CD147在尖銳濕疣組織中的表達(dá)及其介導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制*

林 靜， 韓永智， 肖潔平， 李小紅， 董秀芹

廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚科，廣州 510080

CD147在尖銳濕疣組織中的表達(dá)及其介導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制*

林 靜， 韓永智， 肖潔平， 李小紅， 董秀芹

廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚科，廣州 510080

目的探討CD147在尖銳濕疣組織中的表達(dá)及其在尖銳濕疣發(fā)病機(jī)制中的作用。方法收集30例尖銳濕疣(condyloma acuminata，CA)皮損組織作為CA組，另取30例男性包皮組織作為對(duì)照組，采用免疫組化染色檢測(cè)組織CD147、PCNA、CD31表達(dá)，以CD31染色情況計(jì)算微血管密度(microvascular density，MVD)，分析CA皮損組織CD147表達(dá)和PCNA、MVD的相關(guān)性。采用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞中CD147的表達(dá)，按照處理方式分為空白對(duì)照組、CD147-siRNA組和CD147-NC組，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和周期分布，Real-time PCR檢測(cè)CD147、VEGF、PCNA mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)VEGF、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白表達(dá)。結(jié)果CA組皮損組織CD147表達(dá)陽(yáng)性率為83.3%，PCNA表達(dá)陽(yáng)性率為70.0%，對(duì)照組包皮組織分別為36.7%和40.0%，CA組CD147、PCNA表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組(均P<0.05)；CA組MVD值為(35.81±6.54)條/mm2，對(duì)照組為(12.74±4.75)條/mm2，CA組MVD值明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；相關(guān)性分析顯示：CA組皮損組織CD147與PCNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.753，P<0.05)，CD147表達(dá)與MVD值亦呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.872，P<0.05)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與CD147-NC組比較，CD147-siRNA組處理48、72、96 h后HaCaT細(xì)胞的增殖能力明顯降低(均P<0.05)；CD147-siRNA組細(xì)胞凋亡率明顯高于CD147-NC組(P<0.01)，CD147-siRNA組G2/M期所占比例明顯低于CD147-NC組，S期所占比例明顯高于CD147-NC組(均P<0.01)；CD147-siRNA組PCNA、VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于CD147-NC組(均P<0.01)。結(jié)論CA皮損組織中CD147呈多數(shù)陽(yáng)性表達(dá)，且CD147的表達(dá)與PCNA表達(dá)及MVD均呈正相關(guān)；下調(diào)CD147表達(dá)可以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT的增殖，其作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞周期蛋白和調(diào)控血管新生有關(guān)。

CD147； 增殖細(xì)胞核抗原； 尖銳濕疣； 血管新生； 細(xì)胞增殖

尖銳濕疣(condyloma acuminata，CA)是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的性傳播疾病之一，主要由人類(lèi)乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染所致，其中最常見(jiàn)的病毒亞型為HPV6/11[1-4]。CA具有生長(zhǎng)快、治療后容易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，部分病例還有發(fā)生惡變的可能。以往對(duì)CA發(fā)病的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)等可能與CA有關(guān)。CD147是一種屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，廣泛分布于多種細(xì)胞、組織和器官，并可在細(xì)胞的分化、增殖、粘附等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。研究顯示CD147與角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化相關(guān)，可能是細(xì)胞高增殖和低分化狀態(tài)的標(biāo)志分子[5]。國(guó)內(nèi)外還有研究發(fā)現(xiàn)CD147可能通過(guò)直接和間接的作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，刺激血管新生，從而促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道，CA皮損中CD147的表達(dá)高于正常皮膚，但迄今為止，CD147與CA進(jìn)展的關(guān)系及其作用機(jī)制尚未明確。本研究通過(guò)分析CA皮損中CD147、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達(dá)情況及微血管密度(microvascular density，MVD)計(jì)數(shù)，以及抑制角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT中CD147的表達(dá)后細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期分布等的變化，探討CD147與CA組織中角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、血管新生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

