MMP—2、P53蛋白在大鼠實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用研究

單宏寬　劉剛　徐法東

【摘要】 目的：建立大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）動(dòng)物模型，檢測(cè)腦組織中MMP-2及P53蛋白的表達(dá)水平及腦組織細(xì)胞凋亡情況，探討MMP-2和P53蛋白在蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷中的作用機(jī)制。方法：72只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組又分為出血后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d共5個(gè)時(shí)相組，每個(gè)時(shí)相組各12只大鼠。各組標(biāo)本分別檢測(cè)MMP-2及P53蛋白在海馬CA1區(qū)的表達(dá)水平，海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組海馬CA1區(qū)MMP-2、P53蛋白表達(dá)及凋亡細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組均有增高，以24、48 h組更為顯著。結(jié)論：MMP-2和P53蛋白在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦組織中表達(dá)明顯增多，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡顯著，兩者與早期腦損傷關(guān)系密切，可能與MMP-2降解細(xì)胞外間質(zhì)，破壞血腦屏障，導(dǎo)致血腦屏障通透性增高，P53蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 蛛網(wǎng)膜下腔出血； MMP-2； P53蛋白； 細(xì)胞凋亡

【Abstract】 Objective：To study the MMP-2 and P53 in the role of early brain injury after subarachnoid hemorrhage preliminary by detecting MMP-2 and P53 protein expression level and apoptosis in brain tissue in order to provide a theoretical basis for treatment of subarachnoid hemorrhage in clinical practice.Method：72 clean-level male SD rats were randomly divided into sham-operated group（n=12） and SAH group（n=60）.SAH group were randomly divided into 12 h，24 h，48 h，3 d and 5 d group，12 rats in each group.The MMP-2 and P53 protein expression levels and neurocyte apoptosis in hippocampus CA1 were detected.Result：The MMP-2，P53 protein and the number of apoptotic cells in hippocampus CA1 of SAH group in each time were increased compared with those of sham-operated group，the differences were the most significant at the 24 and 48 h group.Conclusion：MMP-2 and P53 protein are closely related to early brain injury after subarachnoid hemorrhage by the former，MMP-2 increasing the permeability of blood-brain barrier by degradation of extracellular matrix to destroy blood-brain barrier，and the latter P53 protein，inducing the neurocyte apoptosis.

【Key words】 Subarachnoid hemorrhage； MMP-2； P53 protein； Apoptosis

First-authors address：Liaocheng Central Hospital of Shandong Province，Liaocheng 252000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.25.008

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是神經(jīng)系統(tǒng)常見的急危重癥，年發(fā)病率為（2～16）/10萬[1]，且近30年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]，最常見的病因是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂，約占所有自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)病原因的34%[3-4]，約35%患者在SAH后24 h內(nèi)死亡，與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂出血導(dǎo)致的早期腦損傷密切相關(guān)[5-6]，但SAH后早期腦損傷的機(jī)制卻知之甚少。SAH后多會(huì)出現(xiàn)腦水腫、顱內(nèi)壓升高、腦血管痙攣及血-腦脊液屏障損壞等多種病理生理改變[7]。文獻(xiàn)[8]2004年提出，蛛網(wǎng)膜下腔出血后EBI是早期致死致殘的主要原因。相關(guān)研究認(rèn)為EBI是多因素、多途徑的病理過程，其中神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡起重要作用，但確切機(jī)制尚不明了[8-9]。因此，探討SAH后早期腦損傷的機(jī)制，進(jìn)而早期進(jìn)行有效的藥物干預(yù)和治療成為臨床急待解決的問題和重要的研究方向。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)MMP-2、P53蛋白在大鼠SAH模型腦組織中的表達(dá)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況，旨在從分子水平來探討二種蛋白在大鼠SAH后腦組織中表達(dá)的變化，及其與EBI的發(fā)生、發(fā)展過程之間可能的相互作用機(jī)制，為臨床工作中對(duì)SAH進(jìn)行早期治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取72只蛛網(wǎng)膜下腔出血模型SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組又分為出血后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d共5個(gè)時(shí)相組，每個(gè)時(shí)相組各12只大鼠。各組標(biāo)本分別檢測(cè)MMP-2及P53蛋白在海馬CA1區(qū)的表達(dá)水平，海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。endprint

