4種含七葉苷培養(yǎng)基對(duì)單增李斯特菌檢測(cè)效果的比較研究

胡 朋 王 磊 何艷玲，2*

（1.北京陸橋技術(shù)股份有限公司 北京 100123；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院）

4種含七葉苷培養(yǎng)基對(duì)單增李斯特菌檢測(cè)效果的比較研究

胡 朋1王 磊1何艷玲1，2*

（1.北京陸橋技術(shù)股份有限公司 北京 100123；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院）

為了比較研究4種含七葉苷的單增李斯特菌選擇性分離培養(yǎng)基 （PALCAM、OXA、OXA和LPM）對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)效果，參考國(guó)標(biāo)GB4789.28-2013的方法對(duì)4種選擇性分離培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長(zhǎng)率和非目標(biāo)菌的抑制性進(jìn)行比較；通過(guò)人工污染樣品試驗(yàn)比較4種分離培養(yǎng)基對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)效果。結(jié)果顯示目標(biāo)菌在LMP上的生長(zhǎng)率最低，其余3種分離培養(yǎng)基的生長(zhǎng)率差異不大；綜合比較對(duì)非目標(biāo)菌的抑制性，PALCAM最佳；樣品中添加陽(yáng)性菌株實(shí)驗(yàn)表明LMP的靈敏度最低；檢測(cè)雜菌較少的樣品時(shí)，PALCAM、OXA和MOX的選擇性靈敏度差異不大，而檢測(cè)雜菌較多的樣品時(shí)，PALCAM的選擇性靈敏度最高。

單增李斯特菌；分離培養(yǎng)基；生長(zhǎng)率；靈敏度

1 前言

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）為重要的食源性致病菌，雖然當(dāng)前有很多快速檢測(cè)方法已成功應(yīng)用于該菌的檢測(cè)，但獲得活的細(xì)菌分離株仍然是流行病學(xué)調(diào)查和常規(guī)檢測(cè)中的關(guān)鍵步驟。為了獲得分離培養(yǎng)的單增李斯特菌，一般是先經(jīng)過(guò)選擇性肉湯增菌，然后將肉湯培養(yǎng)物接種單增李斯特菌的選擇分離平板[1]。由于不同的選擇體系對(duì)單增李斯特菌的分離效果不同，國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)在檢測(cè)樣品中的單增李斯特菌時(shí)一般選用兩種不同選擇體系的分離培養(yǎng)基——李斯特菌顯色培養(yǎng)基和含七葉苷的分離培養(yǎng)基。含七葉苷的分離培養(yǎng)基有很多，如ISO標(biāo)準(zhǔn)以O(shè)XA和PALCAM為選擇性分離培養(yǎng)基[2]；美國(guó)FDA標(biāo)準(zhǔn)以O(shè)XA、PALCAM、LPM和MOX為選擇性分離培養(yǎng)基[3]；AOAC Official Method以O(shè)XA和LPM為選擇性分離培養(yǎng)基[4]；2016版食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.30-2016《單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》以PALCAM為選擇性分離培養(yǎng)基[5]。為了比較上述4種含七葉苷的分離培養(yǎng)基對(duì)單增李斯特菌檢測(cè)效果的影響，本研究通過(guò)培養(yǎng)基生長(zhǎng)特性、選擇性以及人工污染樣品實(shí)驗(yàn)對(duì)4種分離培養(yǎng)基進(jìn)行比較，為廣大檢測(cè)工作者選擇合適的檢測(cè)方法提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 培養(yǎng)基

牛津瓊脂（OXA）、PALCAM培養(yǎng)基（PALCAM）、瓊脂（LPM）、改良牛津瓊脂（MOX）、含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、腦心浸液肉湯：以上培養(yǎng)基均由北京陸橋技術(shù)股份公司提供。

2.1.2 試驗(yàn)菌株

單 增 李 斯 特 菌 （Listeria monocytogenes）（ATCC19111）、單增李斯特菌 （Listeria monocytogenes）（ATCC19115）、大腸埃希菌（Escherichia coli）（ATCC25922）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）（ATCC29212）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC6538）：以上菌株購(gòu)于ATCC菌株保藏機(jī)構(gòu)。

