海藻糖增強(qiáng)煙草對普通花葉病的抗性及其機(jī)理的初步分析

石永春，劉金燕，王小彥，陳芊伊，王瀟然，劉衛(wèi)群

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002；2 遵義市煙草公司技術(shù)中心，遵義 563000

植物保護(hù)

海藻糖增強(qiáng)煙草對普通花葉病的抗性及其機(jī)理的初步分析

石永春1，劉金燕1，王小彥2，陳芊伊1，王瀟然1，劉衛(wèi)群1

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002；2 遵義市煙草公司技術(shù)中心，遵義 563000

【目的】明確海藻糖能否增強(qiáng)煙草對煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）病的抗性?！痉椒ā坎捎冒肴~枯斑法、組織化學(xué)染色法、qPCR等技術(shù)分析海藻糖對TMV鈍化、預(yù)防和抑制的效果，海藻糖處理后煙葉中活性氧的含量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量、抗氧化酶活性變化，相關(guān)抗氧化和抗病基因的表達(dá)變化。【結(jié)果】海藻糖能夠鈍化TMV，對花葉病有治療和預(yù)防的效果。海藻糖處理24 h后，煙葉中H2O2和脯氨酸含量升高，POD和SOD活性下降，APX和編碼NADPH氧化酶亞基基因的表達(dá)水平升高，抗病基因PR、N-LIKE基因和NtEIG-48表達(dá)增加。海藻糖處理未影響煙株的正常生長?！窘Y(jié)論】認(rèn)為海藻糖可能通過提高葉片中的H2O2含量，激活抗病基因表達(dá)而增強(qiáng)煙草對TMV的抗病性。

海藻糖；TMV；抗病性；H2O2；PR

煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）屬煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），其導(dǎo)致的煙草普通花葉病是栽培中的常見病害。與其他病原物一樣，TMV侵染也會誘導(dǎo)植物出現(xiàn)系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）[1]。而小分子化合物可以模仿SAR過程，誘導(dǎo)病程相關(guān)（pathogenicrelated，PR）蛋白增加，從而為植物提供廣譜、長效的抗性[2-3]，并可能引起代謝或形態(tài)學(xué)上的改變[4]。面對當(dāng)前抗病品種有限、育種滯后的現(xiàn)實(shí)，挖掘利用煙草自身產(chǎn)生的抗性分子，增強(qiáng)煙株對煙草花葉病的抗性，對煙草栽培具有重要的理論和實(shí)踐意義。

海藻糖（trehalose）是一種非還原性二糖，由兩分子葡萄糖以α-α-(1→1)糖苷鍵連接而成，在植物界廣泛存在。最早于1832年在黑麥中發(fā)現(xiàn)。2007年Karim等證明煙草中也存在海藻糖，濃度可達(dá)到10 μg/g（鮮重）[5]。

海藻糖參與植物的生物與非生物脅迫響應(yīng)。如Schluepmann等用30 mM海藻糖處理擬南芥，誘導(dǎo)防御相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子WRKY6和PR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶基因的表達(dá)增加[6]。Renard-Merlier等用海藻糖處理小麥，導(dǎo)致對小麥對白粉病抗性的增加[7]。Isidorov等發(fā)現(xiàn)，Armillaria ostoyae侵染歐洲赤松后，根中的海藻糖含量增加[8]。Luo等發(fā)現(xiàn)熱激脅迫下，海藻糖能減少小麥葉片中的ROS含量，且具有濃度效應(yīng)[9]。da Costa等用10%海藻糖處理酵母細(xì)胞后，增加對H2O2的耐受性[10]。

