平板28℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)并鏡檢。

1.4 蚜霉病防治試驗(yàn)

選擇福建省泰寧縣繁蜂基地作為大棚熏蒸試驗(yàn)場(chǎng)地，利用“煙霧彈”于繁蜂后和次年繁蜂前對(duì)大棚（33 m×24 m×3 m）各進(jìn)行1次密閉熏蒸消毒（0.67 g/m3），24 h后通風(fēng)，隨后進(jìn)行常規(guī)繁蜂作業(yè)，并記錄棚內(nèi)的溫濕度情況。于繁蜂棚外搭建9 m×3 m×2 m的塑料棚作為對(duì)照，不進(jìn)行熏蒸處理，常規(guī)繁蜂作業(yè)。于蚜蟲(chóng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（2月29日接蚜，3月15日調(diào)查），利用5點(diǎn)法調(diào)查發(fā)病蚜蟲(chóng)數(shù)，每點(diǎn)調(diào)查500頭蚜蟲(chóng)，記錄被真菌寄生的蚜蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算平均發(fā)病率及防治效果。于蚜繭蜂僵蚜大量形成期（3月20日接蜂，4月5日調(diào)查），利用5點(diǎn)法調(diào)查僵蚜數(shù)量，每點(diǎn)調(diào)查500頭蚜蟲(chóng)，記錄僵蚜數(shù)量，計(jì)算平均僵蚜形成率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSSv18.0數(shù)據(jù)處理軟件單因素ANOVA分析各處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚜霉病的病原鑒定

2.1.1 蚜蟲(chóng)病原菌鑒定

從死亡蚜蟲(chóng)蟲(chóng)體上分離得到的病原菌菌落成深褐色或墨綠色，背面黑色，菌絲具短節(jié)狀膨大（球狀凸起），菌絲頂端著生枝孢，枝孢頂端著生分生孢子（圖1），根據(jù)菌絲形態(tài)學(xué)特征，鑒定為蚜蟲(chóng)枝孢霉（Cladosporium aphidis）[7-8]。

圖1 蚜蟲(chóng)枝孢霉的菌落（a）和菌絲形態(tài)（b，c）Fig.1The colony (a) and mycelium morphology (b,c) of Cladosporium aphidis

利用真菌rDNA通用引物ITS1，ITS4對(duì)蚜蟲(chóng)枝孢霉的ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條約550 bp的片段（圖2），經(jīng)測(cè)序、拼接、比對(duì)分析，該序列 與 GENBANK 中 的 KJ361498.1、HQ696055.1、KX078470.1等枝孢屬真菌的ITS序列同源性達(dá)99%以上，認(rèn)定該菌屬于枝孢霉屬。

圖2 蚜蟲(chóng)枝孢霉ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增Fig.2 The amplicon of ITS region in Cladosporium aphidis isolates

2.1.2 空氣中真菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明，78個(gè)菌落中有30株屬于蚜蟲(chóng)枝孢霉，與蟲(chóng)體上分離到的病原菌種類一致；48株屬于其他類真菌，包括鐮刀菌、青霉等植物病原真菌，木霉菌及一些未定種真菌（圖3）。

圖3 密封試驗(yàn)箱空間捕捉菌落形態(tài)鑒定結(jié)果Fig.3 Identi fi cation of fungus in hermetic chamber by morphological characters

2.2 密封試驗(yàn)箱熏蒸結(jié)果

由表1可知，選用的2種熏蒸劑按照1 g/m3及0.5 g/m3的劑量均可有效殺滅密封試驗(yàn)箱內(nèi)的各種真菌，各處理總菌落數(shù)與對(duì)照總菌落數(shù)差異極顯著，而各處理之間的總菌落數(shù)無(wú)顯著差異。

表1 2種熏蒸劑對(duì)密封試驗(yàn)箱的熏蒸效果比較Tab.1 Elimination rate of fungus by fumigating in hermetic chamber

