左卡尼汀對(duì)膿毒癥線粒體靶向治療作用研究

李力　汪峰

【摘要】 目的：觀察左卡尼汀能否作為代謝復(fù)蘇藥物改善膿毒癥患者線粒體功能，并觀察其治療效果。方法：選取2014年2月-2017年2月本院就診的膿毒癥患者86例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為常規(guī)治療組（對(duì)照組）和左卡尼汀組（治療組），每組43例，觀察兩組治療前后血小板線粒體功能、乳酸清除率、SOFA評(píng)分、呼吸機(jī)輔助時(shí)間、ICU住院時(shí)間及短期（28 d）病死率。結(jié)果：治療組治療后血小板粒體跨膜電位和線粒體內(nèi)ATP含量均優(yōu)于治療前且優(yōu)于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組治療后SOFA評(píng)分均下降，治療組乳酸清除率高于對(duì)照組，SOFA評(píng)分低于對(duì)照組，呼吸機(jī)輔助時(shí)間、ICU住院時(shí)間明顯縮短，短期病死率均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：左卡尼汀通過改善線粒體功能，可以增加膿毒癥患者乳酸清除率，提高組織器官能量供應(yīng)，阻止器官衰竭，縮短呼吸機(jī)輔助時(shí)間及ICU住院時(shí)間，降低患者短期（28 d）死亡率。

【關(guān)鍵詞】 膿毒癥； 線粒體； 左卡尼??； 代謝復(fù)蘇

Effect Study of L-carnitine for Sepsis Mitochondrial Targeting Therapeutic/LI Li，WANG Feng.//Medical Innovation of China，2017，14（26）：021-024

【Abstract】 Objective：To observe whether L-carnitine can improve the mitochondrial function of sepsis as a metabolic resuscitation drug and its therapeutic effect.Method：From February 2014 to February 2017，86 patients with sepsis treated in our hospital were selected and divided into routine treatment group（the control group） and L-carnitine group（the treatment group） according to the random number table method，43 patients in each group.The platelet mitochondrial function，lactate clearance and SOFA scores before and after treatment，ventilator-assisted time，ICU hospitalization time and short-term（28 d） mortality of two groups were observed.Result：The levels of mitochondrial transmembrane potential and mitochondrial ATP content of the treatment group were improved compared with those before treatment and the control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.SOFA levels of two groups were decreased，and SOFA levels of the treatment group were lower than that of the control group，the duration of ventilator assisted，ICU hospitalization time and short-term mortality of the treatment group were were lower than those of the control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：L-carnitine can increase the lactic acid clearance rate for sepsis patients by improving the mitochondrial function，which can increase energy supply of tissues and organs，also can prevent organ failure，shorten the ventilator-assist time and ICU hospitalization time，reduce the short-term （28 d） mortality.

【Key words】 Sepsis； Mitochondrial； L-carnitine； Metabolic recovery

First-authors address：Jiujiang University Affiliated Hospital，Jiujiang 332000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.26.006

膿毒癥導(dǎo)致器官功能衰竭的發(fā)病機(jī)制尚不明確。有研究認(rèn)為，感染所引起的全身炎癥反應(yīng)可抑制線粒體功能，以至于組織器官?zèng)]有足夠的能量來維持正常的功能，機(jī)體處于低代謝狀態(tài)甚至器官衰竭。在最近的臨床和實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)膿毒癥線粒體靶向治療已明顯降低多器官功能障礙（Multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的嚴(yán)重程度和死亡率，這種干預(yù)被命名為“代謝復(fù)蘇”[1]。左卡尼汀對(duì)穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)、膜的通透性及維持正常的線粒體功能有重要作用[2-3]。從人體臟器獲取線粒體很難實(shí)現(xiàn)，但是循環(huán)血液中的血小板線粒體含量豐富，甚至在危重患者中很容易獲得，并且血小板線粒體功能可以用不同技術(shù)方法進(jìn)行檢測(cè)，也可作為線粒體靶向治療藥物效果的評(píng)估[4]。本研究觀察左卡尼汀能否作為代謝復(fù)蘇藥物改善膿毒癥患者的預(yù)后，現(xiàn)報(bào)道如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年2月-2017年2月本院ICU住院的膿毒癥患者86例，其中男47例，女39例，年齡27～76歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合2014年《中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南》關(guān)于膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，ICU住院時(shí)間>7 d[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往有器官功能嚴(yán)重不足或免疫力低下患者（參照APACHEII評(píng)分中的慢性健康評(píng)分）；（2）用藥劑量不足或療程不足7 d、檢測(cè)指標(biāo)不全者；（3）對(duì)治療藥物明確過敏者；（4）近2周用過影響血小板的藥物，如阿司匹林、血寧片等。將其按照隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組和對(duì)照組，每組43例，兩組患者一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 方法 對(duì)照組參考《中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南》采取常規(guī)集束化治療方案[6]（即6 h復(fù)蘇集束化治療，是指在疑診或確診嚴(yán)重感染后立即開始并在6 h內(nèi)完成的治療措施。包括血乳酸水平測(cè)定，使用抗生素前留取病原學(xué)標(biāo)本，急診在接診3 h內(nèi)、ICU在收治1 h內(nèi)開始使用廣譜抗生素。如有低血壓或血乳酸水平>4 mmol/L，應(yīng)立即給予液體復(fù)蘇（20～40 mL/kg）；適當(dāng)?shù)囊后w復(fù)蘇后低血壓仍不能糾正者，應(yīng)加用血管活性藥物，以維持平均動(dòng)脈壓≥65 mm Hg，CVP≥8 mm Hg，ScvO2≥70%）。治療組在常規(guī)集束化治療方案基礎(chǔ)上，加用左卡尼汀注射液（常州蘭陵制藥有限公司生產(chǎn)）4 g靜滴，1次/d，持續(xù)7 d。

