PEDF在植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤中的表達(dá)及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、侵襲的影響*

林靚，孟春，李蕊，楊茵，陳小巖，俞訓(xùn)彬

福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院 1婦產(chǎn)科 3病理科，福州 350001 2福州大學(xué)藥物生物技術(shù)與工程研究所，福州 350001

PEDF在植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤中的表達(dá)及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、侵襲的影響*

林 靚1， 孟 春2，李 蕊1， 楊 茵1， 陳小巖3， 俞訓(xùn)彬3

福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床學(xué)院1婦產(chǎn)科3病理科，福州 3500012福州大學(xué)藥物生物技術(shù)與工程研究所，福州 350001

目的探討色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)在植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤中的表達(dá)及其對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)遷移、侵襲能力的影響。方法選擇2014年7月～2015年7月福建省立醫(yī)院剖宮產(chǎn)分娩的植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤(PA)組14例，前置胎盤(PP)組16例。采用免疫組化法檢測兩組胎盤的PEDF和VEGF的定位表達(dá)及微血管密度(microvascular vascular density，MVD)；用RT-PCR及Western blot檢測胎盤的PEDF和VEGF的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)；用ELISA檢測外周血清中PEDF和VEGF水平。培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，設(shè)陰性對(duì)照組和不同濃度的PDEF干預(yù)組，用平板劃痕和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測HUVEC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，用ELISA檢測培養(yǎng)上清液中VEGF水平。結(jié)果PA組與PP組相比，胎盤PEDF的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低而VEGF則明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。胎盤PEDF表達(dá)與胎盤VEGF、MVD及胎盤植入深度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(均P<0.05)，與外周血清PEDF水平呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。各PEDF干預(yù)組的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于陰性對(duì)照組(均P<0.05)。隨干預(yù)濃度增加，HUVEC細(xì)胞的遷移和侵襲能力降低(均P<0.05)。結(jié)論P(yáng)EDF可以反映植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤的異常血管密度和植入程度，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和侵襲能力，可作為影像學(xué)檢查的重要補(bǔ)充診斷方法和潛在的治療切入點(diǎn)。

前置胎盤伴植入， 色素上皮衍生因子， 血管內(nèi)皮生長因子， 微血管密度， 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞， 遷移， 侵襲

前置胎盤(placenta previa)和胎盤植入(placenta accreta)是嚴(yán)重的妊娠并發(fā)癥，是導(dǎo)致圍生期子宮切除的主要原因。兩者具有相似的的發(fā)病機(jī)制，都與胎盤血管的異常著床和侵入相關(guān)聯(lián)。前置胎盤的患者中有10%會(huì)發(fā)生胎盤植入，即“前置胎盤伴植入”(placenta previa accrete)[1]。本文通過研究色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)對(duì)植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤中胎盤微血管密度(microvascular vascular density，MVD)及侵入子宮肌層深度的影響以及體外血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，探討PEDF作為胎盤前置伴植入的影像學(xué)診斷補(bǔ)充標(biāo)志物及干預(yù)性靶點(diǎn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年7月～2015年7月在福建省立醫(yī)院產(chǎn)科擇期剖宮產(chǎn)分娩孕婦30例。其中植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤組(PA組)14例，前置胎盤組(PP組)16例。診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)前置胎盤：孕28周后B超提示胎盤附著于子宮下段，胎盤下緣達(dá)到或覆蓋宮頸內(nèi)口；(2)植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤：MRI檢查提示胎盤覆蓋于原剖宮產(chǎn)疤痕，胎盤與子宮下段肌層分界不清，術(shù)中證實(shí)為胎盤植入或切除子宮標(biāo)本在胎盤基板上可見胎盤絨毛侵犯子宮肌層。胎盤植入分類[2]：accreta為胎盤絨毛與宮壁肌層接觸粘連；increta為胎盤絨毛侵及宮壁肌層，未穿透漿膜層；percreta為胎盤絨毛穿透宮壁肌層及漿膜層，甚至侵及臨近組織器官如膀胱直腸等。收集孕婦年齡、孕次、產(chǎn)次、分娩孕周、流產(chǎn)及剖宮產(chǎn)次數(shù)、距末次剖宮產(chǎn)時(shí)間、手術(shù)方式、術(shù)中出血量、術(shù)后病理等臨床資料。

