45份菜用大黃的SRAP標(biāo)記引物篩選及親緣關(guān)系分析

邵珠田+姜立娜+郭小菲+蔡祖國+趙一鵬

摘要：以45份引種的菜用大黃遺傳背景未知為出發(fā)點(diǎn)，利用已報(bào)道的相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP）引物，對這些引種材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在闡明這些材料的親緣關(guān)系。結(jié)果表明：在選用的182對引物組合中有42對引物擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性較好，可以用作菜用大黃遺傳多樣性分析；利用42對引物對45份材料擴(kuò)增后共獲得230個(gè)等位基因位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)202個(gè)，平均多態(tài)性位點(diǎn)比例達(dá)到878%。基于非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA）的聚類分析結(jié)果表明：45份菜用大黃材料聚為7類，雖然來源地相同的大部分種群可以聚在同一個(gè)類群內(nèi)，但種群間存在遺傳交叉現(xiàn)象，揭示了種群間的親緣關(guān)系，為這些引入材料的進(jìn)一步利用提供了參考。

關(guān)鍵詞：菜用大黃；SRAP分子標(biāo)記；引物篩選；親緣關(guān)系

中圖分類號： S644.903文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0039-03

通信作者：趙一鵬，博士，教授，主要從事園藝植物種質(zhì)資源與育種研究。E-mail：yzhao36@163.com。菜用大黃（Rheum rhaponticum L.）別稱食用大黃、圓葉大黃、酸菜等，為蓼科（Polygonaceae）大黃屬（Rheum）中以葉柄為蔬菜的栽培種，英文統(tǒng)稱為Rhubarb。菜用大黃屬于多年生草本植物，其葉柄具有粗大多汁、營養(yǎng)豐富、氣味清新芬芳、風(fēng)味獨(dú)特、口感微酸等特點(diǎn)，是理想的芳香保健類蔬菜。在國外，菜用大黃被廣泛用于制作餡餅、果醬、果凍、面包、蛋糕、沙拉、大黃果酒等各類甜品及加工成高級果蔬汁飲料[1-4]。

目前，國內(nèi)對大黃屬植物的研究和開發(fā)利用僅限于藥用大黃相關(guān)資源，對菜用大黃的系統(tǒng)研究較少。2004年以來，河南科技學(xué)院菜用大黃引種及種質(zhì)資源利用課題組趙一鵬博士在與國外合作的基礎(chǔ)上，首次開展了菜用大黃優(yōu)良種質(zhì)資源的引種、組織培養(yǎng)技術(shù)[3-6]、栽培學(xué)特性及營養(yǎng)成分分析[7]、根尖染色體觀察及核型分析[8]等研究，但關(guān)于菜用大黃起源、資源親緣關(guān)系的研究尚未開展。本研究在進(jìn)行了相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP）體系優(yōu)化的基礎(chǔ)上[9]，利用多態(tài)性高的42對引物組合對從國內(nèi)外收集到的45份菜用大黃材料進(jìn)行親緣關(guān)系分析，旨在了解這些菜用大黃材料的遺傳背景，為今后菜用大黃優(yōu)良品種選育和分子生物學(xué)研究提供一定的技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1 材料

用于引物篩選的菜用大黃材料為樣本4號，種子來源于美國。用于親緣關(guān)系分析的45份材料，采自河南科技學(xué)院菜用大黃資源圃，其中從美國引種材料13份，分別編號為1～13；從英國引種材料20份，分別編號為14～28、41～45；從北京引種材料12份，分別編號為29～40。于2016年4月上旬采集新鮮、無病蟲害的葉片，用清水沖洗干凈，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1模板DNA的提取及質(zhì)量檢測基因組DNA提取參照Liu等改良十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[10]，用Eppendorf核酸蛋白測定儀（德國）檢測所提DNA的純度及濃度，并用無菌ddH2O稀釋至10 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SRAP-PCR引物的篩選SRAP-PCR擴(kuò)增程序參照陳萬勝等的方法[11]，即94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，35 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物于4 ℃保存?zhèn)溆谩２擞么簏SSRAP-PCR反應(yīng)體系為筆者所在課題組郭小菲等已優(yōu)化的體系[9]，即25μL體系中包含2.50 μL 10×PCR Buffer、30 ng模板DNA、2.50 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、0.04 U/μL Taq DNA聚合酶，各0.50 μmol/L上下游引物，剩余體積用雙蒸水補(bǔ)足。以上試劑均購自TaKaRa公司。引物序列參考Li等的報(bào)道[12-15]，共選用14條正向引物、13條反向引物（表1），可組合成182對引物。利用4號材料對上述引物進(jìn)行篩選。依據(jù)電泳結(jié)果，選擇擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性豐富、條帶清晰、重復(fù)性好的引物組合進(jìn)行菜用大黃的親緣關(guān)系研究。

1.2.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，在產(chǎn)物中加入5 μL 6×Loading Buffer，混勻，取2.5 μL混合液上樣于6%非變性聚丙烯酰胺凝膠中。預(yù)電泳電壓90 V，時(shí)間 30 min；電泳電壓120 V，時(shí)間3 h。電泳結(jié)束后的膠板采用袁菊紅等的銀染法[16]進(jìn)行染色。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析根據(jù)電泳結(jié)果，在凝膠相同遷移位置上，擴(kuò)增有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，最終組成1個(gè)由45份材料和所有擴(kuò)增位點(diǎn)等位基因組成的“1，0”矩陣。利用NTsys-pc Version 2.10e 軟件，采用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA）

