銀杏總黃酮對NAFLD大鼠脂聯(lián)素信號通路的影響*

周曉黎， 張 書， 舒 磊， 李軼西， 高曉陽， 楊家耀， 時昭紅

武漢市第一醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430022

銀杏總黃酮對NAFLD大鼠脂聯(lián)素信號通路的影響*

周曉黎， 張 書， 舒 磊， 李軼西， 高曉陽， 楊家耀， 時昭紅△

武漢市第一醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430022

目的探討銀杏總黃酮對非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)大鼠脂聯(lián)素信號通路的影響。方法利用高脂飼料喂養(yǎng)法構(gòu)建NAFLD大鼠模型。72只SPF級雄性大鼠分為正常對照組、NAFLD模型組和銀杏總黃酮治療組3組，每組24只。測定各組大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)，光鏡觀察肝臟組織形態(tài)改變，RT-PCR法檢測大鼠肝臟AdipoR2 mRNA、PPARα mRNA的表達，Western blot法檢測各組大鼠肝臟AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白表達以及AMPK蛋白磷酸化水平。結(jié)果NAFLD大鼠造模成功。第4周末，與正常對照組大鼠相比，模型組及治療組大鼠體質(zhì)量與肝指數(shù)均增高(均P<0.05)，肝臟AdipoR2 mRNA、PPARα mRNA的表達水平降低，肝臟AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白表達以及AMPK蛋白磷酸化水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；模型組與治療組相比，肝臟AdipoR2 mRNA、PPARα mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，肝臟AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白表達及AMPK蛋白磷酸化水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。第8、12周末，模型組大鼠體質(zhì)量與肝指數(shù)水平逐漸增高，肝臟AdipoR2 mRNA、PPARα mRNA的表達水平，AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白表達水平及AMPK蛋白磷酸化逐漸下降；治療組大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)逐漸接近正常對照組，肝臟AdipoR2 mRNA、PPARα mRNA的表達水平增高(均P<0.05)，AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白表達及AMPK蛋白磷酸化水平逐漸增高(均P<0.05)。結(jié)論銀杏總黃酮能控制大鼠體質(zhì)量與肝指數(shù)，提高大鼠肝臟AdipoR2 mRNA、PPARα mRNA和AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白表達水平，并使AMPK蛋白磷酸化水平升高。推測銀杏總黃酮可能通過增強脂聯(lián)素信號通路的活性，一方面減少肝細胞異常凋亡，另一方面促進線粒體內(nèi)脂肪酸的氧化，從而減輕NAFLD的肝損傷，阻止NAFLD的進展。

銀杏總黃酮； 非酒精性脂肪性肝病； 脂聯(lián)素； 信號通路

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活水平的提高，加上人口老齡化等多種因素的作用，脂肪肝及相關(guān)疾病的患病率持續(xù)增長，在我國以非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)為最常見的肝病[1]。統(tǒng)計表明患NAFLD的高危因素有：肥胖、高膽固醇飲食、不良生活方式、遺傳因素等[2]，甚至空氣污染也可能是NAFLD的危險因素[3]。NAFLD不僅導(dǎo)致肝臟的不良結(jié)局，而且可以導(dǎo)致多種肝外器官并發(fā)癥[4-5]，如慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)、心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)、2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)、癌癥[6]等。相當(dāng)數(shù)量的NAFLD患者未經(jīng)肝硬化過程即發(fā)展為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[7-8]，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。銀杏總黃酮(total ginkgo flavone-glycoides)是銀杏葉的主要有效成分，包括銀杏雙黃酮(gilobetin)，異銀杏雙黃酮(isoginkgetin)等，具有擴張血管、降血脂、抗炎、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和基礎(chǔ)代謝、抗腫瘤等功能。為研究銀杏總黃酮對NAFLD的藥理作用及可能的臨床應(yīng)用價值，本實驗建立大鼠NAFLD模型，觀察銀杏總黃酮對NAFLD大鼠肝臟組織及脂聯(lián)素信號通路中AdipoR2、PPARα和AMPK、P-AMPK等的影響，探討銀杏總黃酮對NAFLD大鼠肝臟的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