1.2 臨床標(biāo)本實(shí)驗(yàn)

1.2.1 外周血采集 入院時(shí)抽取肘靜脈血液3 mL，血液自然凝固后，以1 000 r/min×5 min離心，取上清，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 胎盤采集 剖宮產(chǎn)娩出胎盤后15 min內(nèi)在直視下避開出血壞死、鈣化區(qū)域，剪取植入或前置區(qū)域胎盤或正常胎盤母體面中央1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小組織，無菌生理鹽水漂洗，至上清液無色后用無菌紗布擦干，置于凍存管，液氮運(yùn)送至-80℃冰箱保存。另取相同部位組織用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋制成蠟塊。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測孕婦外周血PEDF和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)含量 按照試劑盒說明書步驟操作，應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)定量測定儀進(jìn)行檢測。

1.2.4 免疫組化檢測 胎盤組織固定、包埋后，制成4 μm厚的石蠟切片，免疫組化染色后光鏡下觀察胞核內(nèi)或者細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)不同程度的棕黃色或棕褐色粗大顆粒反應(yīng)者為PEDF或VEGF抗體染色陽性細(xì)胞。用CD34單克隆抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞并計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖片。

1.2.5 熒光定量PCR檢測胎盤組織中PEDF和VEGF的mRNA表達(dá) 用超純RNA提取試劑(TaKaRa Code D9108B)提取組織樣本中總RNA。PCR引物見表1，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa code DRRO47A)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將RNA模板、引物、5×RT Buffer和RNase-freeWater溶解并置于冰上備用。向反應(yīng)管中加入20 μL反應(yīng)體系，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用ABI7500型熒光定量PCR儀分析，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for fluorescent quantative PCR

1.2.6 Western blot檢測胎盤組織PEDF和VEGF蛋白表達(dá) 分別取胎盤組織，按每20 mg組織加200～400 μL的比例加入裂解液，按試劑盒說明提取組織總蛋白和核蛋白，-70℃保存，用考馬斯亮藍(lán)法測定各樣本蛋白含量。取20 μg蛋白，上樣于10%SDS-PAGE凝膠，電泳后轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉液室溫孵育60 min，分別加入抗PEDF抗體(1∶300)和VEGF抗體(1∶300)以及β-actin蛋白抗體(1∶1 000)，4℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h。曝光及洗片，顯色后以β-actin為內(nèi)參照，用Image J軟件分析灰度值。

1.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng) 將15～20 cm長的新生兒臍帶放入無菌的PBS溶液中儲(chǔ)存，用醫(yī)用針頭扎入臍帶靜脈中，用無菌的PBS溶液沖洗至污血干凈為止。用止血鉗封閉臍帶下端，加入0.125%胰蛋白酶+0.01%EDTA溶液在室溫下消化20 min，抽取臍靜脈內(nèi)液體，離心(1 000 r/min，10 min)后棄上清液，加入3 mL含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液，吹打成細(xì)胞懸液，移入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況。

1.3.2 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液VEGF蛋白含量 取生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期HUVEC細(xì)胞，PEDF干預(yù)組分別加入180、360、720 nmol/L PEDF，陰性對(duì)照組不加PEDF，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4℃ 3 000 r/min離心20 min，吸取上清液分裝后置于-80℃冰箱備用。將細(xì)胞消化，1 000 r/min離心5 min，重懸后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取含106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液離心，1 mL PBS重懸，加100 μL細(xì)胞裂解液，用吸管吹打數(shù)下，使細(xì)胞和裂解液充分接觸，室溫下裂解1 h，再用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，4℃ 1 200 r/min離心30 min，吸取上清液分裝后置于-80℃冰箱備用。按照ELISA說明書操作，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白含量進(jìn)行測定。