選擇2015年7月至2015年12月在廣東省人民醫(yī)院皮膚性病科門(mén)診就診的30例CA患者作為CA組，男21例，女9例，年齡18～47歲，平均(27.8±4.9)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為尖銳濕疣；②病程≥3個(gè)月；③就診前1個(gè)月未進(jìn)行抗CA治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素或免疫調(diào)節(jié)劑；②合并病毒感染或其他性傳播疾??；③妊娠或哺乳期婦女。另選擇同期在醫(yī)院行包皮切除的男性人群30例作為對(duì)照組，排除使用免疫抑制劑或合并其他性傳播疾病者，年齡20～37歲，平均(27.4±4.3)歲。CA組和對(duì)照組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。將疣體組織和包皮組織剪下，置于4%甲醛中固定待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT(美國(guó)菌種保藏中心，ATCC)；通用型SP檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物科技公司)；DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；CD147-siRNA和非特異性陰性對(duì)照(CD147-NC)序列由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，CD147-siRNA序列：5′-GUAAUGACUAGGGCUAUUA-3′，陰性對(duì)照序列：5′-CGUA-UGCGCGUACUCUAAUTT-3′；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM(美國(guó)Invitrogen公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore公司)；鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人CD147單克隆抗體、鼠抗人PCNA單克隆抗體、鼠抗人CD31單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。Real-time PCR儀(Bio-Rad公司)；BD FACSAria Ⅲ流式細(xì)胞分選儀(BD公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)組織CD147、PCNA、CD31表達(dá)

按照SP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，微波加熱修復(fù)抗原，再滴加3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物。PBS沖洗3次，在每張切片上滴加1滴山羊血清工作液，室溫孵育30 min，再滴加1滴一抗，4℃孵育過(guò)夜。第2天用PBS緩沖液沖洗3次，再滴加1滴生物素標(biāo)記的二抗，室溫繼續(xù)孵育30 min。滴加1滴鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液，室溫孵育30 min，滴加1滴DAB顯色液，DAB染色后蘇木精復(fù)染，自來(lái)水沖洗，脫水透明后中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

以出現(xiàn)黃色或褐色顆粒作為陽(yáng)性染色。隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，陽(yáng)性結(jié)果判定參考以下標(biāo)準(zhǔn)，染色強(qiáng)度：0分，無(wú)染色；1分，淡染色；2分，中等強(qiáng)度染色；3分，強(qiáng)染色。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：0分，<5%；1分，5%～；2分，26%～；3分，51%～；4分，>75%。免疫染色評(píng)分(IRS)以染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例綜合判定，兩者相乘，IRS評(píng)分0～12分，其中≤4分為陰性，>4分為陽(yáng)性。

MVD計(jì)數(shù)：首先在低倍鏡(×40)下觀察高血管密度區(qū)，再在高倍鏡下(×200)下統(tǒng)計(jì)CD31陽(yáng)性染色的毛細(xì)血管和微小血管數(shù)，以5個(gè)高倍鏡視野血管數(shù)的平均值表示。

1.5 細(xì)胞分組與處理

HaCaT細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)，在培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2培養(yǎng)。細(xì)胞融合70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前將CD147-siRNA或CD147-NC用800 μL的PBS溶解，使之終濃度為200 nmol/L。按照轉(zhuǎn)染類(lèi)型將細(xì)胞分為3組：CD147-siRNA組、CD147-NC組和空白對(duì)照組(Mock)，CD147-siRNA組：將1 μL Lipofectamine 2000與2.5 μL CD147-siRNA混勻，靜置5 min，再加入400 μL細(xì)胞懸液，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)液。再培養(yǎng)48 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染后其他檢測(cè)操作。CD147-NC組加入2.5 μL CD147-NC，其余操作同CD147-siRNA組。Mock組僅加入1 μL Lipofectamine 2000脂質(zhì)體，其余操作同CD147-siRNA組。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)整為1×105個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于96孔板(200 μL/孔)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h后，向每孔中加入濃度為200 μg/mL的MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h，再加入150 μL DMSO溶液，充分振蕩均勻后，于570 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

細(xì)胞接種于6孔板中(1×106個(gè)/孔)，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為不含血清的培養(yǎng)液，饑餓處理過(guò)夜。胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，培養(yǎng)液重懸，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集貼壁細(xì)胞，加入70%乙醇于-20℃固定12 h。第2 天棄去固定液，加入RNA酶和PI染液，室溫染色30 min，按照流式細(xì)胞儀操作說(shuō)明書(shū)上機(jī)檢測(cè)，每次實(shí)驗(yàn)平行操作3次。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

收集各組貼壁細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，2 500 r/min離心5 min，收集上清液，PBS重懸細(xì)胞。依次加入400 μL PI和5 μL Annexin Ⅴ-FITC染液，避光孵育20 min，按照流式細(xì)胞儀的操作說(shuō)明書(shū)，調(diào)節(jié)激發(fā)光波長(zhǎng)，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，每次實(shí)驗(yàn)平行操作3次。