72只SPF級SD雄性大鼠，體重(100±20) g，購自湖北省實驗動物研究中心，合格證號SCXK(鄂)2015-0018，實驗單位使用許可證編號SYXK(鄂)2014-0030。銀杏總黃酮(武漢市第一醫(yī)院制劑中心制備)；Trizol試劑盒(美國Gibco公司，15596-026)；逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司M1701)；AdipoR2一抗(Santa Cruz公司，SC-46751)、PPARα一抗(Bioworld公司，BS1689)、AMPK一抗(Bioworld公司，BS1009)、P-AMPK一抗(Bioworld公司，BS5003)。光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；PCR儀(美國BIO-RAD公司)；逆轉(zhuǎn)錄儀(德國Eppendorf公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 NAFLD大鼠模型的建立 按照隨機分組原則將72只大鼠平均分為正常對照組、NAFLD模型組(簡稱模型組)、銀杏總黃酮治療組(簡稱治療組)。正常對照組采用普通飼料進行飼養(yǎng)，NAFLD模型制備參見文獻[9]。高脂食料配方：普通飼料+ 2%膽固醇+ 14%豬油。銀杏總黃酮治療組于造模第5周開始采用銀杏總黃酮250 mg/(kg·d)灌胃治療，每日1次。正常對照組及NAFLD模型組給予等量的生理鹽水灌胃。每組分別于第4、8、12周末處死8只大鼠，留取肝臟標(biāo)本。

1.2.2 肝指數(shù)測定 肝指數(shù)=肝濕重/體重3×100%。

1.2.3 病理學(xué)檢查 取部分肝組織于10%甲醛液中固定，石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色后在光鏡下觀察肝臟組織病理變化。對脂肪變性程度進行分級、評分。低倍鏡下觀察，脂滴細胞數(shù)/總細胞數(shù)>1/3即診斷為脂肪肝。

1.2.4 RT-PCR法檢測大鼠肝組織AdipoR2mRNA、PPARα mRNA的表達 用Trizol試劑盒抽提肝組織總RNA，紫外分光光度儀檢測其濃度及純度，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄，以適量cDNA為模板擴增目標(biāo)基因片段，電泳2 h，溴化乙啶溶液染色10 min；掃描，計算與β-肌動蛋白比值作為相對表達量。PCR引物序列采用Primer premier 5.0軟件設(shè)計，由上海英駿公司合成。AdipoR2mRNA基因序列號NM_001037979.1，上游引物序列5′-TGGGGATCTTTTATATGTTTCG-3′，下游引物序列5′-CATAATGCAAGGTAGGGATGAT-3′。PPARα mRNA基因序列號NM_013196.1，上游引物序列5′-AGAAGTTGCAGGAGGGGATT-3′，下游引物序列5′-CTTCTTGATGACCTGCACGA-3′。

1.2.5 Western blot法檢測大鼠肝臟AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白表達以及AMPK蛋白磷酸化水平 取肝組織勻漿約100 mg，PBS洗滌離心3次，加蛋白提取液200 μL混勻，充分研磨、裂解、離心后，取上清液，測總蛋白濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。配?0% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上樣，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉4℃封閉，用1×TBST緩沖液漂洗后加入一抗，室溫下孵育2 h，TBS洗滌，室溫下二抗孵育2 h。加顯色液1 μL，X線底片曝光，顯影、定影，掃描定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)比較

模型組大鼠在第4、8、12周末體質(zhì)量及肝指數(shù)逐步增加，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，各個時段的模型組之間比較亦有統(tǒng)計學(xué)差異(均P<0.05)。治療組第4周末與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，第8、12周末與模型組比較，體質(zhì)量及肝指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，第12周末治療組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠肝組織病理學(xué)改變