1.3.3 平板遷移實(shí)驗(yàn) 將HUVEC細(xì)胞按照上述分組給予不同濃度PEDF處理，取處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞各1×106個(gè)，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種1.2×105個(gè)細(xì)胞，待單層細(xì)胞完全覆蓋培養(yǎng)皿表面后，采用10 μL移液器吸頭與培養(yǎng)底面垂直劃一橫線，PBS洗滌去除漂浮的細(xì)胞，重新加入新鮮的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于12和24 h在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝細(xì)胞的遷移情況，分析單層細(xì)胞劃痕處的愈合情況。采用Image 6.0軟件測量劃痕處的寬度。

1.3.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 采用24孔法，將HUVEC細(xì)胞按照上述分組給予不同濃度PEDF處理。以1.0×105/孔懸浮于200 μL培養(yǎng)液，加入Transwell侵襲系統(tǒng)的上室內(nèi)，下室加入胎牛血清的培養(yǎng)液作為趨化劑。上下室之間的碳酸酯微孔濾膜均勻涂Matrigel基質(zhì)膠，在上下室內(nèi)同時(shí)加入DMSO作為對(duì)照，取出Transwell用棉簽擦去上室的Matrigel及表面細(xì)胞，切下侵襲小室底面的膜并翻轉(zhuǎn)，乙醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色30 min。置光學(xué)顯微鏡下拍照，每孔隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野計(jì)算穿過底膜的細(xì)胞數(shù)即侵襲細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

本研究共納入30例孕婦，兩組臨床資料比較見表2。PA組均為完全性前置胎盤，PP組中14例為完全性前置胎盤，另有部分性及邊緣性各1例。兩組在年齡、分娩孕周、孕次及距末次剖宮產(chǎn)時(shí)間上的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，而產(chǎn)次、子宮切除率及術(shù)中出血量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。PA組中accreta 5例(35.71%)，術(shù)中均保留子宮；increta 4例(28.58%)，均行次全子宮切除術(shù)；percreta 5例(35.71%)均侵犯膀胱，其中次全子宮切除術(shù)3例，全子宮切除術(shù)1例。

表2 PA組和PP組的臨床資料Table 2 Clinical data of patients in PA and PP groups(±s)

2.2 免疫組化定位PEDF和VEGF在胎盤組織的表達(dá)

如圖1所示，圖中箭頭標(biāo)記為血管內(nèi)皮細(xì)胞，PEDF和VEGF均主要表達(dá)于胎盤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞。

2.3 兩組胎盤組織PEDF、VEGF表達(dá)以及MVD的差異

如表3、圖2所示，PA組和PP組胎盤PEDF和VEGF的mRNA、蛋白表達(dá)以及胎盤微血管密度均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)。

2.4 兩組血清PEDF和VEGF含量的差異

PA組和PP組外周血清中PEDF含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而VEGF含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

2.5 胎盤中PEDF表達(dá)與外周血清PEDF水平、胎盤VEGF表達(dá)量、MVD及胎盤植入深度的關(guān)聯(lián)

胎盤中PEDF表達(dá)量與外周血PEDF水平呈正相關(guān)(r=0.446，P=0.014)，與胎盤VEGF表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.382，P=0.037)，與胎盤MVD呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.880，P=0.000)，與胎盤植入深度(無植入→accreta→increta→percreta)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.443，P=0.002)。

箭頭標(biāo)記為血管內(nèi)皮細(xì)胞圖1 免疫組化染色定位PEDF和VEGF在胎盤組織的表達(dá)(×400)Fig.1 Immunohistochemical staining of PEDF and VEGF in placenta tissues(×400)

組別nPEDFmRNAVEGFmRNAPEDF蛋白VEGF蛋白MVDPA組141.58±0.070.83±0.050.88±0.210.62±0.03107.47±11.57PP組161.84±0.210.67±0.101.10±0.140.54±0.0694.65±12.81t-4.2965.627-3.4324.0122.858P值<0.01<0.010.002<0.010.008

1～3：PP組；4～6：PA組圖2 胎盤組織PEDF和VEGF蛋白電泳圖Fig.2 Protein electrophoresis of PEDF and VEGF in placenta tissues

組別nPEDF(pg/mL)VEGF(pg/mL)PA組14267.69±43.15386.44±41.35PP組16292.79±65.89317.22±76.21t-1.2143.026P值0.2350.005