TCCA處理的蚜蟲(chóng)枝孢霉菌落數(shù)與對(duì)照差異顯著， CLO2處理的蚜蟲(chóng)枝孢霉菌落數(shù)與對(duì)照差異極顯著。各處理之間的蚜蟲(chóng)枝孢霉菌落數(shù)無(wú)顯著差異。

試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)2種熏蒸劑在試驗(yàn)濃度下對(duì)煙蚜繭蜂成蜂具有較強(qiáng)毒性。

2.3 蚜霉病防治效果

2016年春季繁蜂期間，繁蜂棚內(nèi)平均溫濕度較適合蚜蟲(chóng)枝孢霉侵染煙蚜[3,5]（表2）。

調(diào)查結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)2次熏蒸后的繁蜂棚內(nèi)蚜霉病的發(fā)生率控制在5%以內(nèi)（圖4），較未熏蒸的繁蜂棚顯著降低，防治效果達(dá)69.65%；熏蒸過(guò)的繁蜂棚較未熏蒸的繁蜂棚僵蚜形成率顯著上升，提高14.36個(gè)百分點(diǎn)（圖5）。

表2 繁蜂棚內(nèi)不同時(shí)期平均溫濕度記錄Tab.2 Average temperature and humidity in different periods in greenhouse

圖4 三氯異氰尿酸熏蒸防治蚜霉病效果Fig.4 Control ef fi cacy of aphid mildew disease by fumigation using TCCA

圖5 三氯異氰尿酸熏蒸對(duì)煙蚜繭蜂繁殖效率的影響Fig.5 The effect of TCCA fumigation on reproduction of Aphidius gifuensis Ashmaed

3 討論

蚜蟲(chóng)枝孢霉是一種寄生于蚜蟲(chóng)蟲(chóng)體上的蟲(chóng)生真菌[9-10]，適應(yīng)溫度范圍廣，對(duì)煙蚜具有較強(qiáng)的毒力[4-5]。本研究所采集的真菌樣本中有38.46%屬于蚜蟲(chóng)枝孢霉，表明蚜蟲(chóng)枝孢霉分生孢子廣泛存在于未熏蒸的繁蜂棚空氣中，是棚內(nèi)蚜蟲(chóng)大量病變死亡的直接原因。

在夜間15 ～ 25℃和結(jié)露條件下，蚜霉菌較易侵染蚜蟲(chóng)[3]。福建省春季繁蜂棚較易達(dá)到此溫濕條件，棚內(nèi)環(huán)境不僅適合煙蚜及蚜繭蜂的生長(zhǎng)發(fā)育，且較易導(dǎo)致蚜霉病的發(fā)生流行。本研究是從降低初侵染源的角度出發(fā)，相比噴施殺菌劑，熏蒸法可以更徹底地殺滅空間中的病原菌，且不會(huì)在煙株葉片上產(chǎn)生霧滴增加環(huán)境濕度。

TCCA和CLO2是公認(rèn)的高效安全廣譜消毒劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧業(yè)等領(lǐng)域[11-15]，采用熏蒸法消毒溫室大棚，藥劑的使用劑量低、成本低、操作簡(jiǎn)便，易于推廣?？紤]到2種藥劑對(duì)不銹鋼的腐蝕作用，本試驗(yàn)選擇了含TCCA成分的熏蒸劑作大棚熏蒸試驗(yàn)。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)2種熏蒸劑在試驗(yàn)濃度下對(duì)煙蚜繭蜂成蜂具有較強(qiáng)毒性，所以熏蒸要嚴(yán)格控制在繁蜂前后大棚空置時(shí)進(jìn)行。

在本研究所采集的真菌樣本中，除了蚜蟲(chóng)枝孢霉，還包括一些植物病原真菌（青霉、鐮刀菌等），表明這2種熏蒸劑可以殺滅多種植物病原真菌，鑒于此，該方法還可以推廣至烤煙育苗階段，用于防治烤煙苗期病害。