1.9 Real-time PCR檢測(cè)CD147、VEGF、PCNA mRNA表達(dá)

收集貼壁細(xì)胞，胰蛋白酶消化后離心，加入Trizol試劑，冰浴上反應(yīng)5 min提取總RNA。取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系：dNTP 2 μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，1×buffer 4 μL，加入ddH2O補(bǔ)充至20 μL。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，總計(jì)40個(gè)循環(huán)。CD147引物上游：5′-CATAACCTCTGTCACGAGCAGT-3′，下游：5′-CTGAATGCCCTGACACTGTCC-3′；VEGF引物上游：5′-GTCCACCGCA-AATGCTTCTA-3′，下游：5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′；PCNA引物上游：5′-CAGCTGGCAGAAACACCGAGCAA-3′，下游：5′-CGAGCACAAGCACAGGAGGTATA-3′；β-actin引物上游：5′-ACCATGAGTGATCAGCAGC-3′，下游：5′-CACATAGACTGGGGACCAGG-3′。定量分析結(jié)果以Ct值表示，以β-actin作為內(nèi)參，2-ΔΔCt作為目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.10 Western blot檢測(cè)VEGF、PCNA蛋白表達(dá)

收集貼壁細(xì)胞，胰蛋白酶消化后離心，加入1 mL RIPA裂解液置于冰浴上裂解30 min，4℃條件下離心15 min，BCA蛋白濃度試劑盒檢測(cè)蛋白純度。將20 μg蛋白提取液置于10% SDS-PAGE電泳分離，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂牛奶孵育封閉2 h。分別加入VEGF、PCNA抗體，4℃孵育24 h。再滴加二抗37℃孵育2 h。PBS沖洗3次，按照ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒顯影，以β-actin作為內(nèi)參照，分析目的條帶相對(duì)表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CA組和對(duì)照組組織CD147、PCNA蛋白陽(yáng)性率比較

CA組83.3%皮損組織CD147蛋白陽(yáng)性表達(dá)，70.0%病例PCNA蛋白表達(dá)陽(yáng)性，對(duì)照組包皮組織分別有36.7%CD147陽(yáng)性表達(dá)和40.0%PCNA表達(dá)陽(yáng)性，CA組組織CD147、PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1,圖1。

表1 CA組和對(duì)照組組織CD147、PCNA蛋白表達(dá)陽(yáng)性情況(例)Table 1 Expression of CD147 and PCNA in CA and control groups(n)

圖1 CD147、PCNA、CD31在CA組和對(duì)照組組織中的表達(dá)(×200)Fig.1 Expression of CD147，PCNA and CD31 in CA and control groups(×200)

2.2 CA組和對(duì)照組組織MVD計(jì)數(shù)比較

CD31是一種敏感的血管標(biāo)記物，用于標(biāo)記毛細(xì)血管和微小血管，CD31陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕褐色或褐色顆粒(圖1)。經(jīng)過(guò)計(jì)算，CA組MVD值為(35.81±6.54)條/mm2，對(duì)照組為(12.74±4.75)條/mm2，CA組MVD值明顯高于對(duì)照組(t=15.633，P<0.01)。

2.3 CD147與PCNA、MVD相關(guān)性分析

在CA患者皮損組織中，CD147呈陽(yáng)性表達(dá)的組織PCNA表達(dá)和MVD值也明顯增加，CD147與PCNA呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.753，P<0.05)，CD147與MVD值亦呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.872，P<0.05)。

2.4 抑制CD147表達(dá)對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，CD147-siRNA組CD147 mRNA表達(dá)明顯低于CD147-NC組(P<0.05，圖2A)，說(shuō)明CD147表達(dá)下調(diào)的HaCaT細(xì)胞構(gòu)建成功。MTT法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，與CD147-NC組比較，CD147-siRNA組處理48、72、96 h后細(xì)胞增殖能力明顯降低(均P<0.05)，CD147-NC組和空白對(duì)照組各時(shí)段細(xì)胞增殖能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，圖2B)。

A：各組HaCaT細(xì)胞CD147 mRNA表達(dá)；B：各組HaCaT細(xì)胞增殖能力；與CD147-NC組比較，*P<0.05 ** P<0.01圖2 各組HaCaT細(xì)胞CD147mRNA表達(dá)及細(xì)胞增殖能力比較Fig.2 Comparison of the CD147mRNA expression and proliferation of HaCaT cells between groups

2.5 抑制CD147表達(dá)對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡及周期分布的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示CD147-siRNA組細(xì)胞凋亡率明顯高于CD147-NC組(P<0.01)，CD147-NC組和空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3A)。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，CD147-siRNA組G2/M期所占比例明顯低于CD147-NC組，S期所占比例明顯高于CD147-NC組(均P<0.01，圖3B)；CD147-NC組與空白對(duì)照組各細(xì)胞周期分布比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.6 抑制CD147表達(dá)對(duì)HaCaT細(xì)胞PCNA、VEGF表達(dá)的影響

