金邊朱砂根組培快繁體系的建立

陳俊暉+漆子鈺+駱亮+劉梓富+吳沙沙+翟俊文+彭東輝

摘要：金邊朱砂根是個葉果俱佳的品系，由于其掛果量極少，有性繁殖的后代容易出現(xiàn)性狀分離，不利于優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳，采用種子繁殖出的種苗遠不能滿足市場的需求，因此亟須采用組培快繁體系進行種苗的擴繁。以金邊朱砂根的莖段為外植體，采用單因素和正交試驗法研究不同滅菌方式、基本培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對金邊朱砂根莖段滅菌、初代培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：最佳的滅菌方式為0.1% HgCl2消毒8 min；初代培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，啟動率為73.33%；繼代增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA+ 0.1 mg/L噻重氮苯基脲（TDZ），增殖系數(shù)為4.27；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA，生根率為71.11%。

關鍵詞：金邊；朱砂根；組織培養(yǎng)

中圖分類號： S359文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0050-04

紫金牛屬（Ardisia）常綠小灌木，性喜陰涼，初夏開花，花白色略帶粉色，7月底結(jié)成青色果實，果實于10～12月成熟轉(zhuǎn)紅[1]。果實多，顏色紅艷，掛果期長，而且果期在春節(jié)期間，常作為年宵花卉的首選[2]。金邊朱砂根是由朱砂根變異種篩選出來的彩葉類型，是個葉果俱觀的品系。但是，目前具有該變異的植株較少并且掛果量極少，無法滿足生產(chǎn)上對種苗的需求。植株通過有性繁殖的后代容易出現(xiàn)性狀分離，不利于優(yōu)良性狀的穩(wěn)定遺傳，而且繁殖周期較長。為了在短時期內(nèi)獲得大量生長健壯的種苗。本研究通過對金邊朱砂根快繁體系的各個階段進行研究，力求建立一套可生產(chǎn)應用、高效的金邊朱砂根組培快繁體系，從而為金邊朱砂根種質(zhì)資源保存提供參考，并為金邊朱砂根種苗快繁提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

晴朗午后從金邊朱砂根盆栽母株（圖1）上選取生長健壯、無病蟲害的當年生帶腋芽莖段作為外植體。

1.2試驗方法

1.2.1外植體滅菌方案的篩選采集試驗材料后用適當濃度洗滌劑將莖段清洗干凈，用自來水沖洗30 min后置于超凈工作臺上，先用75%乙醇浸泡30 s，然后用無菌水沖洗2遍，再用 0.1% HgCl2（添加吐溫20）、2% NaClO進行不同時間消毒處理（表1）。滅菌劑消毒完后用無菌水沖洗3～5遍，在無

1.2.3繼代培養(yǎng)基的篩選以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用3因素3水平正交試驗設計（表3）， 將初代培養(yǎng)30 d的朱

水平因素A：基本培養(yǎng)基B：6-BA含量（mg/L）C：NAA含量（mg/L）1MS0.50.121/2 MS1.00.23WPM2.00.3

砂根組培苗切為約1.5 cm長的莖段，分別接種于繼代培養(yǎng)基上，每個處理接種30個外植體，重復3次，30 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。

1.2.4生根培養(yǎng)基的篩選以大量元素按比例配制的MS培養(yǎng)基+IBA、NAA溶液作為試驗因素，設計3因素3水平正交試驗（表4），從繼代增殖培養(yǎng)40 d的朱砂根組培苗上切取帶單個芽的外植體，接種于生根培養(yǎng)基上，每個處理接種30個外植體，重復3次，30 d后統(tǒng)計生根率、平均生根數(shù)。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。

表4生根培養(yǎng)基配方L9（34）正交設計

水平因素A：基本培養(yǎng)基B：IBA含量（mg/L）C：NAA含量（mg/L）11/2 MS0.50.023/4 MS1.01.03MS2.02.0

1.2.5數(shù)據(jù)分析采用Excel 2003、SPSS 19.0分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理與統(tǒng)計分析。各指標計算公式：污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；死亡率=死亡外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；啟動率=啟動生長的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；增殖系數(shù)=增殖后芽數(shù)/接種外植體數(shù)；生根率=生根株數(shù)/接種株數(shù)×100%；平均生根數(shù)=生根根數(shù)/接種不定芽數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1外植體滅菌結(jié)果