2.6 PEDF處理的HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF的表達(dá)

如表5所示，各不同濃度PEDF干預(yù)組和陰性對(duì)照組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=78.450，P<0.01)。隨著PEDF干預(yù)濃度增加，細(xì)胞上清液中VEGF的濃度逐漸降低，不同干預(yù)組間的差異有統(tǒng)計(jì)意義(F=39.238，P<0.01)。

表5 不同濃度PEDF處理的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF的濃度Table 5 VEGF levels in the supernatant of HUVECs treated with different concentrations of PEDF(±s，n=6)

與陰性對(duì)照組(0 nmol/L PEGF)比較，*P<0.05；與180 nmol/L PEGF組比較，#P<0.05；與360 nmol/L PEGF組比較，△P<0.05

2.7 PEDF處理的HUVEC細(xì)胞遷移能力變化

比較不同濃度PEDF處理的HUVEC細(xì)胞在平板上的遷移能力(圖3)，各干預(yù)組和陰性對(duì)照組相比，在12、24 h測量的劃痕寬度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F12 h=291.126，F(xiàn)24 h=847.419，均P<0.01)。隨著PEDF干預(yù)濃度增加，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在12、24 h測量的劃痕寬度逐漸增加，即愈合程度降低，且不同干預(yù)組間的差異有統(tǒng)計(jì)意義(F12 h=189.340，F(xiàn)24 h=660.535，均P<0.01)，見表6。

圖3 不同濃度PEDF處理的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移情況(×40)Fig.3 Cell migration of HUVECs treated with different concentrations of PEDF(×40)

PEDF(nmol/L)12h劃痕寬度(mm)24h劃痕寬度(mm)00.38±0.060.08±0.031800.63±0.04*0.19±0.05*3600.89±0.06*#0.57±0.04*#7201.27±0.10*#△0.97±0.05*#△

與陰性對(duì)照組(0 nmol/L PEDF)比較，*P<0.05；與180 nmol/L PEDF組比較，#P<0.05；與360 nmol/L PEDF組比較，△P<0.05

2.8 PEDF處理后HUVEC細(xì)胞侵襲能力的變化

比較不同濃度PEDF處理的HUVEC細(xì)胞的侵襲能力(圖4)，各干預(yù)組和陰性對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=223.748，P<0.01)。隨著PEDF干預(yù)濃度增加，侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少，各干預(yù)組間的差異有統(tǒng)計(jì)意義(F=209.726，P<0.01)，見表7。

表7 不同濃度PEDF處理的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞侵襲能力比較Table 7 Comparison of the cell invasion of HUVECs treated with different concentrations of PEDF(±s，n=15)

與陰性對(duì)照組(0 nmol/L PEDF)比較，*P<0.05；與180 nmol/L PEGF組比較，#P<0.05；與360 nmol/L PEGF組比較，△P<0.05

3 討論

兇險(xiǎn)性前置胎盤(pernicious placenta previa)是嚴(yán)重威脅母嬰預(yù)后的產(chǎn)科危重癥之一，難治性出血和高子宮切除率是其主要危害[3]。根據(jù)我科歷年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，兇險(xiǎn)型前置胎盤發(fā)病率2008～2012年平均為0.44‰，2013年為1.86‰，2014年為3.84‰，2015年為7.17‰，呈逐年倍增的趨勢(shì)。目前臨床上缺乏確診胎盤植入尤其是植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤的敏感手段，主要依靠影像學(xué)檢查如超聲及MRI[4]。在2017年聯(lián)合14個(gè)隊(duì)列研究3 889例前置胎盤和胎盤植入的Meta分析中顯示，胎盤植入形式和超聲診斷的敏感性和特異性呈正相關(guān)，但并不和診斷優(yōu)勢(shì)率(diagnostic odds ratio，DOR)呈正相關(guān)[5]，提示超聲診斷可能與超聲醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)和主觀判讀相關(guān)。由于超聲對(duì)肥胖孕婦、后壁胎盤、小范圍粘連性植入胎盤的敏感性有限，臨床上通常需要在晚孕期進(jìn)行MRI檢查進(jìn)行補(bǔ)充診斷。而MRI對(duì)兇險(xiǎn)性前置胎盤伴胎盤植入的3型accreta、increta、percreta的敏感性分別為50.0%、79.2%、80.0%[6]，也就是說大概有20%～50%的胎盤植入可能被產(chǎn)前的影像學(xué)檢查所遺漏。然而，植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤的手術(shù)準(zhǔn)備需要多學(xué)科綜合評(píng)估，術(shù)前對(duì)胎盤植入情況的估計(jì)不足甚至診斷的缺失可能導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。

