勐庫大葉種茶樹多酚氧化酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)

伍夢瑤，黃瑩捷，姚燕妮，黃友誼

勐庫大葉種茶樹多酚氧化酶粗酶的酶學(xué)性質(zhì)

伍夢瑤，黃瑩捷，姚燕妮，黃友誼*1

（園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院茶學(xué)系，武漢430000）

以云南大葉種代表性品種勐庫大葉種茶樹鮮葉為原料，對以硫酸銨沉淀制備的多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）粗酶進(jìn)行部分酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果表明，勐庫大葉種PPO最適反應(yīng)pH為4.4，最適反應(yīng)溫度為37℃，對焦性沒食子酸、鄰苯二酚有催化活性，而對間苯二酚、對苯二酚基本無催化活性。以焦性沒食子酸、鄰苯二酚為底物時(shí)，勐庫大葉種PPO的米氏常數(shù)（Km）分別為4.2 mmol/L和36.5 mmol/L，最大單位酶活力（Vmax）值分別為2 000 U/mL和5 000 U/mL，且對焦性沒食子酸的催化效果優(yōu)于鄰苯二酚。抑制劑乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、亞硫酸鈉、抗壞血酸和L-半胱氨酸對勐庫大葉種PPO的抑制效果均隨抑制劑濃度的增大而增強(qiáng)，其中亞硫酸鈉的抑制作用最強(qiáng)。在終濃度為0～10.00 mmol/L范圍內(nèi)，除Na+對勐庫大葉種PPO活性有一定的抑制作用外，K+、Cu2+和Mg2+對勐庫大葉種PPO活性均有不同程度的促進(jìn)作用。不同來源的茶樹PPO酶學(xué)性質(zhì)有著明顯的區(qū)別，可能與品種適制性有直接的聯(lián)系。

勐庫大葉種茶樹；多酚氧化酶粗酶；酶學(xué)性質(zhì)

多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO,EC 1.10.3.1）是一種Cu2+輔基結(jié)合酶[1]，在自然界中通常是以無活性的前體形式定位于質(zhì)體內(nèi)囊體中，由核基因編碼且由多個(gè)核基因控制，其數(shù)量、類型在不同物種和品種間均存在差異[2-3]。PPO在茶樹生長發(fā)育[4-5]和茶葉加工過程[6]中均起著重要作用，是形成發(fā)酵茶色澤與香氣的關(guān)鍵，其催化產(chǎn)物對茶葉香氣[7]、滋味[8-9]有直接影響，催化形成的茶黃素總含量與紅茶整體品質(zhì)及估值呈極顯著正相關(guān)[10]。

為探究茶樹PPO的性質(zhì)，提升茶葉品質(zhì)，茶樹PPO的分離純化與性質(zhì)分析一直以來都受到國內(nèi)外的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，不同茶樹品種的分離純化方法、最適條件及性質(zhì)均存在差異，這能在一定程度上解釋不同品種茶樹的適制性差異。這方面的研究現(xiàn)已涉及福鼎大白、福云6號(hào)、烏牛早等諸多茶樹品種[11-13]，但對遺傳信息較原始[14]、適制紅茶的云南大葉種PPO的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)選用云南大葉種代表性品種——勐庫大葉種茶樹鮮葉為原料，經(jīng)硫酸銨沉淀獲得PPO粗酶，對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為調(diào)節(jié)PPO活性和闡明云南大葉種茶樹的紅茶適制性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

勐庫大葉種茶樹（Camellia sinensis var.assamica cv.Mengku）鮮葉于2016年春季采摘自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地，采摘規(guī)格為一芽二葉。磷酸氫二鈉、聚乙烯吡咯烷酮、硫酸銨、脯氨酸、尿素、鄰苯二酚、對苯二酚、間苯二酚、焦性沒食子酸、亞硫酸鈉、抗壞血酸、L-半胱氨酸等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 勐庫大葉種PPO的制備

