野生櫻桃李清除DPPH自由基能力及抑制α—葡萄糖苷酶活性

劉偉+臘萍+楊如箴+張莉+歐陽艷

摘要：采用超聲輔助提取不同月份野生櫻桃李葉，系統(tǒng)溶劑萃取其醇提物得到環(huán)己烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，分別測定其總黃酮含量，通過清除DPPH自由基和α-葡萄糖苷酶抑制活性評價野生櫻桃李葉不同提取物的抗氧化活性及體外降血糖活性。結(jié)果表明，野生櫻桃李葉各提取物均有不同程度的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中以總黃酮含量較高的7、10月葉乙酸乙酯部位（129.48、102.19 mg/g）效果最佳，其對DPPH清除活性（IC50=0.05、0.30 mg/mL）遠(yuǎn)強(qiáng)于陽性對照BHA（IC50=0.99 mg/mL），α-葡萄糖苷酶抑制活性（IC50=114.44、20336 μg/mL）高于陽性對照阿卡波糖（IC50=1 047.32 μg/mL）。說明野生櫻桃李葉乙酸乙酯部位具有開發(fā)治療糖尿病降血糖藥物的價值。

關(guān)鍵詞：野生櫻桃李葉；總黃酮；抗氧化；DPPH自由基；α-葡萄糖苷酶活性；降血糖；清除活性

中圖分類號： R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0183-03

糖尿?。╠iabetes mellitus）是一種以胰島素分泌絕對不足（Ⅰ型）或相對不足（Ⅱ型，胰島素抵抗）而引起的以高血糖為主，伴有眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)系統(tǒng)的慢性損害等并發(fā)癥為特征的內(nèi)分泌代謝性疾病[1]。目前，在全球疾病對人類危害的排行榜中，糖尿病躍居第3位，已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。Yang等研究表明，我國糖尿病早期表現(xiàn)出更嚴(yán)重的胰島β細(xì)胞功能障礙，治療的關(guān)鍵是維持胰島β細(xì)胞功能和控制餐后血糖濃度[2]。α-葡萄糖苷酶是存在于小腸絨毛膜刷狀緣上的催化淀粉、蔗糖和麥芽糖水解為葡萄糖和果糖的一組酶系，對調(diào)節(jié)體內(nèi)碳水化合物的代謝具有重要的作用。其抑制劑可競爭性抑制酶的活性，從而減緩淀粉和蔗糖等向葡萄糖轉(zhuǎn)化，進(jìn)而控制餐后血糖水平[3]。此外，氧化應(yīng)激與糖尿病及其并發(fā)癥密切相關(guān)，應(yīng)用抗氧化治療可逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激對組織的損傷，從而阻止或延緩糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。因此，開發(fā)具有清除自由基和控制餐后血糖的功能保健食品對我國Ⅱ型糖尿病的防治有重要的意義。

野生櫻桃李（Prunus divaricata Ldb.）別稱野酸梅，薔薇科李屬，落枝灌木或小喬木。植株高1.5～8.0 m，多分枝，枝條細(xì)長，深綠色，主要分布于中亞天山、高加索、小亞細(xì)亞及巴爾干半島，在我國僅分布于新疆霍城縣的大西溝和小西溝[6-7]。有文獻(xiàn)報道，野生櫻桃李果實營養(yǎng)成分種類齊全，氨基酸豐富，多酚和礦物質(zhì)含量較高，是難得的天然保健食品[6-8]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，野生櫻桃李葉含有豐富的多酚和黃酮類化合物，并具有較好的抗氧化活性[9-10]，但鮮見對野生櫻桃李抑制α-葡萄糖苷酶活性的報道。本研究采用體外α-葡萄糖苷酶抑制模型，對不同月份野生櫻桃李葉的醇提物和萃取物進(jìn)行活性初篩，以期發(fā)現(xiàn)基于抑制α-葡萄糖苷酶活性的降血糖活性成分，為野生櫻桃李的利用與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

材料與試劑：野生櫻桃李葉分別于7、10月采自霍城縣大西溝，經(jīng)伊犁師范學(xué)院資源與生態(tài)研究所趙玉副教授鑒定為薔薇科野生櫻桃李葉，洗凈、晾干后60 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎過60目篩備用，樹葉標(biāo)本存放于伊犁師范學(xué)院資源與生態(tài)研究所。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、氯化鋁、醋酸、醋酸鈉、甲醇，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH（長城生物化學(xué)工程有限公司）；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院（批號100080-201408）；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖，購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。

儀器：SpectraMax M2多功能讀板機(jī)[美谷分子儀器（上海）有限公司]；UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津分析儀器廠）；XH-2008D智能溫控低溫超聲波催化合成儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；DD-5M型低速離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；FA2104電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；BAO-150AG型電熱恒溫干燥箱（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2試驗方法