在煙草中，有關(guān)海藻糖的研究較少，且大多集中在逆境脅迫方面。如外源海藻糖處理可增加煙苗對干旱脅迫的抗性[11]。將擬南芥海藻糖-6-P合成酶轉(zhuǎn)化煙草，獲得了較高的對鎘和銅的耐受性[12]。將海藻糖-6-磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)將轉(zhuǎn)基因煙株具有較強(qiáng)的鹽脅迫耐受性[13]。而外源海藻糖能否增加煙草對花葉病的抗病性，機(jī)理如何？對煙草后期的生長是否有影響？還未見相關(guān)報道。本文報道了海藻糖處理后煙草中抗病相關(guān)的基因表達(dá)、生理生化和植物性形態(tài)指標(biāo)的變化，為栽培上利用海藻糖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和處理

實(shí)驗(yàn)材料為煙草K326（Nicotiana tabccumcv.K326），溫室常規(guī)栽培至8葉期，生長期間無脅迫。海藻糖（Amresco）為分析純，純度99.8%。

盆栽處理方式：將海藻糖溶于水后配置為1、2、3 mM的處理液，均勻噴施于8葉期煙草，對照噴施清水，每棵苗噴施50 mL，24 h后，取6、7片葉（自下而上）用于酶活性、丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量、組織化學(xué)染色、以及qPCR實(shí)驗(yàn)分析。

大田處理方式：10 mM的海藻糖溶于水后噴施8葉期煙苗，對照為水噴施，每棵噴施50 mL至葉片濕潤。24 h后移入大田，常規(guī)栽培。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 過氧化物酶（peroxidase， POD）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性按照Pandol fi ni的方法測定[14]。

1.2.2 丙二醛（MDA）含量按照Carmak and Horst的方法測定[15]。脯氨酸含量參照張殿忠等的方法測定[16]?？扇苄蕴呛繀⒄誃axter的方法進(jìn)行[17]。

1.2.3 組織化學(xué)染色：超氧陰離子按照Kim的方法進(jìn)行[18]，H2O2組織化學(xué)染色按照Fotopoulos的方法進(jìn)行[19]。

1.2.4 病毒鈍化檢測

（1）普通煙草花葉病(TMV)病毒粗提純。參照歐陽本友的方法對煙草花葉病毒進(jìn)行粗提純[20]。

（2）對TMV的抑制作用測定。

①鈍化實(shí)驗(yàn)。采用半葉枯斑法[21]，用摩擦接種法對心葉煙左半葉接種病毒與清水等體積混合液，右半葉接種不同濃度海藻糖(1、2、3 mM)和病毒等體積混合液，每個處理接種10 個葉片，5 d后統(tǒng)計枯斑數(shù)目，并計算抑制率。

②治療實(shí)驗(yàn)。對心葉煙全葉均勻接種病毒，24 h后，左半葉均勻涂抹清水，右半葉涂抹不同濃度海藻糖。每處理重復(fù)5 個葉片，5 d后統(tǒng)計枯斑數(shù)目并計算抑制率。

③預(yù)防實(shí)驗(yàn)。對心葉煙全葉涂抹不同濃度海藻糖，對照全葉涂抹清水，24 h 后，均勻接種病毒。每處理重復(fù)5 個葉片，5 d后統(tǒng)計枯斑數(shù)目并計算抑制率。

1.2.5 qPCR： RNA的提取參照康為世紀(jì)植物 RNA提取試劑盒(CW0588)說明書進(jìn)行，樣品RNA的反轉(zhuǎn)錄參照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser 試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書進(jìn)行。qPCR 的體系及反應(yīng)條件按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書進(jìn)行。引物設(shè)計如下表所示：

1.2.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，由one-way ANOVA法分析均值差異的顯著性, 顯著性水平P＜0.05，以*表示其差異性，顯著性水平P＜0.01，以**表示其差異性；采用Excel 2007軟件繪圖制表。

表1 引物設(shè)計Tab.1 Primer design

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻糖對煙草花葉病抗性的影響

采用半葉枯斑法初步分析海藻糖對TMV的抑制效果，結(jié)果顯示（表2、3、4），海藻糖對TMV有鈍化、抑制增殖和預(yù)防的效果，且都具有濃度效應(yīng)，最高鈍化效果、復(fù)制增殖抑制率和預(yù)防效果分別可達(dá)22.13%、39.43%和47.19%。