色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)最初于1987年在培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞分泌產(chǎn)物中被發(fā)現(xiàn)并純化，具有抗視網(wǎng)膜新生血管形成的作用，是目前已知最強(qiáng)的血管生成抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員[7]。Dawson[8]首次發(fā)現(xiàn)PEDF可以抑制新生血管、抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移，既可抑制新生血管的形成，還可逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的血管。本研究中免疫組化染色提示PEDF主要表達(dá)于胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞中，與Plunker等[9]學(xué)者發(fā)現(xiàn)PEDF在正常妊娠婦女的脈管系統(tǒng)和胎盤的滋養(yǎng)層表達(dá)相符。另有研究證實(shí)PEDF可以通過影響胎盤血管系統(tǒng)形成從而參與子癇前期(preeclampsia)的發(fā)生發(fā)展過程[10]。本研究證實(shí)植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤患者的胎盤組織中PEDF主要定位表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，其表達(dá)量明顯低于普通前置胎盤，并與VEGF水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。由此PEDF可能通過負(fù)性調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)來抑制或逆轉(zhuǎn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的過度侵襲，是維持胎盤脈管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的靜止因子。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)PEDF與胎盤微血管密度(MVD)及胎盤植入程度(無植入→accreta→increta→percreta)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示PEDF表達(dá)量可能反映胎盤前置和植入的不同胎盤病理狀態(tài)以及植入血管的侵襲程度。盡管組間外周血PEDF水平并未顯示明顯差異，但發(fā)現(xiàn)PEDF的胎盤表達(dá)量和外周血清水平呈正相關(guān)，并且隨胎盤血管密度MVD增加和植入分型的深入出現(xiàn)表達(dá)量逐漸增加，可以設(shè)想PEDF反映了胎盤血管異常侵入子宮肌層的密度和深度，其表達(dá)水平可以作為影像學(xué)檢查的補(bǔ)充標(biāo)志物，對(duì)合并胎盤植入的前置胎盤進(jìn)行術(shù)前診斷和規(guī)劃手術(shù)路徑具有一定指導(dǎo)意義，我們將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。

圖4 不同濃度PEDF處理的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲情況(×200)Fig.4 Cell invasion of HUVECs treated with different concentrations of PEDF(×200)

在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)，PEDF能抑制肺腺癌細(xì)胞A594的遷移和侵襲能力，并且降低遷移相關(guān)蛋白FN和MMP-9的表達(dá)水平[11]。Loegl等[12]發(fā)現(xiàn)在晚孕期胎盤，PEDF通過ERK1/2和FAK的磷酸化途徑，影響VEGF誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和遷移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PEDF干預(yù)組的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著低于陰性對(duì)照組，且隨著干預(yù)濃度增加逐漸降低；而細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的VEGF水平也表現(xiàn)出同樣的情況。這些結(jié)果表明，PEDF通過VEGF抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，是血管形成過程的靜止因子，對(duì)維持血管的靜止?fàn)顟B(tài)和確保正常血管的完整性具有重要作用，可能是逆轉(zhuǎn)植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤病理性血管形成的潛在切入點(diǎn)。