1.3 樣本處理 為減少血小板線粒體激活，本研究采用Percoll密度梯度離心法分離純化血小板。將兩組患者分別于入院時(shí)及入院3、7 d用真空采血管綠頭管（肝素鈉）2支抽取新鮮靜脈血8 mL。將9份Percoll原液加入1份2.5M蔗糖溶液混勻配置等滲Percoll溶液，再用0.25 M蔗糖溶液稀釋等滲Percoll溶液至濃度1.06 g/mL，然后取肝素抗凝靜脈血與等量Percoll溶液充分混合，（常溫，1000次/min×20 min）取F1白色云霧層，PBS緩沖液洗滌3遍即得到分離純化的血小板備用。

1.4 觀察指標(biāo) （1）血小板線粒體跨膜電位檢測(cè)：JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位（mitochondrial transmembrane potential，ΔΨm）的理想熒光探針。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變檢測(cè)細(xì)胞膜電位的下降。以JC-1孵育血小板15 min后，PBS緩沖液洗滌，采用流式細(xì)胞儀（BD FACS CotoⅡTM）進(jìn)行定量檢測(cè)，線粒體去極化的比例由綠熒光的百分比來衡量。（2）血小板線粒體內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）含量檢測(cè)：以熒光素-熒光素酶法檢測(cè)血小板線粒體ATP水平，原理：熒光素在熒光素酶、ATP等物質(zhì)參與下，進(jìn)行反應(yīng)發(fā)出熒光；用分光光度計(jì)可測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度；當(dāng)熒光素和熒光素酶都足量時(shí)，在一定范圍內(nèi)，ATP的含量與發(fā)光強(qiáng)度成正比。血小板懸液與檢測(cè)試劑等比混合，室溫孵育15 min，采用寶特800酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。（3）乳酸清除率：所有患者檢測(cè)入院時(shí)及入院6、12、24 h動(dòng)脈血?dú)庥涗浫樗嶂?，并?jì)算6、12、24 h乳酸清除率。（4）SOFA評(píng)分：所有患者在入院時(shí)及入院3、7 d抽取靜脈血檢測(cè)血常規(guī)、生化檢查、記錄24 h尿量及動(dòng)脈血?dú)庥?jì)算PaO2/FiO2值、GCS評(píng)分等計(jì)算SOFA評(píng)分。（5）臨床觀察指標(biāo)：觀察兩組左卡尼汀治療對(duì)呼吸機(jī)輔助時(shí)間、ICU住院時(shí)間及短期（28 d）病死率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血小板線粒體膜電位變化 兩組治療前低ΔΨm細(xì)胞百分比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），入院7 d兩組患者低ΔΨm細(xì)胞百分比均低于治療前，入院3、7 d治療組患者低ΔΨm細(xì)胞百分比均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.2 兩組血小板線粒體內(nèi)ATP水平的變化 兩組治療前血小板內(nèi)ATP相對(duì)含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），入院3、7 d治療組患者血小板內(nèi)ATP水平均高于治療前且高于對(duì)照組同期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.3 兩組乳酸清除率比較 兩組患者在入院時(shí)乳酸值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療組入院6、12、24 h的乳酸值均低于對(duì)照組，治療組乳酸清除率高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

2.4 兩組SOFA評(píng)分比較 兩組患者入院時(shí)SOFA評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），治療組入院3、7 d SOFA評(píng)分均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表5。