從表5可以看出，用0.1% HgCl2作滅菌劑時隨著消毒時間的增加，外植體的污染率下降，而死亡率先下降后上升；在消毒8 min時的死亡率極顯著低于其他消毒時間，僅為 11.67%；當用2% NaClO消毒10 min時，外植體死亡率最高，達到93.33%；而用0.1% HgCl2消毒12 min時，外植體死亡率也達到較高水平，為80.00%。從污染率、死亡率的控制考慮，用0.1% HgCl2消毒8 min是最佳的滅菌方式。

2.2初代培養(yǎng)

將滅菌過的莖段切取帶腋芽部分1.5 cm接到不同的基本培養(yǎng)基+不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA進行金邊朱砂根莖段的芽誘導啟動培養(yǎng)。培養(yǎng)15 d后，第1、2、5組培養(yǎng)基中外植體的頂端和葉腋處開始萌動生長，長出2～3個不定芽。

從表6可以看出，在初代啟動培養(yǎng)過程中，不同基本培養(yǎng)基和激素組合對金邊朱砂根莖段啟動培養(yǎng)的影響效果差別很大。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA組合下，啟動率最高，達到73.33%。正交試驗設計的極差R值決定各因素對金邊朱砂根莖段啟動生長的影響程度依次為A>B>C，即基本培養(yǎng)基>6-BA>NAA，最佳的組合為A1B2C3。

由方差分析得出，基本培養(yǎng)基的P值=0.018<0.05，6-BA的P值=0.033 5<0.05，NAA的P值=0.656>0.05，基本培養(yǎng)基和6-BA對金邊朱砂根莖段啟動率的影響顯著，NAA對其影響不顯著。進一步用LSD法多重比較3種因素對金邊朱砂根繼代增殖的影響。不同基本培養(yǎng)基的多重比較表明，MS與1/2 MS差異顯著，MS與WPM差異極顯著，1/2MS 與WPM差異不顯著。所以基本培養(yǎng)基為MS、1/2MS時均有利于金邊朱砂根莖段啟動，WPM效果較差。6-BA不同濃度水平的多重比較表明，0.5 mg/L處理與1.0 mg/L處理差異顯著，1.0 mg/L處理與2.0 mg/L處理差異顯著，0.5 mg/L 處理與2.0 mg/L處理差異不顯著。6-BA濃度為1.0 mg/L時啟動生長效果最好，明顯高于濃度為0.5、2.0 mg/L 時的啟動率，說明適宜濃度的6-BA對金邊朱砂根莖段啟動生長有促進作用，但是過高則會抑制。在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA組合處理下的朱砂根莖段培養(yǎng)15 d即啟動生長，頂端、葉腋處開始長芽，且長勢明顯優(yōu)于其他處理。

2.3繼代培養(yǎng)

將莖段初代啟動培養(yǎng)長出的不定芽切成單個芽轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中進行增殖，基本培養(yǎng)基選取前面試驗中效果最好的MS，添加不同質(zhì)量濃度的6-BA、NAA和TDZ組合，對繼代增殖培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

2.4生根培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

將繼代增殖中的不定芽切去2 cm作生根材料，在按不同大量元素比例配制的改良MS培養(yǎng)基上添加不同質(zhì)量濃度的NAA、IBA進行生根培養(yǎng)，40 d后統(tǒng)計生根率和平均生根數(shù)。從表8可以看出，在生根培養(yǎng)過程中，不同基本培養(yǎng)基和生長素組合對生根的影響差異較大。在1/2 MS+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA組合下，生根率最高，為71.11%，平均生根數(shù)最多，達到4.18條。

由方差分析得出，基本培養(yǎng)基的P值=0.008<0.01，IBA的P值=0.024<0.05，NAA的P值=0.250>0.05，基本培養(yǎng)基和IBA對金邊朱砂根莖段生根率的影響顯著或極顯著，NAA對其影響不顯著。進一步用LSD法多重比較3種因素對金邊朱砂根繼代增殖的影響。不同基本培養(yǎng)基的多重比較表明，1/2 MS處理與3/4 MS處理差異顯著，1/2 MS處理與MS處理差異極顯著，3/4 MS處理與MS處理差異顯著?；九囵B(yǎng)基為1/2 MS、3/4 MS時生根率明顯高于MS，可以看出減少培養(yǎng)基的含鹽量有利于提高金邊朱砂根莖段的生根率。IBA不同濃度水平的多重比較表明，0.5 mg/L處理與10 mg/L處理差異顯著，1.0 mg/L處理與2.0 mg/L處理差異顯著，0.5 mg/L 處理與2.0 mg/L處理差異不顯著（表8）。IBA濃度為0.5、1.0 mg/L時均有利于提高金邊朱砂根莖段生根率，2.0 mg/L處理效果較差。正交試驗設計的極差R值決定各因素對金邊朱砂根生根率的影響程度依次為A>B>C，即基本培養(yǎng)基>IBA>NAA，最佳的組合為A1B2C2。朱砂根金邊組織培養(yǎng)發(fā)育過程見圖2。