1.2 方法 （1）按SABC法進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)MMP-2及P53蛋白在海馬CA1區(qū)的表達(dá)水平。MMP-2表達(dá)陽性細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色，P53陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿和細(xì)胞核均染成棕黃色，但胞漿著色較輕。選取海馬CA1區(qū)相應(yīng)的區(qū)域，每個(gè)區(qū)域選取5個(gè)×400鏡下視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均值，采用生物醫(yī)學(xué)分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，分析各組陽性細(xì)胞表達(dá)程度的差異。（2）TUNEL染色檢測(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，凋亡結(jié)果判定：細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為TUNEL陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。陽性反應(yīng)的細(xì)胞定量采用imane-proplus軟件系統(tǒng)，每只大鼠取海馬CA1區(qū)切片觀察，取切片中海馬CA1區(qū)相互不重疊的5個(gè)視野，×400倍視野下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞平均個(gè)數(shù)。結(jié)果采用彩色醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)和Nikon UFX-IIA熒光/光學(xué)顯微鏡及顯微照相機(jī)進(jìn)行海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞記數(shù)（個(gè)/×400倍視野）。

1.3 觀察指標(biāo) 海馬CA1區(qū)MMP-2及P53蛋白的表達(dá)水平，海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用（x±s）表示，數(shù)據(jù)采用ONE WAY ANOVA對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上6個(gè)分組的數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量資料單因素方差分析，進(jìn)行假手術(shù)組和不同時(shí)相組的兩兩比較。以單側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛛網(wǎng)膜下腔出血后海馬CA1區(qū)MMP-2的表達(dá) 假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密，偶可見到少量的MMP-2表達(dá)（1.04±0.95）個(gè)/×400倍視野，SAH組海馬CA1區(qū)MMP-2在12 h時(shí)可見明顯表達(dá)（21.19±1.75）個(gè)/×400倍視野，胞漿黃染，在24 h達(dá)到高峰（32.35±2.63）個(gè)/×400倍視野，以后表達(dá)稍有下降，直到48 h時(shí)仍保持較高水平（28.46±2.74）個(gè)/×400倍視野，第3天開始明顯減少（13.71±1.73）個(gè)/×400倍視野，第5天為（9.11±1.16）個(gè)/×400倍視野。SAH后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d組與假手術(shù)組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。假手術(shù)組和SAH后各時(shí)間組海馬區(qū)MMP-2的表達(dá)結(jié)果，見圖1～6。

2.2 蛛網(wǎng)膜下腔出血后海馬區(qū)P53的表達(dá) 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞間緊密排列，偶可見到少量P53的表達(dá)（0.85±0.84）個(gè)/×400倍視野，SAH組海馬CA1區(qū)P53表達(dá)在12 h時(shí)顯著呈陽性表現(xiàn)（24.05±1.54）個(gè)/×400倍視野，胞核染色明顯，至24 h達(dá)到高峰（33.998±2.02）個(gè)/×400倍視野，直到48 h時(shí)仍保持較高水平（30.20±1.29）個(gè)/×400倍視野，3 d以后表達(dá)稍有下降（18.15±1.51）個(gè)/×400倍視野，第五天為（13.82±1.33）個(gè)/×400倍視野。SAH后海馬CA1區(qū)12 h、24 h、48 h、3 d、5 d組與假手術(shù)組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。假手術(shù)組和SAH后各時(shí)間組海馬CA1區(qū)P53表達(dá)結(jié)果，見圖7～12。