1.2.1野生櫻桃李葉提取物及萃取物制備參照文獻(xiàn)[9]的方法，精確稱取10.000 0 g備用7月野生櫻桃李葉2份，分別裝入500 mL三頸燒瓶內(nèi)，按料液比1 ∶30（g ∶mL）加入60%乙醇溶液，在300 W功率下70 ℃超聲提取30 min，提取2次，合并提取液，4 000 r/min離心10 min，所得上清液1份減壓濃縮干燥后得7月葉提取物（Jul E）1.605 8 g；1份減壓濃縮至無醇味，將所得浸膏懸浮于200 mL蒸餾水中，依次用等體積的環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，回收溶劑后得7月葉環(huán)己烷部分（J-Cy E）0.082 2 g、乙酸乙酯部分（J-EA E）0.429 6 g、正丁醇部分（J-Bu E）0.515 3 g。按照上述方法制備10月葉提取物（Oct E）1.561 5 g及10月葉環(huán)己烷部分（O-Cy E）0.193 6 g、乙酸乙酯部分（O-EA E）0.352 7 g、正丁醇部分（O-Bu E）0.524 9 g。

1.2.2總黃酮含量測定參考文獻(xiàn)[11]的方法，采用氯化鋁法分別測定野生櫻桃李葉不同提取物及萃取物總黃酮含量。精確移取備用蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別加入盛有5.0 mL 60%乙醇溶液的25 mL相同規(guī)格的容量瓶中，再加2.0 mL 0.1 mol/L氯化鋁溶液和1.0 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH值=5.5），60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15 min，于417 nm處測定吸光度。以蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得 y=27.462 0x+0.000 6，r2=0.995 9。結(jié)果表明，在濃度 0.02～0.06 mg/mL范圍內(nèi)2個變量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。準(zhǔn)確吸取1.0 mL配制的提取液，分別按照上述方法測定吸光度，并根據(jù)公式（1）計算總黃酮含量。endprint

Y=k×C×Vm。（1）

式中：Y為總黃酮含量，mg/g；k為待測液與測試液體積之比；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算所得濃度，mg/mL；V為測試液定容的體積，mL；m為稱取野生櫻桃李葉或萃取物質(zhì)量，g。

1.2.3清除DPPH自由基試驗參照文獻(xiàn)[12] 的方法并稍加修改：配制野生櫻桃李葉提取物及萃取物、陽性對照BHA待測液，逐級稀釋使用。將各供試樣品溶液分別移取20 μL于 10 mL 比色管中，另取0.6 mmol/L DPPH溶液1.0 mL加入各比色管中，無水乙醇定容至10 mL，搖勻，在避光條件下靜置30 min后，于517 nm波長處測定吸光度，考慮待測樣品自身吸光度的影響，配制未加DPPH溶液的對照組扣除其吸光度，每組樣品進(jìn)行3次平行試驗。DPPH清除率按公式（2）計算：

DPPH清除率=D0-（D1-D2）D0×100%。（2）

式中：D0為DPPH溶液定容后的吸光度；D1為不同濃度的樣品溶液添加DPPH溶液定容后的吸光度；D2為不同濃度的樣品溶液定容后的吸光度。

1.2.4α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定參照文獻(xiàn)[13]的方法稍作修改：96孔板中分別加入50 μL不同濃度的甲醇和0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值=6.8，精確稱取8.66 g K2HPO4、6.85 g KH2PO4溶解于超純水中，并定容至1 L）的被測試樣品，50 μL磷酸鹽緩沖液和40 μL 0.25 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，37 ℃恒溫孵育 10 min 后加入40 μL 5 mmol/L pNPG溶液，立即于405 nm波長處測定其吸光度（S0），反應(yīng)5 min后相同波長條件下測定其吸光度（S5），加入相同體積的甲醇磷酸鹽緩沖液為空白對照，阿卡波糖為陽性對照。按照公式（3）計算抑制率：

抑制率=[（C5-C0）-（S5-S0）]/（C5-C0）×100%。（3）

式中：C0為加入緩沖液代替樣品的空白對照0 min時的吸光度；C5為空白對照5 min時的吸光度；S0為加入測試樣品 0 min 時的吸光度；S5為加入測試樣品5 min時的吸光度。

1.2.5數(shù)據(jù)分析采用Origin 8.0作圖，Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并計算抑制率、清除率，根據(jù)抑制率和濃度采用FORECAST函數(shù)計算IC50。