目前，PEDF已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用于治療的疾病主要涉及視網(wǎng)膜病變、輔助生殖和腫瘤[13-16]。例如，Haurigot等[13]的研究通過玻璃體內(nèi)注射AAV2-Hpedf腺病毒載體，抑制VEGF下調(diào)結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達(dá)，阻止增殖型視網(wǎng)膜病變繼續(xù)發(fā)展，并且已有PEDF的制劑應(yīng)用于臨床。對(duì)罹患卵巢過激綜合征(OHSS)的模型鼠注射rPEDF可通過降低VEGF表達(dá)緩解血管炎癥，從而減輕OHSS的癥狀[14]。另外，PEDF可誘導(dǎo)嬰兒血管瘤自發(fā)退化，是嬰兒血管瘤的重要治療靶點(diǎn)[17]。本研究已通過胎盤表達(dá)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)PEDF通過調(diào)節(jié)VEGF參與植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤的異常血管形成機(jī)制，及其對(duì)維持正常的胎盤微血管床的重要作用，可以設(shè)想如果將PEDF作為發(fā)生胎盤植入的高危孕婦、尤其是多次妊娠或疤痕子宮孕婦的治療切入點(diǎn)，爭取早期干預(yù)，通過抑制病理血管的侵襲能力阻止或減輕胎盤植入的發(fā)生，將達(dá)到降低手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，改善母嬰預(yù)后的目的。

綜上所述，植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤患者的胎盤組織中PEDF主要定位表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，通過負(fù)性調(diào)節(jié)VEGF減少胎盤微血管密度以及降低侵入深度來維持胎盤脈管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，在體外能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和侵襲能力，是胎盤異常血管形成的保護(hù)因素之一。未來研究可著力于不同孕周的血清PEDF的異常改變，有望找到影像學(xué)診斷的外周血補(bǔ)充標(biāo)志物，對(duì)胎盤植入的臨床診斷具有一定的指導(dǎo)意義。如果通過外源性補(bǔ)充PEDF，抑制或逆轉(zhuǎn)血管過度侵襲，則可能抑制或者減輕胎盤植入的進(jìn)展，為植入型兇險(xiǎn)性前置胎盤的治療找到新的治療切入點(diǎn)，開啟新的思路。

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ExpressionofPEDFinPlacentaPreviaAccretaandItsEffectonMigrationandInvasionofVascularEndothelialCells

Lin Liang1，Meng Chun2，Li Rui1et al

1DepartmentofGynaecologyandObstetrics，ProvincialClinicalInstituteofFujianMedicalUniversity，F(xiàn)uzhou350001，China2PharmaceuticalBiotechnologyandEngineeringInstituteofFuzhouUniversity，F(xiàn)uzhou350001，China

ObjectiveTo explore the expression of pigment epithelium-derived factor(PEDF)in placenta previa accreta and its influence on the migration and invasion of vascular endothelial cells.MethodsTotally 14 cases of pernicious placenta previa accrete(PA)and 16 cases of placenta previa(PP)were collected between July 2014 and July 2015 from Fujian Provincial Hosptal.The location and expression of PEDF/VEGF and the microvascular vascular density(MCV)were detected in the placentas by immumohistochemical staining.The mRNA and protein expression of PEDF/VEGF was measured by RT-PCR and Western blotting，respectively.The levels of PEDF/VEGF in peripheral blood were detected by ELISA.HUVECs were primarily cultured and devided into control group and PDEF intervention groups.The cell migration and invasion were measured by wound healing assay and Transwell chamber assay.The VEGF level of the supernatant was tested by ELISA.ResultsThe mRNA and protein expression of PEDF in the placentas was significantly decreased and that of VEGF was markedly increased in PA group compared with PP group(P<0.05).PEDF expression in the placentas was negatively correlated with MVD and the depth of invasion，and positively with the serum level of PEDF(P<0.05).The cell number of migration and invasion was significantly decreased in PEDF intervention groups compared with control group(P<0.05).The migration and invasion were gradually reduced with the increase of PEDF concentration(P<0.05).ConclusionPEDF is indicative of the density of abnormal vessels in placenta previa accrete and the invasion depth.It may inhibit the migration and invasion of vascular endothelial cells.Therefore，PEDF detection may become an important diagnostic method supplementary to the imaging examinations and PEDF may become a potential therapeutic agent for placenta previa accreta.

placenta previa accreta； pigment epithelium-derived factor(PEDF)； vascular endothelial growth factor(VEGF)； microvascular vascular density(MVD)； human umbilical vein endothelial cell； migration； invasion

*福建省立醫(yī)院優(yōu)秀青年醫(yī)師項(xiàng)目(No.2014 YNQN13)；福建省自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目(No.13171069)

林 靚，女，1977年生，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，E-mail：kitty342@163.com

R714.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.05.007

(2017-04-16 收稿)