3討論與結(jié)論

3.1討論

不同植物所需的滅菌劑和處理時間存在差異，滅菌方式的選擇與植物的表皮結(jié)構和選取部位的木質(zhì)化程度有關。植物的表皮帶絨毛或者木質(zhì)化程度越高，所需的滅菌劑滅菌時間就越久。但如果處理時間過長，滅菌劑會很難去除，殘留的滅菌劑會毒害植物，不利于其生長。所以，選擇合適的滅菌劑和處理時間是外植體組培快繁體系建立的第1步[3]。

表明，選用0.1% HgCl2作為滅菌劑比具有強氧化性的2% NaClO消毒后培養(yǎng)的外植體死亡率更低，對外植體的傷害更小。消毒時間為8 min時外植體的污染率和死亡率均較低，所以選用0.1% HgCl2消毒8 min的滅菌方式。

馬明東等在研究植物生長調(diào)節(jié)劑對朱砂根外植體初代培養(yǎng)的影響試驗中，分析得出植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA兩者濃度比值在10以內(nèi)時萌芽率較高，可達80.00%以上[4]。其中培養(yǎng)基配方MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA對芽的誘導率顯著高于其他處理，是腋芽誘導的最佳培養(yǎng)基，與孔祥海等的研究結(jié)果[5]一致。但在本研究中，最佳的芽誘導初代培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA，啟動率達73.33%。很多研究表明，即使是同種植物的不同品種在組織培養(yǎng)過程中仍存在較大差異，這種差異主要體現(xiàn)在不同品種啟動培養(yǎng)的難易程度[6]、培養(yǎng)過程中所需要的生長調(diào)節(jié)劑濃度和基本培養(yǎng)基類型[7]，而且這種差異體現(xiàn)在啟動、增殖、生根培養(yǎng)的各個階段。金邊朱砂根對于6-BA、NAA的質(zhì)量濃度的要求明顯高于朱砂根原種，這也證明了上述差異。很多木本植物使用WPM基本培養(yǎng)基的效果好于MS，而對于金邊朱砂根MS基本培養(yǎng)基啟動生長的效果明顯優(yōu)于WPM。本研究中，最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+02 mg/L NAA+0.1 mg/L TDZ，增殖系數(shù)為4.27。TDZ是一種具有細胞分裂素活性的取代脲類化合物，具有促進植物芽的誘導與增殖功能。在本研究中，加入低濃度的TDZ對于金邊朱砂根的繼代增殖有顯著的促進作用，是金邊朱砂根繼代增殖的主導因素，與孫曉敏等在光皮樺組織培養(yǎng)離體再生方面的研究結(jié)果[8]一致。1/2 MS培養(yǎng)基的大量元素含量為MS的1/2，本研究中生根培養(yǎng)階段結(jié)果表明，1/2 MS更有利于金邊朱砂根的生根，而高鹽的MS最不利于其生根，此結(jié)論與眾多試驗中植物生根培養(yǎng)時低鹽的培養(yǎng)基生根效果更好的結(jié)論一致。植物生長素的組合對生根有促進作用[9]，在IBA 濃度相同時，增加NAA的濃度到1.0 mg/L對金邊朱砂根的生根率也有促進作用。金邊朱砂根最佳的生根培養(yǎng)基為 1/2 MS+1.0 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA，此組合下生根率達到71.11%，平均生根數(shù)為 4.18 條，整體生根效果最好。

3.2結(jié)論

最佳金邊朱砂根的滅菌方式為0.1% HgCl2消毒8 min；最佳的初代培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，啟動率為73.33%，達到啟動培養(yǎng)的要求；最佳的繼代增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L TDZ，增殖系數(shù)為4.27；最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+10 mg/L IBA+1.0 mg/L NAA，生根率為71.11%，且根系粗壯。

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