表2 海藻糖對TMV 的體外鈍化效果Tab.2 in vitro deactivation effects on trehalose to TMV

表3 海藻糖對TMV 的治療效果Tab.3 Therapy effects of trehalose on TMV

表4 海藻糖對TMV 的預(yù)防效果Tab.4 Prevention effects of trehalose on TMV

2.2 海藻糖對煙草葉片抗氧化能力的影響

植物的抗病性和活性氧之間關(guān)系密切。噴施海藻糖24 h后，煙草葉片中POD和SOD酶活性（圖1A、B）降低，APX、rbohD和rbohF的表達(dá)水平（圖1E）增加，葉片中的MDA（圖1C）、H2O2和超氧陰離子（圖1D）含量增加，但沒有明顯的濃度效應(yīng)。

2.3 海藻糖對煙草葉片滲透調(diào)節(jié)能力的影響

噴施海藻糖24 h后，葉片中的脯氨酸含量（圖2A）增加，且與海藻糖濃度呈正相關(guān)。但海藻糖對葉片中可溶性糖含量（圖2B）的影響不大。

2.4 海藻糖對煙葉抗病基因表達(dá)的影響

qPCR檢測顯示，海藻糖處理后，煙草葉片中的PR-1a（ 圖3A）、N-LIKE基 因（ 圖3B） 和NtEIG-48（圖3C）的表達(dá)水平均明顯升高。其中PR-1a的表達(dá)水平增加最多，最多可達(dá)到對照水平的100.13倍（2 mM海藻糖處理）；N-LIKE基因最多可增加至對照的2.62倍（3 mM海藻糖處理）；NtEIG-48可增加至對照的2.25倍（3 mM海藻糖處理）。證明葉面噴施海藻糖對煙葉的抗病性具有明顯的增強(qiáng)作用。

圖1 噴施海藻糖對煙草葉片中ROS和抗氧化酶的影響Fig.1 Effects of trehalose on ROS contents and antioxidant enzyme activities in tobacco leaves

圖2 海藻糖對煙草葉片中脯氨酸和可溶性糖含量的影響Fig.2 Effects of trehalose on contents of proline and soluble sugar in tobacco leaves

圖3 海藻糖對煙葉中抗病相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of trehalose on expression levels of disease resistance-related genes in tobacco leaves

2.5 海藻糖對煙草生長和后期農(nóng)藝性狀的影響

海藻糖處理24 h后，煙草葉片中的PIN（圖4A）和AUX（圖4B）的表達(dá)水平都增加，分別最多增加至對照水平的8.19倍（2 mM海藻糖處理）和9.17倍（3 mM海藻糖處理）。但由于煙草中IAA的轉(zhuǎn)運(yùn)受多基因的控制，故而海藻糖處理對葉片中IAA含量的影響還需研究。

為進(jìn)一步明確海藻糖對煙草生長的長期效果，將噴施了10 mM海藻糖的煙苗移栽入大田，60 d和90 d（打頂后）時監(jiān)測農(nóng)藝性狀，結(jié)果（表5）顯示，海藻糖處理后，煙株的莖圍、最大葉長、最大葉寬在60 d和90 d時都高于對照。但在60 d時，海藻糖處理的株高低于對照，葉片數(shù)僅比對照高0.35片，但打頂后（90 d），海藻糖處理的株高高于對照，且葉片數(shù)也比對照多2.85片。由于是在移栽后75 d同時打頂，這些數(shù)據(jù)說明海藻糖處理可能促進(jìn)了煙草的營養(yǎng)生長，且可能通過促進(jìn)后期（打頂后）上部葉開片而增加有效葉片數(shù)。

圖4 海藻糖對煙葉中IAA轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of trehalose on expression levels of IAA transport genes