2.5 兩組呼吸機(jī)輔助時(shí)間、ICU住院時(shí)間、短期（28 d）病死率比較 治療組呼吸機(jī)輔助時(shí)間、ICU住院時(shí)間、短期病死率均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表6。

3 討論

膿毒癥是宿主對(duì)感染的反應(yīng)失控導(dǎo)致危及生命的器官功能衰竭[7]。其主要特征是線粒體功能障礙[8]，而線粒體功能降低在器官功能障礙的發(fā)生、發(fā)展及功能恢復(fù)中起關(guān)鍵性作用[9-10]。在膿毒癥早期在脂多糖作用下細(xì)胞內(nèi)脂?；D(zhuǎn)移酶去乙?；黾?，線粒體功能及完整性遭到破壞，并且出現(xiàn)線粒體自噬現(xiàn)象[11-12]。隨著膿毒癥病情的進(jìn)展，線粒體功能及數(shù)量均下降，組織器官為了適應(yīng)線粒體能量供應(yīng)，只能降低或關(guān)閉細(xì)胞功能來減少能量需求，從而達(dá)到能量供需平衡即MODS[13]。如果膿毒癥不能得到有效控制，病情持續(xù)時(shí)間過長，線粒體結(jié)構(gòu)和功能將呈現(xiàn)不可逆性的改變，最終導(dǎo)致線粒體功能衰竭，細(xì)胞能量枯竭，引起多器官功能衰竭而死亡[14]。endprint

左卡尼汀即左旋肉堿是脂肪代謝過程中的一種關(guān)鍵物質(zhì)，能作為載體把脂肪酸從線粒體外運(yùn)入線粒體內(nèi)，使其氧化分解。左卡尼汀用于感染性休克患者是安全有效的，能明顯降低短期（28 d）死亡率，并能提高低酮體類膿毒癥患者遠(yuǎn)期（1年）生存率[15-16]。其機(jī)制可能是左卡尼汀通過乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶的活動(dòng)，參與在脂酰肉堿和脂酰-CoA酯之間平衡的建立，能有效維持線粒體功能[17]；并且能改善受損線粒體超微結(jié)構(gòu)、維持線粒體長度、減少線粒體損傷的數(shù)量，從而阻止細(xì)胞凋亡[2]；左卡尼汀對(duì)于線粒體功能損傷的保護(hù)也有抗氧化和抗炎的機(jī)制參與[18-19]。在代謝應(yīng)激時(shí)，線粒體積累脂酰-CoA，是為了保持機(jī)體卡尼汀穩(wěn)態(tài)[20]。足夠量的游離卡尼汀可促使堆積的脂酰-CoA進(jìn)入線粒體內(nèi)，使氧化磷酸化得以順利進(jìn)行，從而提高組織細(xì)胞能量供應(yīng)，阻止器官功能衰竭[21]。

筆者通過對(duì)在醫(yī)院ICU住院的86例膿毒血癥患者研究顯示，加用左卡尼汀治療3 d即出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ATP水平較對(duì)照組高，且高于入院時(shí)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而低ΔΨm細(xì)胞百分比及SOFA評(píng)分均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明早期加用左卡尼汀能減少線粒體氧化應(yīng)激損害、維持線粒體功能作用。從乳酸清除率也提示早期加用左卡尼汀對(duì)預(yù)后有積極作用。加用左卡尼汀治療7 d細(xì)胞內(nèi)ATP水平高于對(duì)照組，且高于入院時(shí)，低ΔΨm細(xì)胞百分比及SOFA評(píng)分低于對(duì)照組，且低于入院時(shí)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明左卡尼汀改善受損線粒體結(jié)構(gòu)和功能，提高組織器官能量供應(yīng)，阻止器官衰竭，對(duì)膿毒癥患者的治療有積極作用。

本研究結(jié)果顯示，加用左卡尼汀治療后患者呼吸機(jī)輔助時(shí)間明顯縮短、在ICU住院時(shí)間也明顯減少，并且降低短期（28 d）病死率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這不僅提高了膿毒癥患者的生存率，還大大節(jié)省了醫(yī)療費(fèi)用支出。

綜上所述，左卡尼汀注射液可能是通過改善線粒體膜電位，恢復(fù)線粒體氧化磷酸化功能，提高組織細(xì)胞能量供應(yīng)，有效增加膿毒癥患者乳酸清除率，提高組織器官能量供應(yīng)，阻止器官衰竭，縮短呼吸機(jī)輔助時(shí)間及ICU住院時(shí)間，降低患者短期（28 d）死亡率。左卡尼汀對(duì)膿毒癥治療效果明顯，可作為代謝復(fù)蘇藥物用于集束化治療。

參考文獻(xiàn)

[1] Leite H P，de Lima L F.Metabolic resuscitation in sepsis： a necessary step beyond the hemodynamic[J].J Thorac Dis，2016，8（7）：552-557.