Real-time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，CD147-siRNA組PCNA、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于CD147-NC組(均P<0.01)，CD147-NC組與空白對(duì)照組PCNA、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，圖4 )。

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HaCaT細(xì)胞凋亡；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HaCaT細(xì)胞周期分布；與CD147-NC組比較，** P<0.01圖3 各組HaCaT細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布比較Fig.3 Comparison of the cell apoptosis rate and cell cycle distribution of HaCaT cells between groups

A：各組細(xì)胞PCNA mRNA表達(dá)；B：Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)；C：各組細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)；D：Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)；與CD147-NC組比較，** P<0.01圖4 各組HaCaT細(xì)胞PCNA、VEGF表達(dá)水平Fig.4 Expression of PCNA and VEGF of HaCaT cells in each group

3 討論

病理學(xué)證實(shí)CA皮損處的角質(zhì)形成細(xì)胞存在分化和增殖狀態(tài)的異常[7-8]，短時(shí)間內(nèi)過(guò)度增殖會(huì)形成巨大型CA，給患者的生活、工作造成極大影響，甚至存在惡變的可能。因此探討CA疾病進(jìn)展的機(jī)制，對(duì)預(yù)防CA過(guò)度增生具有重要意義。有學(xué)者認(rèn)為CA是一種細(xì)胞免疫介導(dǎo)的皮膚疾病[9]，免疫異常能夠活化和釋放一系列細(xì)胞因子，參與機(jī)體的增殖和修復(fù)。CA主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞異常增殖，因此過(guò)度增生是CA的典型特征之一。CD147是一種屬于免疫球蛋白超家族成員的跨膜糖蛋白，在器官形成、組織修復(fù)、細(xì)胞粘附和胚胎發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。Nishibaba等[10]稱干擾惡性黑色素瘤細(xì)胞中CD147的表達(dá)可在體外抑制細(xì)胞的增殖，并且可以抑制裸鼠移植瘤組織中PCNA的表達(dá)以及瘤體的生長(zhǎng)。汪成等[11]采用重組慢病毒Lv-shRNA-CD147感染乳腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示CD147基因沉默可下調(diào)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)蛋白(β-catenin、MMP2、MMP9)表達(dá)，抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

目前關(guān)于CD147與皮膚病的報(bào)道較少，Zhao等[12]證實(shí)CD147與銀屑病外周血T淋巴細(xì)胞的活化和增殖潛能相關(guān)，CD147可能是銀屑病治療的潛在靶分子。PCNA是一種周期蛋白，處于增殖周期的細(xì)胞PCNA蛋白均有表達(dá)，PCNA表達(dá)水平也是細(xì)胞增殖狀態(tài)敏感的生物標(biāo)記物之一[13]。本研究發(fā)現(xiàn)CA皮損組織PCNA蛋白陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組，提示CA細(xì)胞存在過(guò)度增殖情況。肖漢龍等[14]報(bào)道稱CA細(xì)胞的增殖活性明顯強(qiáng)于正常表皮細(xì)胞，CA皮損處PCNA蛋白表達(dá)和增殖指數(shù)也顯著高于對(duì)照組(正常組織)。上述報(bào)道也證實(shí)了本研究的結(jié)果。細(xì)胞的過(guò)度增殖必須依賴于充足的血供，MVD是評(píng)價(jià)血管新生能力最直接的客觀指標(biāo)[15]，CD31是重糖化Ⅰ型跨膜蛋白，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有高度敏感性，常用于標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。本研究通過(guò)CD31染色技術(shù)評(píng)價(jià)CA組織微血管形成能力，結(jié)果顯示CA組MVD值明顯高于對(duì)照組，提示CA細(xì)胞通過(guò)微血管的形成，使細(xì)胞獲得充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，最終導(dǎo)致CA細(xì)胞過(guò)度增殖。既往有報(bào)道稱在細(xì)胞快速增殖下，跨膜糖蛋白CD147表達(dá)上調(diào)可以激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT-1)并提供細(xì)胞增殖所必需的能量供應(yīng)[16]，激活的GLUT-1也會(huì)引起血管新生以轉(zhuǎn)運(yùn)足夠的營(yíng)養(yǎng)，VEGF表達(dá)隨之增加，細(xì)胞獲得充分的能量后誘導(dǎo)細(xì)胞快速增殖，PCNA表達(dá)上調(diào)。相關(guān)性分析也顯示在CA皮損組織CD147與PCNA和MVD呈正相關(guān)，與熊浩等[17]報(bào)道一致。