2結(jié)果與分析

2.1野生櫻桃李葉提取物及萃取物總黃酮含量測定結(jié)果

黃酮類化合物是植物花、葉等器官中的重要次級代謝產(chǎn)物，在治療心血管病、抗病毒、抗腫瘤、保肝、抑菌、抗衰老等方面有廣泛的用途。由圖1可知，7月葉中總黃酮含量高于10月。有文獻(xiàn)報道，光照能夠強(qiáng)烈地影響植物的初生代謝、植物細(xì)胞生長及次生代謝產(chǎn)物積累[14]。由此推測，新疆伊犁地區(qū)7月日照時間較10月長，紫外線輻射強(qiáng)度大，影響了野生櫻桃李正常的生理活動，促使其局部組織或器官合成較多的黃酮類化合物，以利于自身的保護(hù)。7月野生櫻桃李葉不同萃取部位中J-EA E總黃酮含量最高，為（129.48±1.03）mg/g，其次為J-Bu E，J-Cy E總黃酮含量最低；10月野生櫻桃李葉不同萃取部位中O-EA E總黃酮含量最高，為（102.19±1.19）mg/g，O-Bu E略高于O-Cy E。表明野生櫻桃李葉萃取物中富含中等極性黃酮類化合物。

2.2野生櫻桃李葉不同提取物清除DPPH自由基活性

在多種快速評估抗氧化活性的方法中，清除DPPH自由基模型與其他方法相比使用更廣泛。由圖2可知，在測試質(zhì)量濃度內(nèi)，各提取物清除DPPH自由基活性呈現(xiàn)出濃度依賴性，且活性差異明顯。采用較為客觀的IC50值評價野生櫻桃李葉不同提取物及萃取物清除DPPH自由基活性。測試濃度為1.0 mg/mL時，7月不同提取物及萃取物清除DPPH活性順序為J-EA E>Jul E>J-Bu E>J-Cy E；10月不同提取物及萃取物清除DPPH活性順序為O-EA E>O-Cy E>O-Bu E>Oct E。其中J-EA E（IC50=0.05 mg/mL）對DPPH清除活性最強(qiáng)，遠(yuǎn)高于陽性對照BHA（IC50=0.99 mg/mL）；不同月份醇提物之間比較，Jul E（IC50=0.49 mg/mL）活性要高于Oct E（IC50=0.65 mg/mL）；7月各萃取部位活性均高于10月相應(yīng)萃取部位，但O-Cy E（IC50=0.44 mg/mL）活性遠(yuǎn)高于J-Cy E活性。結(jié)合圖1可知，不同提取物DPPH清除能力與其總黃酮含量存在密切關(guān)系。

2.3野生櫻桃李葉不同提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由表1可知，7月葉醇提物的抑制率明顯高于10月葉醇提物，但兩者的總黃酮含量沒有明顯差異，推測兩者所含黃酮種類或黃酮類化合物各組分的比例有差異。7月不同提取物及萃取物對 α-葡萄糖苷酶抑制率順序為J-EA E>J-Bu E>Jul E>J-Cy E，10月不同提取物及萃取物對α-葡萄糖苷酶抑制率順序為O-EA E>O-Bu E>O-Cy E>Oct E。其中J-EA E（IC50=114.44 μg/mL）和O-EA E（IC50=203.36 μg/mL）抑制率遠(yuǎn)高于陽性對照阿卡波糖（IC50=1 047.32 μg/mL）；J-Cy E（未測得其IC50）抑制活性最弱，遠(yuǎn)低于O-Cy E（IC50=592.67 μg/mL）。結(jié)合圖1可知，總黃酮含量較高的乙酸乙酯部位表現(xiàn)出更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

表1野生櫻桃李葉不同提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率

處理初篩濃度

（μg/mL）抑制率

（%）IC50

（μg/mL）Jul E2 00061.91±0.24838.47Oct E2 00051.62±0.651 599.60J-Cy E2 00032.62±1.84J-EA E2 00095.53±0.29114.44J-Bu E2 00063.22±0.43780.55O-Cy E2 00068.71±1.09592.67O-EA E2 00089.05±0.98203.36O-Bu E2 00069.78±1.28611.70BHA2 00067.25±1.431 047.32endprint

2.4各提取物質(zhì)量濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

由圖3可知，當(dāng)供試質(zhì)量濃度小于1.0 mg/mL時，各提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性與濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，即抑制率隨著質(zhì)量濃度的升高而逐漸增大，其中總黃酮含量較高的J-EA E和O-EA E抑制α-葡萄糖苷酶活性較好，在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，兩者對α-葡萄糖苷酶抑制率分別為92.58%、86.43%，遠(yuǎn)高于BHA的抑制活性（47.85%），此后兩者抑制率隨著濃度增大變化不明顯。

3結(jié)論與討論

本研究對野生櫻桃李葉不同月份醇提物和萃取物的體外抗氧化活性和降血糖活性進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，不同月份

野生櫻桃李葉醇提物總黃酮含量沒有明顯差異，但7月野生櫻桃李葉醇提物DPPH清除能力和抑制α-葡萄糖苷酶活性強(qiáng)于10月醇提物；不同月份萃取物均表現(xiàn)出不同程度的活性，其中總黃酮含量較高的乙酸乙酯部位具有強(qiáng)氧化活性的同時也表現(xiàn)出較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，說明乙酸乙酯萃取物具有開發(fā)治療糖尿病降血糖藥物的價值，黃酮類化合物與其活性之間存在密切關(guān)系。

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