[2] Li X，Zhang C，Zhang X，et al.An acetyl-L-carnitine switch on mitochondrial dysfunction and rescue in the metabolomics study on aluminum oxide nanoparticles[J].Part Fibre Toxicol，2015，13（1）：4-23.

[3] Zhang Z Y，F(xiàn)an Z K，Cao Y，et al.Acetyl-L-carnitine ameliorates mitochondrial damage and apoptosis following spinal cord injury in rats[J].Neurosci Lett，2015，604（14）：18-23.

[4] Protti A，F(xiàn)ortunato F，Artoni A，et al.Platelet mitochondrial dysfunction in critically ill patients：comparison between sepsis and cardiogenic shock[J].Crit Care，2015，19（1）：39.

[5]中華醫(yī)學(xué)會(huì)重癥醫(yī)學(xué)分會(huì).中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南（2014）[J].Chin Crit Care Med，2015，6（27）：401-426.

[6]王海彥，廖品琥.膿毒癥集束化治療的臨床研究進(jìn)展[J].天津醫(yī)藥，2013，4（41）：392-395.

[7] Singer M，Deutschman C S，Seymour C W，et al.The Third International Consensus Defi-nitions for Sepsis and Septic Shock （Sepsis-3）[J].JAMA，2016，315（8）：801-810.

[8] Fink M P.Cytopathic hypoxia and sepsis：is mitochondrial dysfunction pathophysiologically important or just an epiphenomenon[J].Pediatr Crit Care Med，2015，16（1）：89-91.

[9] Arulkumaran N，Deutschman C S，Pinsky M R，et al.Mitochondrial function in sepsis[J].Shock，2016，45（3）：271-281.

[10] Singer M.The role of mitochondrial dysfunction in sepsis-induced multi-organ failure[J].Virulence，2014，5（1）：66-72.

[11] Zhao P，Gao J，Jiang J，et al.Myocardial cells and mitochondrial autophagy in sepsis mice induced by lipopolysaccharide[J].Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology，2016，32（2）：177-181.endprint

[12] Zou C，Synan M J，Li J，et al.LPS impairs oxygen utilization in epithelia by triggering degradation of the mitochondrial enzyme Alcatl[J].J Cell Sci，2016，129（1）：51-64.

[13] Duran-Bedolla J，Montes de Oca-Sandoval M A，Salda?a-Navor V，et al.Sepsis，mitochondrial failure and multiple organ dysfunction[J].Clin Invest Med，2014，37（2）：58-69.

[14] Lee I，Hüttemann M.Energy crisis：the role of oxidative phosphorylation in acute inflammation and sepsis[J].Biochim Biophys Acta，2014，1842（9）：1579-1586.

[15] Puskarich M A，Kline J A，Krabill V，et al.Preliminary safety and efficacy of L-carnitine infusion for the treatment of vasopressor-dependent septic shock： a randomized control trial[J].JPEN J Parenter Enteral Nutr，2014，38（6）：736-743.

[16] Puskarich M A，F(xiàn)inkel M A，Karnovsky A，et al.

Pharmacometabolomics of l-Carnitine Treatment Response Phenotypes in Patients with Septic Shock[J].Ann Am Thorac Soc，2015，12（1）：46-56.

[17] Tonazzi A，Giangregorio N，Console L，et al.Mitochondrial carnitine/acy-lcarnitine transloase：insights in structure/function relationship[J].Mini Reviews in Medicinal Chemistry，2015，15（5）：396-405.

[18] Le Borgne F，Ravaut G，Bernard A，et al.L-carnitine protects C2C12 cells against mitochondrial superoxide overproduction and cell death[J].World Journal of Biological Chemistry，2017，8（1）：86-94.

[19] Khalatbari-Soltani S，Tabibi H.Inflammation and L-carnitine therapy in hemodialysis patients：a review[J].Clinical and Experimental Nephrology，2015，19（3）：331-335.

[20] Marcovina S M，Sirtori C，Peracino A，et al.Translating the basic knowledge of mitochondrial functions to metabolic therapy：role of L-carnitine[J].Transl Res，2013，161（2）：73-84.

[21] Longo N，F(xiàn)rigeni M，Pasquali M.Carnitine transport and fatty acid oxidation[J].Biochimica Et Biophysica Acta，2016，1863（10）：2422-2435.

（收稿日期：2017-05-22） （本文編輯：康玥）endprint