取茶樹鮮葉20 g，加入3 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和適量海砂，用60 mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.2）冰浴研磨均勻后，于4℃冰箱靜置浸提12 h。浸提液于4℃、9 000 r/min離心40 min后，取上清液，得PPO粗酶液Ⅰ（簡稱為PPO粗酶Ⅰ）。PPO粗酶液Ⅰ用終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的硫酸銨飽和沉淀3 h后，于4℃、9 000 r/min離心30 min，取上清液；上清液再用終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的硫酸銨飽和沉淀6 h，然后于4℃、9 000 r/min離心30 min，棄上清液，得沉淀；沉淀用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）溶解后，于4℃、3 500 r/min離心至洗脫液呈淡黃色，上清液經(jīng)脫鹽濃縮后，得到勐庫大葉種PPO粗酶液Ⅱ（簡稱為PPO粗酶），為本文研究對象。

1.3 PPO酶活性與蛋白質(zhì)含量測定

1.3.1 PPO活性測定方法

取10 μL酶液于酶標(biāo)板中，加入50 μL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 5.6）和75 μL酶反應(yīng)混合液[m（0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液）∶m（0.1%脯氨酸）∶m（1%鄰苯二酚）＝10∶2∶3，現(xiàn)配現(xiàn)用]，置于37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min后，立即加入50 μL 6 mol/L尿素終止反應(yīng)，置于酶標(biāo)儀中于410 nm下測定吸光度值。對照組中加入煮沸10 min的酶液代替。在本試驗(yàn)條件下，將反應(yīng)液的吸光度值每分鐘增加0.001定義為1個(gè)酶活力單位，U。

1.3.2 PPO蛋白濃度測定方法

依照BRADFORD法[15]，使用蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物試劑有限公司）進(jìn)行蛋白含量測定。取10 μL酶液于酶標(biāo)板中，依次加入10 μL磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.2）、200 μL G250染色液（0.01%），室溫反應(yīng)10 min，置于酶標(biāo)儀中于595 nm下測定吸光度值。以牛血清蛋白（BSA）為標(biāo)樣制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比。

1.4 不同反應(yīng)條件對PPO活性影響試驗(yàn)

1.4.1 不同pH值對PPO活性影響試驗(yàn)

依照1.3.1節(jié)的方法測定PPO酶活性，其中酶反應(yīng)緩沖液分別選用pH值為4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0的0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液。將測得的最大單位酶活力值記為100%，計(jì)算其他反應(yīng)pH下的PPO相對酶活力。

1.4.2 不同反應(yīng)溫度對PPO活性影響試驗(yàn)

依照1.3.1節(jié)的方法測定PPO酶活性，其中反應(yīng)溫度分別設(shè)置為20、25、30、35、37、40、45、50、55、60℃。將測得的最大單位酶活力值記為100%，計(jì)算其他反應(yīng)溫度下的PPO相對酶活力。

1.4.3 不同底物對PPO活性影響試驗(yàn)

依照1.3.1節(jié)的方法測定PPO酶活性，其中底物分別為鄰苯二酚、對苯二酚、間苯二酚和焦性沒食子酸溶液，各底物濃度設(shè)置為4、12、16、20、24、30 mmol/L。

1.4.4 PPO動(dòng)力學(xué)常數(shù)測定

依照1.3.1節(jié)的方法測定PPO酶活性，其中反應(yīng)底物分別選用反應(yīng)體系中終濃度分別為4、12、16、20、24、30 mmol/L的鄰苯二酚、焦性沒食子酸溶液。作反應(yīng)底物濃度與單位酶活力的雙倒數(shù)圖，根據(jù)斜率公式計(jì)算米氏常數(shù)（Km）和最大單位酶活力（Vmax）值。

1.4.5 抑制劑對PPO活性影響試驗(yàn)

依照1.3.1節(jié)的方法測定PPO活性，其中緩沖液分別選用含有乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、亞硫酸鈉、抗壞血酸（Vc）、L-半胱氨酸、檸檬酸（各抑制劑在緩沖液中的終濃度分別設(shè)置為0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mmol/L）的0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 5.6）。以未加抑制劑條件下的酶樣品單位酶活力值記為100%，計(jì)算添加不同濃度抑制劑的PPO相對酶活力。