光鏡觀察正常對照組大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)完整，肝竇正常，肝細胞索排列整齊，細胞核位于細胞中央，核圓，細胞質(zhì)均勻豐富，肝細胞內(nèi)無脂肪滴沉積。NAFLD模型組肝小葉界限不清，肝細胞索排列紊亂，部分肝竇消失，肝細胞體積明顯增大，細胞核偏移，胞內(nèi)可見脂滴空泡，間質(zhì)組織中有淋巴細胞和漿細胞浸潤。銀杏總黃酮治療組肝臟損傷程度明顯減輕，脂肪變肝細胞較模型組明顯減少，肝臟結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)內(nèi)僅見少量脂肪空泡，肝細胞炎癥表現(xiàn)顯著減輕。見圖1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)的比較Table 1 Comparision of body mass and liver index of rats between groups(±s)

與同周次正常對照組比較，*P<0.05；與同周次模型組比較，#P<0.05

圖1 蘇木精-伊紅染色觀察各組大鼠肝組織病理學(xué)變化(×400)Fig.1 HE staining of rat hepatic tissues(×400)

2.3 RT-PCR法檢測大鼠肝組織AdipoR2 mRNA、PPARα mRNA表達

第4周末，模型組及治療組與正常對照組比較，AdipoR2及PPARα的mRNA表達量均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；而治療組與模型組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。第8周末，模型組、治療組與正常對照組比較，AdipoR2及PPARα mRNA表達量均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；且治療組AdipoR2及PPARα mRNA表達量較模型組均有較大提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。第12周末，模型組與正常對照組、治療組比較，AdipoR2及PPARα mRNA表達量均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；治療組水平回升，與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。正常對照組在第4、8、12周末，AdipoR2 mRNA及PPARα mRNA表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組在相應(yīng)時間段表達量逐步下降(P<0.05)；治療組在相應(yīng)時間段表達量逐步增加(P<0.05)。見圖2。

與同周次正常對照組比較，*P<0.05；與同周次模型組比較，#P<0.05圖2 大鼠肝組織中AdipoR2和PPARα mRNA表達Fig.2 Expression of AdipoR2 and PPARα mRNA in rat hepatic tissues

2.4 Western blot法檢測大鼠肝臟組織AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白表達以及AMPK蛋白磷酸化水平

第4周末，與正常對照組比較，模型組及治療組AdipoR2、PPARα、AMPK的蛋白表達量以及AMPK蛋白磷酸化水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。第8周末，模型組與治療組AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白表達以及AMPK蛋白磷酸化水平仍較正常對照組低(均P<0.05)；治療組與模型組比較，各項指標(biāo)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。第12周末，與正常對照組和治療組比較，模型組各項指標(biāo)水平均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；治療組與正常對照組比較，各項指標(biāo)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。正常對照組在第4、8、12周末，各項指標(biāo)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組各項指標(biāo)的表達水平逐步下降，組間均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組各項指標(biāo)的表達水平逐步增加，組間均數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、圖4。

圖3 Western blot檢測大鼠肝組織中AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白、AMPK蛋白磷酸化的表達Fig.3 Western blot analysis of the expression of AdipoR2，PPARα，AMPK，phosph-AMPK in rat hepatic tissues

3 討論

非酒精性脂肪肝是與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和遺傳易感密切相關(guān)的代謝性肝損傷。關(guān)于NAFLD的發(fā)病機制尚不明確。到目前為止，“二次打擊”學(xué)說[10]仍被認為是最好地解釋了NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程的理論。Zhou等[11]研究表明NAFLD患者的胰島素抵抗與脂聯(lián)素低表達相關(guān)，脂聯(lián)素單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點與NAFLD發(fā)病易感性存在相關(guān)性。脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是一種脂肪組織特異性分泌蛋白，能抑制氧化應(yīng)激、改善胰島素抵抗及炎癥反應(yīng)，具有廣泛的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及代謝調(diào)控效應(yīng)[12]。脂聯(lián)素受體目前發(fā)現(xiàn)有3種，分別是2003年Yamauchi等發(fā)現(xiàn)的AdipoR1和AdipoR2，以及后續(xù)發(fā)現(xiàn)的T鈣黏素，介導(dǎo)脂聯(lián)素生物學(xué)功能的受體主要是AdipoR1和AdipoR2。脂聯(lián)素受體在不同部位的表達程度各異且受諸多因子調(diào)控，提示其存在不同的調(diào)節(jié)機制。Handa等[13]的研究結(jié)果顯示，在嚴(yán)重NAFLD時，脂聯(lián)素水平明顯降低，本課題研究結(jié)果與之一致，提示脂聯(lián)素有保護肝臟的作用。