2.1.3 樣品

需冷藏的奶類（酸奶、巴氏消毒奶）、常溫儲(chǔ)存奶類（巴氏滅菌酸奶、利樂(lè)包純牛奶）、速凍包類（速凍餃子、包子）、肉餡類、生食蔬菜類、熟食類（涼拌菜、熟肉、真空包裝即食肉類）、蛋糕類（面包、蛋糕、餅干）、豆制品類（即食包裝豆腐、豆絲、豆干）、雪糕類（冰棍、冰激凌）：共9類101個(gè)樣品，均購(gòu)于某大型超市。

2.2 方法

2.2.1 生長(zhǎng)率試驗(yàn)

采用定量方法進(jìn)行，參考GB 4789.28-2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》[6]。將上述菌株分別接種到腦心浸液肉湯，置36℃±1℃培養(yǎng)24 h；將肉湯進(jìn)行10倍梯度稀釋，單增李斯特菌選取10-6～10-7濃度的菌懸液各0.1mL涂布于各選擇性分離培養(yǎng)基，同時(shí)接種參比培養(yǎng)基TSA-YE，每種培養(yǎng)基進(jìn)行5個(gè)重復(fù)，于36℃±1℃培養(yǎng)24～48 h。

選擇菌落數(shù)適中的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，按下列公式計(jì)算生長(zhǎng)率PR。

式中：PR-生長(zhǎng)率；NS-待測(cè)培養(yǎng)基平板上得到的平均菌落數(shù)；N0-參比培養(yǎng)基平板上獲得的平均菌落數(shù)

2.2.2 對(duì)非目標(biāo)菌的抑制性試驗(yàn)

采用半定量方法進(jìn)行，參考GB 4789.28-2013。

2.2.3 選擇性靈敏度試驗(yàn)

在食品樣品中分別添加10-8、10-9兩個(gè)濃度的單增李斯特菌（ATCC19111和ATCC19115），同時(shí)對(duì)添加的菌量以傾注法計(jì)數(shù)，經(jīng)過(guò)LB1和LB2兩步增菌后，定性方法接種4種選擇性分離培養(yǎng)基。同時(shí)以無(wú)樣品添加的培養(yǎng)基為對(duì)照。

3 結(jié)果

3.1 4種分離培養(yǎng)基的生長(zhǎng)率比較

生長(zhǎng)率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和表2。結(jié)果顯示，兩株單增李斯特菌 （ATCC19115和 ATCCA19111）在LMP培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)率最低，其余3種分離培養(yǎng)基的生長(zhǎng)率比較接近，差異不大。

表1 單增李斯特菌ATCC19115在4種分離平板上的計(jì)數(shù)結(jié)果（培養(yǎng)48 h）

表2 單增李斯特菌ATCC19111在4種分離平板上的計(jì)數(shù)結(jié)果（培養(yǎng)48 h）

3.2 4種分離培養(yǎng)基對(duì)非目標(biāo)菌的抑制性比較

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。綜合考慮4種分離培養(yǎng)基對(duì)3種非目標(biāo)菌的抑制性，PALCAM的抑制性最好。

表3 4種分離培養(yǎng)基對(duì)非目標(biāo)菌的抑制性比較（G值）

3.3 4種分離培養(yǎng)基的選擇性靈敏度比較

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4、表5。

表4 4種分離培養(yǎng)基的選擇性靈敏度比較（樣品中添加單增李斯特菌ATCC19115）

表5 4種分離培養(yǎng)基的選擇性靈敏度比較（樣品中添加單增李斯特菌ATCC19111）

（1）4種分離培養(yǎng)基對(duì)樣品中添加單增李斯特菌ATCC19115和ATCC19111的選擇性分離效果無(wú)差別。

（2）LPM瓊脂的選擇性靈敏度最低，含雜菌較少的樣品與對(duì)照培養(yǎng)基一致，可分離得到少量的單增李斯特菌，而含雜菌較多的樣品，則無(wú)法分離得到單增李斯特菌。