1.4.6 金屬離子對PPO活性影響試驗(yàn)

依照1.3.1節(jié)的方法測定PPO酶活性，其中緩沖液分別選用含有Na+、K+、Cu2+、Mg2+（各金屬離子在緩沖液中的終濃度分別設(shè)置為 0、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 mmol/L）的0.1 mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 5.6）。以未加金屬離子條件下的酶樣品單位酶活力值記為100%，計(jì)算添加不同濃度金屬離子的PPO相對酶活力。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均是3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，誤差線表示3次重復(fù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用SPSS 18.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 勐庫大葉種茶樹PPO粗酶的制備

經(jīng)勻漿浸提法提取勐庫大葉種茶樹PPO后，分別以終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、80%的硫酸銨對其進(jìn)行沉淀和脫鹽濃縮，得到PPO粗酶液Ⅱ（后簡稱為PPO粗酶）。由表1可看出，經(jīng)硫酸銨沉淀后，總酶活雖略有降低，但比活力和純化倍數(shù)依次升高。總酶活回收率為70.71%，表明制備獲得大部分勐庫大葉種PPO。經(jīng)測定，PPO粗酶的單位酶活為3 493.33 U/mL，比活力為5 744.26 U/mg。

2.2 不同pH值對PPO粗酶活性的影響

在不同pH值的緩沖液中測定勐庫大葉種PPO粗酶的活性。結(jié)果（圖1）顯示：當(dāng)pH為4.4時(shí)，PPO酶活性達(dá)到最大值；當(dāng)pH降為4.0時(shí)，PPO相對酶活性為90.48%，極顯著低于pH 4.4時(shí)的活性（p＜0.01）；當(dāng)pH從4.4逐漸增加到8.0時(shí)，PPO酶活性逐漸下降，且相互之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的極顯著差異（p＜0.01）。COGGON等[11]測得美國立頓茶園的茶樹鮮葉PPO粗酶最適pH為5.7；趙淑娟等[16]測得櫧葉齊茶樹PPO粗酶的最適pH為5.6；孫慕芳等[17]測得信陽群體種茶樹PPO粗酶的最適pH為5.5。以上的茶樹PPO最適pH均大于5.0，而在本試驗(yàn)中，勐庫大葉種茶樹PPO粗酶的最適pH呈偏酸性（pH 4.4），與這些報(bào)道存在明顯差異。結(jié)合紅茶發(fā)酵葉pH值逐漸降低的變化趨勢[18]，這可能是導(dǎo)致云南大葉種在茶樹品種特性、茶類適制性等方面區(qū)別于其他茶樹品種的內(nèi)在原因之一。

表1 勐庫大葉種茶樹PPO純化結(jié)果Table 1 Purification of PPO isolated from Camellia sinensis var.assamica cv.Mengku

圖1 勐庫大葉種茶樹PPO粗酶在不同反應(yīng)pH值下的相對酶活性Fig.1 Relative enzymatic activity of crude PPO under differentreaction pH values