與同周次正常對照組比較，*P<0.05；與同周次模型組比較，#P<0.05圖4 大鼠肝組織AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白表達及AMPK蛋白磷酸化的變化Fig.4 Expression of AdipoR2，PPARα，AMPK and phospho-AMPK protein in rat hepatic tissues

在脂聯(lián)素及其受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中，有2條比較重要的傳導(dǎo)通路：過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)通路和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。PPARα下游諸多靶點和脂類、脂聯(lián)素受體緊密聯(lián)系，與脂肪酸的獲取、結(jié)合、轉(zhuǎn)運、氧化效應(yīng)以及脂蛋白質(zhì)的裝配等有關(guān)。如果PPARα及其信號通路的相關(guān)基因表達發(fā)生紊亂，可導(dǎo)致與脂質(zhì)代謝有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平的降低，出現(xiàn)脂肪酸氧化減少，脂蛋白合成代謝障礙，肝臟脂質(zhì)沉積，引起肝細胞損傷。Yamauchi等[14]在C2C12細胞中，通過脂聯(lián)素及gAcrp30干預(yù)C2C12細胞約7 h，結(jié)果顯示PPARα活性顯著增強，明顯增強脂肪酸的氧化及葡萄糖攝取。還有報道指出PPARα激動劑可激活PPARα增強脂肪酸氧化，治療脂肪性肝病[15]。王焱等[16]研究證實前胡甲素可通過激活PPARα有效抑制肝臟的炎癥反應(yīng)。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)是機體細胞內(nèi)主要的能量傳感器[17]，參與脂肪酸氧化與葡萄糖轉(zhuǎn)運，甘油三酯的合成與代謝、氧化應(yīng)激、線粒體功能等多種細胞代謝過程，也是APN信號通路的重要下游通路。脂聯(lián)素通過激活A(yù)MPK，從而激活下游靶點MAPK，增強PPARα轉(zhuǎn)錄活性及靶基因的表達水平，增加骨骼肌脂肪的氧化，減少游離脂肪酸進入肝臟。胰島素介導(dǎo)的AdipoR2-AMPK通路還可有效改善肝臟炎癥及胰島素抵抗[18]。趙霞等[19]研究表明，α-促黑色素主要通過CAMP-PKA-AMPK-ACC的途徑促進C2C12成肌細胞中的脂肪酸氧化。Tian等[20]對脂聯(lián)素刺激人海馬神經(jīng)干細胞增殖機制的研究證實，AdipoR1及AdipoR2發(fā)揮提高脂肪酸氧化及葡萄糖代謝的機制可能是通過增加脂聯(lián)素對AMPK、PPARα受體活性的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的。