4 結(jié)論

造成福建省繁蜂棚內(nèi)蚜蟲(chóng)大量死亡的蟲(chóng)生真菌為蚜蟲(chóng)枝孢霉（Cladosporium aphidis），且廣泛存在于繁蜂棚內(nèi)。

利用TCCA或CLO2熏蒸處理，可以有效殺滅空間內(nèi)的蚜蟲(chóng)枝孢霉；利用含TCCA成分的熏蒸劑熏蒸繁蜂棚，可降低蚜霉病的發(fā)生率，提高繁蜂效率。

本研究證明了利用熏蒸的方法可有效解決煙蚜繭蜂繁蜂棚內(nèi)的蚜霉病危害問(wèn)題，該方法可在我國(guó)南方煙區(qū)煙蚜繭蜂繁蜂基地推廣應(yīng)用。同時(shí)在試驗(yàn)過(guò)程中作者發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)選用的2種熏蒸劑還可殺滅多種植物病原菌，其中也包括能夠引起烤煙病害的病原菌，基于這2種藥劑高效、低風(fēng)險(xiǎn)的特性，其在烤煙病害防治方面的利用價(jià)值還有待進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。

致謝

本文在成文過(guò)程中得到了福建農(nóng)林大學(xué)張紹升教授、陳鳳平副研究員的大力支持和幫助。作者在此表示衷心感謝！

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：ZHOU Ting, CHEN Tao, ZHANG Ying, et al. Identification and control of pathogen of aphid mildew in infectedAphidius gifuensisAshmaed in reproducing house [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017,23(3)

*Corresponding author.Email：gugang318@163.com

Identi fi cation and control of pathogen of aphid mildew in infected Aphidius gifuensis Ashmaed in reproducing house

ZHOU Ting1, CHEN Tao2, ZHANG Ying2, LIN Tianran3, LIN Yong4, LIN Shuiliang2, GU Gang1*
1 Institute of Tobacco Science, Fujian Provincial Tobacco Company, Fuzhou 350003, China;2 Institute of Tobacco Science, Fujian Sanming Tobacco Company, Sanming 365000, China;3 Institute of Tobacco Science, Fujian Longyan Tobacco Company, Longyan 364000, China;4 Institute of Tobacco Science, Fujian Nanping Tobacco Company, Nanping 353000, China

In order to explore the causes and control techniques for aphid mildew, fungi on deadMyzus persicaeand in the air were isolated from reproducing house whereAphidius gifuensisAshmaed were feeded. ITS region and morphological characters were used to identify pathogen. Results showed thatCladosporium aphidiswas the pathogen causing aphid mildew in reproducing house. A hermetic chamber were fumigated by Trichloroisocyanuric acid (TCCA) and chlorine dioxide (ClO2) at two dosages, 0.5g/m3and 1g/m3. The elimination rate of the two doses of TCCA was 92.31% and 92.31%, with responding control efficacy of 80.00% and 83.33% onCladosporium aphidis. The elimination rate of two doses of ClO2 was 97.88% and 83.35%, with responding control efficacy of 100% and 93.33%. The control efficacy in reproducing house was 69.65% by fumigation using a disinfectant with TCCA.

Aphidius gifuensisAshmaed；reproducing house；fumigation；Cladosporium aphidis；aphid mildew disease

周挺，陳濤，張瀛，等. 煙蚜繭蜂繁蜂棚蚜霉病病原鑒定及防治研究[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2017,23（3）

中國(guó)煙草總公司福建省公司科技項(xiàng)目“煙蚜繭蜂防治蚜蟲(chóng)技術(shù)應(yīng)用”

周 挺（1984—）碩士研究生，農(nóng)藝師，主要從事烤煙病蟲(chóng)害防治方面研究，Tel:0591-87721055，Email:fjyczhouting@126.com

顧 鋼（1965—），Tel:0591-87721961，Email:gugang318@163.com

2016-09-05；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-03-14