2.3 反應(yīng)溫度對PPO粗酶活性的影響

在不同反應(yīng)溫度下測定勐庫大葉種PPO粗酶的活性，結(jié)果見圖2。從中可知：在反應(yīng)溫度從20℃增至60℃的過程中，PPO粗酶的相對酶活性整體呈現(xiàn)出先增大后減少的變化趨勢，且在37℃時(shí)的相對酶活性最高；當(dāng)反應(yīng)溫度由20℃升至30℃過程中，PPO相對酶活性由51.00%逐漸增至63.47%，相互間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；反應(yīng)溫度從30℃上升到35℃時(shí)，PPO相對酶活性由63.47%陡然增至97.70%，相互之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著差異（p＜0.01）；在35～40℃之間，PPO相對酶活性保持穩(wěn)定，且相互間無顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)反應(yīng)溫度升高到45℃時(shí)，PPO相對酶活性呈現(xiàn)極顯著的下降（p＜0.01）；之后隨反應(yīng)溫度的上升，PPO相對酶活性均表現(xiàn)為極顯著的下降（p＜0.01）；至反應(yīng)溫度為55℃和60℃時(shí)，PPO粗酶的相對酶活性分別降至35.97%和16.89%。茶樹PPO的最適反應(yīng)溫度隨品種與生長條件的不同而各有差異：櫧葉齊茶樹PPO的最適反應(yīng)溫度為50℃[16]；信陽群體種茶樹PPO的最適反應(yīng)溫度為35～40℃[17]；以采自四川同一茶園的名山131、福鼎大白茶、福選9號(hào)、烏牛早和平陽特早為酶源制得的PPO最適反應(yīng)溫度均為45℃[19]。由此可見，云南大葉種PPO粗酶最適反應(yīng)溫度與信陽群體種相似，但低于其他很多茶樹品種的PPO最適反應(yīng)溫度。

圖2 勐庫大葉種茶樹PPO粗酶在不同反應(yīng)溫度下的相對酶活性Fig.2 Relative enzymatic activity of crude PPO at different reaction temperatures

2.4 不同底物對PPO粗酶活性的影響

選擇鄰苯二酚、對苯二酚、間苯二酚和焦性沒食子酸為反應(yīng)底物，分別以不同濃度進(jìn)行酶反應(yīng)，測得勐庫大葉種PPO粗酶的酶活性。結(jié)果（圖3）表明：以對苯二酚和間苯二酚為底物時(shí)，在較高底物濃度（30 mmol/L）條件下PPO粗酶的單位酶活仍舊很低，接近于0；而以鄰苯二酚和焦性沒食子酸為反應(yīng)底物時(shí)，均能在較低的底物濃度時(shí)就顯現(xiàn)出較高的單位酶活力，其中當(dāng)?shù)孜餄舛葹? mmol/L時(shí)，PPO粗酶的單位酶活分別為492.22 U/mL和1 030.00 U/mL。純化自碧螺春鮮葉原料的PPOⅠ對上述底物均有催化活性，而其PPOⅡ?qū)Ρ蕉訜o催化能力[13]；鳳慶PPOⅠ和PPOⅡ?qū)ι鲜龅孜锛皼]食子酸均表現(xiàn)出催化活性[20]；純化自土耳其黑海地區(qū)茶葉的PPO對鄰苯二酚、4-甲基鄰苯二酚和焦性沒食子酸均有催化活性，而對沒食子酸無催化活性[12]；純化自白毫早[21]、龍井43[22]、福云6號(hào)[23]、烏牛早等[19]茶樹品種的PPO均能以鄰苯二酚為底物進(jìn)行催化反應(yīng)。這表明來自不同茶樹品種的PPO對底物具有選擇性，而這種催化活性差異可能會(huì)對各茶樹品種的適制性產(chǎn)生影響。

圖3 勐庫大葉種茶樹PPO粗酶在不同底物條件下的相對酶活性Fig.3 Relative enzymatic activity of crude PPO under different substrate conditions