2.3 蛛網(wǎng)膜下腔出血后海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡 假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)可見到少量神經(jīng)元細(xì)胞凋亡（1.29±1.22）個(gè)/×400倍視野，蛛網(wǎng)膜下腔出血組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡在12 h時(shí)明顯升高（30.47±2.28）個(gè)/×400倍視野，24 h時(shí)達(dá)到高峰（42.02±2.19）個(gè)/×400倍視野，光鏡下可見大量凋亡細(xì)胞，核縮小、呈棕黃色，局部神經(jīng)元脫失，呈篩網(wǎng)狀，淋巴細(xì)胞浸潤，膠質(zhì)細(xì)胞大量增生，神經(jīng)元脫失隨時(shí)間延長更加明顯，48 h后逐漸減少（37.95±2.05）個(gè)/×400倍視野，3 d為（22.997±2.28）個(gè)/×400倍視野，至第5天可見神經(jīng)元細(xì)胞顯著減少，主要為凋亡細(xì)胞（18.18±1.41），且排列稀疏。SAH后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d與假手術(shù)組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。假手術(shù)組和SAH后各時(shí)間組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡結(jié)果，見圖13～18。

3 討論

3.1 蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷目前研究現(xiàn)狀的探討 EBI是蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）后72 h內(nèi)腦作為一個(gè)整體發(fā)生的直接損傷涉及到遲發(fā)性腦血管痙攣出現(xiàn)（3 d～2周）之前腦組織內(nèi)所發(fā)生的病理生理事件[10]，包括腦組織細(xì)胞死亡，血腦屏障破壞，腦水腫，顱內(nèi)壓增高，急性腦血管痙攣，微血管功能障礙腦血流下降等[8，11]。早期腦損傷不但對(duì)患者產(chǎn)生致命性傷害，而且與是否留有后遺癥密切相關(guān)。由于大部分重度SAH患者尚未得到及時(shí)有效的救治就早期死亡，有關(guān)SAH后早期腦損傷的研究資料較少，有關(guān)SAH早期研究資料顯示：尸檢發(fā)現(xiàn)SAH急性期死亡患者有全腦彌漫性腦梗死，PTE檢測(cè)亦發(fā)現(xiàn)SAH急性期患者存在不同程度的腦缺血及其引發(fā)的腦能量代謝障礙[12]。臨床雖然無法觀察到最初發(fā)生SAH時(shí)大腦微血管收縮、顱內(nèi)壓和腦血流的變化情況，但實(shí)驗(yàn)性SAH腦血管結(jié)構(gòu)解剖學(xué)改變已經(jīng)通過驗(yàn)證并發(fā)現(xiàn)額外管腔變化造成腦灌注不足[13]。因此，SAH急性期發(fā)生全腦血流量瞬間快速降低，繼而緩慢恢復(fù)的腦缺血再灌注模式，既可能存在由于單純腦缺血所導(dǎo)致的能量代謝不足，又可能存在腦缺血再灌注所致的損傷，是SAH后早期唯一可能觀察到的腦損害因素，對(duì)這種腦缺血損傷的模式進(jìn)行深入研究有助于揭示SAH后早期腦損傷的發(fā)病機(jī)理。

3.2 SAH早期腦損傷與基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2） SAH出血后，腦組織處于嚴(yán)重缺血、缺氧狀態(tài)，繼而顱內(nèi)壓、腦灌注壓和全腦血流量按各自的變化節(jié)律逐漸恢復(fù)，此過程中大腦作為整體主要受到缺血再灌注損傷。腦毛細(xì)血管基底膜是維持血腦屏障完整性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，主要由Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等構(gòu)成?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是MMPs家族的成員，為72KDⅣ型膠原酶（又稱明膠酶A），參與組織發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的組織重塑過程，亦能夠通過降解細(xì)胞外基質(zhì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附以及轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外環(huán)境中細(xì)胞表面蛋白的脫落等途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞活性。Hamann等[14]報(bào)道早在腦缺血/再灌注2 h后MMP-2即通過消化腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞基底膜，改變內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接，導(dǎo)致BBB的開放。故腦缺血及再灌后MMPs出現(xiàn)陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，尤其是MMP-2活性增加，與腦微血管通透性增加、BBB通透性增大、BBB的屏障作用破壞、炎性細(xì)胞侵入和腦水腫明顯相關(guān)。endprint

本研究結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)MMP-2未見明顯表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組大鼠12 h MMP-2表達(dá)增加，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬CA1區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)量至24 h達(dá)到高峰，表現(xiàn)為細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量較假手術(shù)組減少，大多數(shù)細(xì)胞胞漿黃染，細(xì)胞之間間隙增大，排列疏松，24 h之后陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量逐漸下降，證明SAH后MMP-2在腦血管基底膜破壞的病理過程中存在陽性表達(dá)，MMP-2通過降解腦血管基底膜，導(dǎo)致BBB的通透性改變，促使早期腦損傷發(fā)生。