Caspase-3是細胞凋亡過程中發(fā)揮主要效應(yīng)的因子[21]，激活的Caspase-3啟動Caspases級聯(lián)反應(yīng)，將細胞內(nèi)的重要蛋白降解，引起細胞凋亡。我們前期的研究工作表明，銀杏總黃酮可通過其抗氧化應(yīng)激及改善微循環(huán)等作用，抑制實驗性大鼠肝組織核因子κB(NF-κB)的活化；抑制肝星狀細胞(hepatic stellat cells，HSC)激活和增殖；已證實銀杏黃酮可促進活化的HSC凋亡，降低NAFLD大鼠血清TG、TCHOL含量，提高血清脂聯(lián)素水平，降低Caspase-3蛋白活化，抑制肝細胞的凋亡，減輕NAFLD大鼠的肝損傷。本實驗結(jié)果顯示：隨著時間延長，NAFLD模型組大鼠體質(zhì)量與肝指數(shù)水平逐漸增高，大鼠肝臟AdipoR2 mRNA、PPARα mRNA的表達水平下降，AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白及AMPK蛋白磷酸化水平逐漸下降。銀杏總黃酮治療組大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)逐漸接近正常對照組，大鼠肝臟AdipoR2 mRNA、PPARα mRNA的表達水平逐漸增高，肝臟AdipoR2、PPARα、AMPK蛋白及AMPK蛋白磷酸化水平逐漸回升。我們推測這一作用機制可能為：銀杏總黃酮提高大鼠血清脂聯(lián)素水平，一方面可降低Caspase-3蛋白活化水平，因為活化Caspase-3可促進肝細胞凋亡，所以銀杏總黃酮可降低肝細胞異常凋亡，從而保護肝細胞。另一方面，PPARα水平及AMPK磷酸化水平升高，可促使線粒體內(nèi)脂肪酸的氧化，從而發(fā)揮降脂作用?？傊?，銀杏總黃酮能有效干預(yù)脂聯(lián)素的表達模式及調(diào)節(jié)其信號通路，有望為NAFLD的治療提供新的途徑和思路。

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EffectofTotalGinkgoFlavone-glycoidesonAdiponectinSignallingPathwayinRatswithNonalcoholicFattyLiverDisease

Zhou Xiaoli，Zhang Shu，Shu Lei et al

DepartmentofGastroenterology，WuhanFirstHospital，Wuhan430022，China

ObjectiveTo examine the effect of total ginkgo flavone-glycoides on the adiponectin signalling pathy in rats with nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD).MethodsThe NAFLD rat model was established by high-fat diet.Seventy-two SPF male rats were randomly divided into normal control group，NAFLD model group and total ginkgo flavone-glycoides group，with 24 in each group.The body weight and liver index were measured.The morphological changes of the liver were observed under the light microscope.RT-PCR was used to detect the expression of AdipoR2 and PPARα mRNA in liver tissue and Western blotting to detect the expression of AdipoR2，PPARα，AMPK，phospho-AMPK.ResultsThe NAFLD model was successfully established.At the fourth weekend，the body mass and liver index were significantly increased，the levels of AdipoR2and PPARα mRNA，and those of AdipoR2，PPARα，AMPK，and phospho-AMPK protein were signficantly decreased in the NAFLD model group and total ginkgo flavone-glycoides group as compared with the normal control group(P<0.05).There were no significant differences in the levels of AdipoR2 and PPARα mRNA and the levels of AdipoR2，PPARα，AMPK，phospo-AMPK protein between the NAFLD model group and total ginkgo flavone-glycoides group(P>0.05).At the eighth and twelfth weekend，the body mass and liver indexes were further increased and the levels of AdipoR2 and PPARα mRNA，and those of AdipoR2，PPARα，AMPK，and phospho-AMPK protein were signficantly decreased in the NAFLD model group.However，these indicators were significantly improved in total ginkgo flavone-glycoides group.ConclusionTotal ginkgo flavone-glycoides can mitigate the hepatic injury and hinder the progression of NAFLD by inhibiting the hepatocyte apoptosis，promoting the oxidation of fatty acid in mitochondria，increasing the activity of adiponectin signalling pathway in the NAFLD rats.

total ginkgo flavone-glycoides； nonalcoholic fatty liver disease； adiponectin; signalling pathway

*武漢市衛(wèi)生計生委臨床醫(yī)學(xué)科研資助項目(No.2014-92-WX14C05)

周曉黎，女，1975年生，副主任醫(yī)師，E-mail：1195019687@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：zhaohshi@126.com

R285.5

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.05.008

(2017-05-25 收稿)