2結(jié)果與分析

2.1SRAP-PCR引物的篩選及擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

從182對引物中共篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物重復(fù)性好、多態(tài)性高和條帶清晰的引物組合42對，圖1為部分引物篩選擴(kuò)增結(jié)果。應(yīng)用篩選的42對多態(tài)性引物組合對45份材料模板DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果共獲得230個(gè)等位基因位點(diǎn)，其中202個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)。每個(gè)引物組合的多態(tài)性比率在16.7%～1000%之間，平均多態(tài)性比例達(dá)到87.8%；平均每對引物擴(kuò)增條帶數(shù)5.5個(gè)，平均多態(tài)性條帶數(shù)4.8個(gè)；在42對引物中，引物組合E1-M4擴(kuò)增條帶數(shù)最多，共11個(gè)，E12-M4組合擴(kuò)增條帶數(shù)最少，只有1個(gè)（表2）。引物組合E1-M4的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

2.2菜用大黃遺傳相似性與聚類分析

45份樣品經(jīng)NTSYS軟件聚類分析結(jié)果顯示，在遺傳相似系數(shù)0.68處可將45份樣品聚為7類，第1類是34號、35號，種子來源于北京；第2類是25號、26號、27號、28號，種子來源于英國；第3類為36號、37號，種子同樣來源于北京；第4類有13號、15號、38號、39號、40號、42號6個(gè)樣品；第5類為2號、3號、4號、8號、10號、11號、12號和24號共8個(gè)樣品，除24號來源于英國外，其余均引種于美國；1號單獨(dú)聚為1類，引種地為美國，其余22個(gè)樣品聚為一大類；45份樣品間的遺傳相似系數(shù)在0.514 9～0.811 9之間，遺傳距離在0.117 1～0.703 0之間（圖3）。

3討論

形態(tài)標(biāo)記是植物分類學(xué)上最古老、最簡便易行的方法，但是由于數(shù)量性狀的遺傳機(jī)制復(fù)雜、遺傳力低、容易受到環(huán)境因素的影響、工作量大等因素，該方法不能完全滿足親緣關(guān)系研究的需要。SRAP標(biāo)記是一種基于PCR的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，具有操作簡單、引物通用性與多態(tài)性高、重復(fù)性好、標(biāo)記位點(diǎn)在基因組中分布均勻等優(yōu)點(diǎn)[18]。近年來利用SRAP標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行品種鑒定，分析種質(zhì)間的遺傳多樣性、品種間的親緣關(guān)系等已經(jīng)有了較多報(bào)道[19-21]。但在關(guān)于大黃屬植物的研究中， 僅見陳大霞等利用SRAP標(biāo)記對正品大黃的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析，其研究結(jié)果表明，3種正品大黃間的SRAP的多態(tài)性比例為73.2%[22]。而本研究中菜用大黃多態(tài)性比例為87.8%，多態(tài)性相對較高，筆者認(rèn)為與本研究的供試材料來源地有關(guān)，因?yàn)?5份菜用大黃材料來源于北京、美國、英國等不同地區(qū)，遺傳基礎(chǔ)相差較遠(yuǎn)，導(dǎo)致變異位點(diǎn)較多。從本試驗(yàn)結(jié)果來看，SRAP分子標(biāo)記可以成為一種評價(jià)種質(zhì)資源親緣關(guān)系的新技術(shù)。

運(yùn)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對45份菜用大黃材料進(jìn)行親緣關(guān)系研究，從遺傳相似系數(shù)和聚類樹狀圖來看，個(gè)體間存在較大的差異。在遺傳相似系數(shù)0.68處可將供試的45份菜用大黃樣品聚為7類，第1類是34號、35號，種子來源于北京，結(jié)果期種子均呈現(xiàn)黃綠色，葉柄表面有短毛、粗糙且斑點(diǎn)密布；第2類是25號、26號、27號、28號，種子來源于英國，葉柄基部均呈現(xiàn)深粉色，表面較為光滑；第3類為36號、37號，引種于北京，結(jié)果期種子翅緣均呈現(xiàn)粉紅色。雖然來源地相同的大部分樣品可以聚在同一個(gè)類群內(nèi)，但仍出現(xiàn)了交叉聚類現(xiàn)象。24號種子來源于英國，卻與來源于美國的2號、3號、4號、8號、10號、11號、12號種子聚在了第5類；13號、15號種子又與來源于北京的38號、39號、40號種子聚在了第4類。出現(xiàn)這種情況的原因可能是由于長期的選擇進(jìn)化及不斷的相互引種，導(dǎo)致各生態(tài)地理群之間種質(zhì)的相互滲透。本研究通過SRAP標(biāo)記技術(shù)對收集到的45份國內(nèi)外菜用大黃材料進(jìn)行了初步的親緣關(guān)系分析，為今后進(jìn)行菜用大黃遺傳育種和品種鑒定提供了一定的技術(shù)支持。

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