表5 海藻糖處理對煙草農(nóng)藝性狀的影響Tab.5 Effects of trehalose on agronomic traits of tobacco

3 討論

生物或非生物脅迫都能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生活性氧，并導(dǎo)致膜脂或生物大分子的過氧化，而后啟動抗氧化反應(yīng)。但海藻糖對活性氧的作用卻存在兩種相反的報道，一是激活活性氧的產(chǎn)生。如Gao等發(fā)現(xiàn)，外源海藻糖處理蠶豆葉片24 h，導(dǎo)致保衛(wèi)細(xì)胞中H2O2的積累，并與海藻糖濃度呈正相關(guān)[22]。二是消除活性氧。如海藻糖處理后的小麥，熱激誘導(dǎo)的ROS含量顯著低于對照，并與海藻糖的濃度呈負(fù)相關(guān)[9]。海藻糖預(yù)處理后的水稻，鹽脅迫下也有類似效果[23]。POD、SOD和抗壞血酸過氧化物酶（APX）是植物細(xì)胞中負(fù)責(zé)清除活性氧的主要酶類[24]。質(zhì)膜上的NADPH氧化酶對活性氧的產(chǎn)生具有重要作用，rbohD和rbohF編碼NADPH氧化酶的兩個重要亞基[25]。本研究的結(jié)果與Gao的一致，都證明海藻糖處理后24 h，SOD和POD酶活性下降、葉片中H2O2積累。同時還發(fā)現(xiàn)葉片中超氧陰離子含量增加，以及rbohD/F表達(dá)水平的上調(diào)。這些數(shù)據(jù)都支持海藻糖處理后24 h，葉片中ROS增加。

N基因通過結(jié)合TMV的解螺旋酶誘發(fā)超敏反應(yīng)，抑制TMV對煙草的侵染[26]。N-LIKE基因是N基因的同源基因[27]，在煙草中以基因家族的形式存在，目前僅有少數(shù)N-like基因的結(jié)構(gòu)和功能比較清楚。Gao等在Nicotiana tabacumcv. Samsun NN（抗性）中克隆到兩個N-like基因——NL-C26 andNL-B69，發(fā)現(xiàn)他們在Samsun NN和Samsun nn（易感）中都表達(dá)，但在Samsun nn中并不引起超敏反應(yīng)[27]。煙草K326易感TMV，通過qPCR也檢測到了N-like基因的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其對海藻糖有響應(yīng)，這能否證明海藻糖能增加K326對TMV的抗性，還有賴于N-like基因的深入研究。

脯氨酸不僅是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還與植物對病毒的抗性有關(guān)[28-29]。檢測黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）侵染前后的胡椒，發(fā)現(xiàn)對CMV有抗性的品種葉片中脯氨酸含量遠(yuǎn)高于易感品種；而CMV侵染后，易感品種葉片中的脯氨酸含量大幅升高，而抗性品種葉片中脯氨酸含量變化不大[28]。類似的結(jié)果在TMV侵染的胡椒葉片中也有發(fā)現(xiàn)[29]。PR-1a是編碼病程相關(guān)蛋白基因[30]，NtEIG-48是煙草中響應(yīng)病害的WRKY轉(zhuǎn)錄因子[31]，它們都與植物對病毒的抗性密切相關(guān)[29-31]。海藻糖處理引起葉片中脯氨酸含量的增加（圖2-A），與PR-1a、NtEIG-48表達(dá)水平的增加一起，證明海藻糖的確增強(qiáng)了煙葉對病毒的抗性。PR-1a和NtEIG-48對病毒或病原菌的提取物都有響應(yīng)[29-31]，因此，海藻糖是否對其他病害也有抗性，尚需更廣泛深入的研究。