角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的重要組成成分，發(fā)生CA時(shí)，患者皮損處角質(zhì)形成細(xì)胞的角蛋白譜發(fā)生明顯變化，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[18-19]。本研究利用角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT作為研究對(duì)象，進(jìn)一步分析抑制CD147表達(dá)對(duì)HaCaT細(xì)胞生物學(xué)行為和蛋白譜表達(dá)的變化。研究結(jié)果顯示，CD147-siRNA組細(xì)胞凋亡率明顯升高；在細(xì)胞周期分布方面，CD147-siRNA組G2/M期所占比例明顯降低，S期所占比例明顯升高，說(shuō)明抑制CD147表達(dá)能夠使HaCaT細(xì)胞周期阻滯于S期，這可能是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加的原因。MTT檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)CD147-siRNA組細(xì)胞增殖能力明顯降低，陳明亮等[20]采用白藜蘆醇通過(guò)抑制角蛋白K17抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，但是角蛋白K17下調(diào)的誘導(dǎo)機(jī)制該作者未進(jìn)行說(shuō)明。本研究結(jié)果顯示CD147-siRNA組PCNA、VEGF mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于CD147-NC組和空白對(duì)照組，提示CD147可能通過(guò)阻滯細(xì)胞周期和抑制血管新生調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞的增殖。

綜上所述，CA組織CD147呈高陽(yáng)性表達(dá)，CD147表達(dá)水平與PCNA、MVD呈正相關(guān)；下調(diào)CD147表達(dá)可以抑制角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT的增殖，其作用機(jī)制可能與降低細(xì)胞周期蛋白和調(diào)控血管新生有關(guān)。CD147有望成為CA治療的潛在作用靶點(diǎn)之一。

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ExpressionofCD147inCondylomataAcuminateandCD147-mediatedPathogenesis

Lin Jing，Han Yongzhi，Xiao Jieping et al

DepartmentofDermatology，GuangdongAcademyofMedicalSciences，GuangdongGeneralHospital，Guangzhou510080，China

ObjectiveTo explore the expression of CD147 in condyloma acuminata(CA) tissues and its role in the pathogenesis of CA.MethodsThirty cases of CA were enrolled in the study.The CA lesions(n=30)were selected to the CA group，with 30 normal males foreskin tissues serving as control group.The expression of CD147，proliferating cell nuclear antigen(PCNA)，and CD31 in tissues was immunohistochemically measured.The microvascular density(MVD)was represented by CD31 staining.The correlation between CD147 and PCNA or MVD in CA tissues was analyzed.siRNA was used to inhibit the expression of CD147 in HaCaT cells，which were later divided into blank control group，CD147-NC and CD147-siRNA groups according to the different treatment methods.The cell proliferation was measured by MTT assay，and the cell apoptosis rate and cell cycle were detected by flow cytometry.The expression of CD147，VEGF and PCNA mRNA and the expression of VEGF and PCNA protein were measured by Real-time PCR and Western blot，respectively.ResultsThe CD147 positive rate was 83.3% in CA group and 36.7% in control group.The PCNA positive rate was 70.0% in CA group and 40.0% in control group.The CD147 and PCNA positive rates were significantly higher in CA group than in control group(P<0.05).The MVD value was(35.81±6.54)/mm2in CA group，significantly higher than in control group[(12.74±4.75)/mm2，P<0.01].Correlation analysis showed that CD147 was positively correlated with PCNA(r=0.753，P<0.05)and with MVD(r=0.872，P<0.05).Additionally，the cell proliferation was found to be significantly suppressed 48，72 and 96 h after treatment in CD147-siRNA group as compared with CD147-NC group(P<0.05).The cell apoptosis rate was significantly higher in CD147-siRNA group than in CD147-NC group (P<0.01).The G2/M ratio was significantly lower and the S phase ratio significantly higher in CD147-siRNA group than in CD147-NC group(P<0.01).The mRNA and protein expression of PCNA and VEGF was much lower in CD147-siRNA group than in CD147-NC group(P<0.01).ConclusionCD147 is overexpressed in CA tissues，and the expression is positively correlated with the PCNA expression and MVD.Down-regulating the expression of CD147 can inhibit the proliferation of HaCaT cells，which may be associated with the decreased expression of cell cycle proteins and the regulation of angiogenesis.

CD147； proliferating cell nuclear antigen； condyloma acuminata； angiogenesis； cell proliferation

*廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金資助項(xiàng)目(No.A2015148)

林 靜，女，1981年生，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，E-mail：linjing0077@sina.com

R759

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.05.010

(2017-04-07 收稿)