2.5 PPO粗酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)

依據(jù)勐庫大葉種PPO對底物的選擇性（圖3），分別以鄰苯二酚、焦性沒食子酸為底物，以雙倒數(shù)作圖法測定勐庫大葉種PPO粗酶的酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)（Km）。結(jié)果（圖4）表明：以鄰苯二酚為底物時(shí)，Km為36.5 mmol/L，Vmax為5 000 U/mL；以焦性沒食子酸為底物時(shí)，Km為4.2 mmol/L，Vmax為2 000 U/mL。根據(jù)Vmax/Km比值，勐庫大葉種PPO粗酶對焦性沒食子酸的Vmax/Km大于鄰苯二酚，表明其對底物焦性沒食子酸具有更好的催化效果。以鄰苯二酚為底物時(shí)，信陽群體種PPO酶的Km為140.6 mmol/L[17]，鳳慶PPOⅠ和Ⅱ的Km分別為4.424和3.457 mmol/L，Vmax（單位時(shí)間內(nèi)在460 nm波長處的吸光度值）分別為0.146和0.305[20]，而龍井43號(hào) PPOⅡ的Km和Vmax（單位時(shí)間內(nèi)在460 nm波長處的吸光度值）分別為13.05 mmol/L和0.019[24]，龍井43號(hào) PPOⅠ和Ⅲ的Km分別為91.34和51.65 mmol/L[22]；以焦性沒食子酸為底物時(shí)，鳳慶PPOⅡ的Km為3.455 mmol/L，Vmax（單位時(shí)間內(nèi)在460 nm波長處的吸光度值）為0.291[20]。這說明同一種PPO對不同底物的親和力不同，PPO與某一底物間的親和力與酶源及同工酶構(gòu)成有關(guān)。

圖4 勐庫大葉種茶樹PPO粗酶催化不同底物的雙倒數(shù)關(guān)系圖Fig.4 Double reciprocal plots of crude PPO using catechol and pyrogallic acid as substrate

2.6 不同抑制劑對PPO粗酶活性的影響

在0～1.00 mmol/L濃度范圍內(nèi)，不同抑制劑對勐庫大葉種PPO粗酶活性的影響如圖5所示。從中可知：在0～1.00 mmol/L濃度范圍內(nèi)，盡管檸檬酸濃度的增加使PPO活性略微增加，但其影響未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著水平（P＞0.05）。隨著EDTA-2Na濃度的增加，PPO相對酶活性呈顯著下降的趨勢（p＜0.05），但當(dāng)濃度高達(dá)1.00 mmol/L時(shí)，相對酶活性依然維持在96.36%（抑制率僅為3.64%）。PPO相對酶活性隨著亞硫酸鈉、抗壞血酸、L-半胱氨酸濃度的增加，均呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢（p＜0.05），其中：當(dāng)亞硫酸鈉濃度增加到0.50 mmol/L時(shí)，已測不出PPO相對酶活性；當(dāng)抗壞血酸濃度為0.50 mmol/L時(shí)，PPO相對酶活性僅剩27.22%，當(dāng)濃度為1.00 mmol/L時(shí)則僅剩1.66%；當(dāng)L-半胱氨酸濃度為0.20 mmol/L時(shí)，PPO相對酶活性僅剩39.47%，而當(dāng)濃度為0.50 mmol/L時(shí)僅剩12.87%。由此可見，亞硫酸鈉和L-半胱氨酸對勐庫大葉種PPO酶活性抑制最強(qiáng)，其次為抗壞血酸，而EDTA-2Na和檸檬酸在本試驗(yàn)條件下對PPO酶活性的影響相對較小。

趙淑娟等[16]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗壞血酸、亞硫酸鈉和L-半胱氨酸的添加量分別達(dá)到0.2、0.3、0.4 mmol/L時(shí)，均可完全抑制櫧葉齊茶樹PPO的活性；虞昕磊[20]在研究不同抑制劑對鳳慶茶樹PPO同工酶活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸的抑制效果強(qiáng)于亞硫酸鈉；陳昌輝等[19]研究發(fā)現(xiàn)，添加相同濃度的抗壞血酸、EDTA和NaCl均能抑制名山131、福鼎大白茶等5種茶樹PPO的活性，且抗壞血酸的抑制效果最佳；許雷[22]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗壞血酸和L-半胱氨酸的添加量為0.1 mmol/L時(shí)可完全抑制龍井43號(hào)PPOⅠ的活性，而當(dāng)亞硫酸鈉的添加量為0.2 mmol/L時(shí)才能達(dá)到相同的抑制效果。上述研究結(jié)果與本試驗(yàn)得到的結(jié)果存在一定差異，說明抑制劑對不同PPO酶活性的抑制效果存在差異。這可能是由于不同來源的PPO及不同PPO同工酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，使得各抑制劑的作用效果存在差異。