生長素對植物的營養(yǎng)生長非常重要。PIN和AUX分別編碼生長素IAA的外向和內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白[32-33]。本研究首次報道了海藻糖處理增加煙葉中PIN和AUX的表達(dá)水平。由于TMV的復(fù)制酶和IAA響應(yīng)蛋白之間存在互作[34]，且IAA含量增加可能促進(jìn)TMV對煙草的侵染[35]，海藻糖處理后葉片中IAA濃度究竟如何，還需要更多的分析。

大田實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，海藻糖處理后的煙苗，莖圍、最大葉長和最大葉寬都高于對照，打頂后有效葉片數(shù)也多于對照。表明海藻糖不僅能增加煙株的抗病性，且對農(nóng)藝性狀影響不大，還可促進(jìn)煙株健壯生長。

4 結(jié)論

本研究通過半葉枯斑法，發(fā)現(xiàn)海藻糖具有鈍化TMV、治療和預(yù)防普通花葉病的作用。初步分析了其內(nèi)在機(jī)理，認(rèn)為海藻糖可能通過誘導(dǎo)煙葉中活性氧的產(chǎn)生，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，激活細(xì)胞內(nèi)的抗性基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)煙草對花葉病的抗性。同時還發(fā)現(xiàn)，海藻糖能夠抑制煙葉中的IAA外流，促進(jìn)煙葉的營養(yǎng)生長；大田施用海藻糖還具有增加煙株莖圍、葉長、葉寬和有效葉片數(shù)的長期效果。

作為一種新型內(nèi)源性生長調(diào)節(jié)劑，海藻糖具有無污染不殘留、有效增強(qiáng)煙草抗病性、且不影響煙株正常生長的特點(diǎn)，有望在栽培上使用。若能進(jìn)一步研究海藻糖對煙草其他病害的抗性、對煙葉中IAA和內(nèi)容物的含量、以及對大田煙葉產(chǎn)量的影響，將為煙草栽培提供更多參考數(shù)據(jù)。

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：SHI Yongchun, LIU Jinyan, WANG Xiaoyan, et al. Enhancing resistance to TMV of tobacco by exogenous trehalose and preliminary analysis of its mechanism [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(3)

*Corresponding author.Email：shiyongchun369@gmail.com

Enhancing resistance to TMV of tobacco by exogenous trehalose and preliminary analysis of its mechanism

SHI Yongchun1*, LIU Jinyan1, WANG Xiaoyan2, CHEN Qianyi1, WANG Xiaoran1, LIU Weiqun1
1 Life Science College, Henan Agricultural University, Zhengzhou, 450002, China;2 Technology Center, Zunyi Tobacco Company, Zunyi, 563000, China

[Objective]The aim of current study was to determine the role of trehalose, an endogenous molecule of tobacco, palyed in enhancing resistance to tobacco mosaic virus (TMV) in tobacco. [Methods]Leaf lesion assay, histochemical stain and qPCR techniques were used to determine e ff ects of trehalose on resistance to TMV and antioxidant system in tobacco. [Results]Trehalose could deactivate TMV, and induce preventive and therapeutic process in tobacco. Twenty-four hours after trehalose treatment of tobacco, levels of H2O2and proline increased, activities of POD and SOD decreased, gene expression levels ofAPX, subunits of NADPH oxidase,PR,N-likeandNtEIG-48gene increased. Furthermore, agronomic traits were not impaired by trehalose treatment. [ Conclusions]Trehalose increased TMV resistance in tobacco, probably through increasing H2O2contents and activating expression of disease resistant genes.

trehalose; TMV; disease resistance; H2O2; PR

石永春，劉金燕，王小彥，等. 海藻糖增強(qiáng)煙草對普通花葉病的抗性及其機(jī)理的初步分析[J]. 中國煙草學(xué)報，2017, 23（3）

遵義市煙草公司科技項(xiàng)目（201506）

石永春（1978—），博士，副教授，主要研究煙草逆境生理， Tel：0371-63555790，Email：shiyongchun369@gmail.com

2016-12-01；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期：

日期：2017-03-14