3.3 SAH早期腦損傷與P53蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 凋亡是蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的主要的病理生理過程之一，有實(shí)驗(yàn)表明，SAH發(fā)生后10 min內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞就開始發(fā)生凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)TUNEL染色發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組海馬CA1區(qū)均有不同程度的細(xì)胞凋亡，以24 h組表現(xiàn)最為明顯，進(jìn)一步證實(shí)了SAH后急性期的確存在缺血再灌注損傷，并由此引發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。腦缺血再灌注損傷后，參與細(xì)胞凋亡的因素有很多，近年來的研究表明，P53與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系[16-17]，P53基因是一種抑癌基因，在細(xì)胞增殖、分化等過程中起著至關(guān)重要的作用，目前認(rèn)為P53是引發(fā)細(xì)胞凋亡連鎖反應(yīng)中第一位的決定因素。有研究表明，P53基因通過調(diào)控bcl-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，SAH后BMEC凋亡的發(fā)生與促凋亡的P53蛋白密切相關(guān)，P53表達(dá)程度與細(xì)胞凋亡程度呈正相關(guān)[18]。Yuksel等[19]發(fā)現(xiàn)，腦缺血發(fā)生后死亡受體的配體Fas和TNF的表達(dá)上調(diào)與死亡受體結(jié)合后可激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其主要機(jī)制之一為死亡受體穩(wěn)定胞質(zhì)內(nèi)的P53。相關(guān)研究亦發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血后60 min，大腦皮層即開始有P53表達(dá)增加，24～48 h達(dá)高峰，這與細(xì)胞凋亡時(shí)間一致，且在一定時(shí)間內(nèi)二者呈正相關(guān)，說明P53的表達(dá)在腦缺血細(xì)胞凋亡過程中起一定作用[20]。Yan等[21]通過siRNA干擾P53正向凋亡調(diào)控因子（P53 upregulated modulator of apoptosis，PUMA）抑制P53的表達(dá)，SAH后BMEC凋亡明顯減少。以上結(jié)果表明，SAH可誘導(dǎo)P53蛋白表達(dá)，P53蛋白對(duì)出血后早期腦損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)未見明顯P53陽性細(xì)胞表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬CA1區(qū)在注血后12 h即可檢測(cè)到P53陽性表達(dá)細(xì)胞，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），24 h時(shí)P53蛋白表達(dá)達(dá)到高峰，鏡下可見CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組減少，陽性細(xì)胞胞核黃染，核仁縮小或碎裂，細(xì)胞之間間隙增大，排列疏松，48 h時(shí)可見P53陽性表達(dá)細(xì)胞輕度減少，3 d時(shí)減少明顯，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。P53蛋白表達(dá)與TUNEL染色結(jié)果中細(xì)胞凋亡的高峰同時(shí)出現(xiàn)，且與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的分布大致相符，證明P53蛋白在蛛網(wǎng)膜下腔出血后異常高表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，在EBI發(fā)病過程中產(chǎn)生促進(jìn)作用。

本試驗(yàn)只是對(duì)SAH后早期腦損傷、腦組織神經(jīng)元的凋亡機(jī)制做了初步的探討，關(guān)于SAH后出現(xiàn)腦損傷及細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，但不可否認(rèn)的是，MMP-2和P53蛋白在血腦屏障破壞、大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元凋亡的進(jìn)程中可能起著重要的作用。從研究SAH早期腦損傷出發(fā)，探究SAH早期腦損傷的病理機(jī)制以及有效的腦保護(hù)措施，不僅為臨床上防治SAH后EBI提供理論基礎(chǔ)，為 SAH 的治療提供新的思路，也將為重度SAH患者如何盡早采取有效的干預(yù)措施，進(jìn)行腦動(dòng)脈瘤和遲發(fā)性腦血管痙攣的進(jìn)一步治療爭取更多的機(jī)會(huì)。

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（收稿日期：2017-03-20） （本文編輯：周亞杰）endprint