（3）對(duì)于其余的3種分離培養(yǎng)基（PALCAM、OXA、MOX），含雜菌較少的樣品與對(duì)照培養(yǎng)基一致，3種分離培養(yǎng)基的選擇性靈敏度無(wú)差異；而對(duì)于含雜菌較多的樣品，PALCAM培養(yǎng)基的選擇性靈敏度最高，所含雜菌最少，分離得到的單增李斯特菌也最多。

（續(xù)表5）

4 結(jié)論

從生長(zhǎng)率試驗(yàn)可以得出，兩株單增李斯特菌的陽(yáng)性菌在LMP的生長(zhǎng)率均小于其他3個(gè)分離培養(yǎng)基，可能是由于LMP中的營(yíng)養(yǎng)成分較少，只含有胰酪胨、蛋白胨和牛肉粉，且含量較少，不利于單增李斯特菌的生長(zhǎng)。綜合評(píng)價(jià)4種分離培養(yǎng)基對(duì)非目標(biāo)菌的抑制性可以得出，PALCAM的抑制性最好，可能與該培養(yǎng)基中的抑菌成分和抗生素用量有關(guān)。

4種分離培養(yǎng)基在人工污染樣品試驗(yàn)中，對(duì)相對(duì)較干凈的樣品，由于含雜菌較少，對(duì)目標(biāo)菌的干擾性較小，4種分離培養(yǎng)基的選擇性靈敏度與其對(duì)照試驗(yàn)的結(jié)果一致，除了LPM靈敏度較差外，其余3種分離培養(yǎng)基無(wú)明顯差異；而對(duì)相對(duì)較臟的樣品，由于雜菌含量較多，與目標(biāo)菌呈競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)的關(guān)系，從而影響目標(biāo)菌的分離。綜合以上相對(duì)較臟樣品的分離結(jié)果，只有PALCAM對(duì)目標(biāo)菌的分離效果與對(duì)照試驗(yàn)保持一致，而OXA和MOX在檢測(cè)某些樣品時(shí)分離得到的目標(biāo)菌很少，只在一區(qū)有培養(yǎng)基變黑的現(xiàn)象，難以得到單菌落，需要多次分純，說(shuō)明OXA和MOX培養(yǎng)基受樣品中雜菌的影響較PALCAM大。綜上所述，PALCAM是單增李斯特菌選擇性分離的理想培養(yǎng)基。

[1] 程潔，張曉峰.單增李斯特菌選擇性增菌培養(yǎng)和分離方法的比較研究[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2003，13（6）：36-38.

[2] ISO 11290-1：1996 Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for thedetection and enumeration of Listeria monocytogenes-part1：Detection method[S].

[3] Detection and Enumeration of Listeria monocytogenes in Foods// Bacteriological Analytical Manual，2016，Chapter 10.

[4] Listeria monocytogenes in Milk and Dairy Products[S].AOAC Official Method 993.12，1993.

[5] GB4789.30-2016單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)[S].

[6] GB 4789.28-2013食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求[S].

Comparative Study on the Effect of Four Kinds of Aescin-Containing Cultures on the Detection of Listeria monocytogenes

HU Peng1，WANG Lei1，HE Yanling1，2*
（1.Beijing Landbridge Technology Co.，Ltd.，Beijing，100123；2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine）

In order to study the effects of fourdifferent seizures ofListeria monocytogenes（PALCAM，OXA，OXA and LPM）onListeria monocytogenes，the results with GB4789.28-2013 method was used to compare the growth rate of target bacteria and the inhibition of non-target bacteria on four selective isolation medium.And the testing effects of four mediums toListeria monocytogenesby artificially polluted samples were compared.The results showed that the growth rate of target bacteria was the lowest in LMP，the other three kinds of mediums were notdifferent.Comparing with the inhibition on non-target bacteria，PALCAM was the best.The positive strains added experiment showed that the selective sensitivity of PALCAM，OXA and OXA was not verydifferent when samples with less bacteriadetected. And the selective sensitivity of OXA/MOX was not as good as that of PALCAM when samples with more bacteriadetected.

Listeria monocytogenes；Isolate Medium；Growth Rate；Selective Sensitivity

TS207.4

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2017-03-13