圖5 不同抑制劑對勐庫大葉種茶樹PPO粗酶活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of inhibitors on the activities of crude PPO

2.7 金屬離子對PPO粗酶活性的影響

在不同金屬離子濃度下，勐庫大葉種PPO粗酶活性的變化情況如圖6所示。從中可知：隨Na+濃度的增加，PPO酶活顯著下降（p＜0.05），但當(dāng)Na+濃度高達(dá)10.00 mmol/L時(shí)，PPO相對酶活性依然有78.68%。隨K+、Mg2+濃度的增加，PPO酶活均呈現(xiàn)出整體增加的趨勢，且不同Mg2+濃度間的PPO活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異（P＞0.05），但不同K+濃度間的PPO活性大多具有顯著差異（p＜0.05）。當(dāng)Cu2+濃度在0～1.00 mmol/L之間時(shí)對PPO酶活性無顯著影響，但達(dá)到5.00 mmol/L和10.00 mmol/L時(shí)，PPO酶活性極顯著地增加了142.19%和172.85%（p＜0.01）。以往的研究顯示：在0.1～10.0 mmol/L濃度范圍內(nèi)，Na+、K+均能對碧螺春PPOⅠ、PPOⅡ產(chǎn)生不同程度的抑制作用，Cu2+能抑制碧螺春PPOⅠ的活性，但對碧螺春PPOⅡ活性有促進(jìn)作用，Mg2+也對碧螺春PPOⅡ活性有促進(jìn)作用[13]；在0.1～1.5 mmol/L濃度范圍內(nèi)，Na+能顯著抑制茄子的PPO活力，而2.0～4.0 mmol/L的Cu2+則對茄子PPO活性有促進(jìn)作用，0.5～4.0 mmol/L的Mg2+使茄子PPO活性有所增加，但各數(shù)值間無顯著差異[25]；在0～3.0×10－4mmol/L濃度范圍內(nèi)，添加Cu2+對鳳慶PPOⅠ、PPOⅡ活力的影響呈鐘形變化，其酶活性分別在Cu2+濃度為1.0×10－4、0.5×10－4mmol/L時(shí)達(dá)到最高[20]。這說明部分金屬離子可對PPO酶活性產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用，其中Na+、K+和Mg2+對PPO酶活性的影響規(guī)律在不同品種間表現(xiàn)出較高的一致性，但其影響程度隨PPO來源及PPO同工酶的不同而有所差異。

圖6 不同金屬離子對勐庫大葉種茶樹PPO粗酶活性的影響Fig.6 Effects of different concentrations of metal ions on the activities of crude PPO

3 討論

3.1 PPO的最適反應(yīng)pH

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)勐庫大葉種PPO粗酶的最適反應(yīng)pH為4.4，酶活力在酸性條件下整體上較堿性條件下高。通過對比前人的研究可以發(fā)現(xiàn)，不同品種間茶樹PPO的最適pH存在差異[11,16-17]，這很可能是產(chǎn)生不同品種適制性的原因。在紅茶渥紅發(fā)酵過程中，發(fā)酵葉的pH值整體呈現(xiàn)降低的趨勢[18]，本研究勐庫種茶樹PPO的最適pH偏酸性意味著其更易適應(yīng)紅茶發(fā)酵過程中pH降低的變化，從而在發(fā)酵過程中易保持較高的酶活性，促進(jìn)渥紅發(fā)酵，因此勐庫種茶樹更適制紅茶。徐斌[26]的研究表明，偏酸性條件更利于與紅茶品質(zhì)相關(guān)的茶黃素的形成，且茶黃素在酸性條件下更穩(wěn)定。勐庫大葉種茶樹適制紅茶可能與其PPO的最適pH偏酸性有關(guān)。我們已有的研究結(jié)果表明，勐庫大葉種茶樹PPO在偏酸性下更有利于催化合成酯型茶黃素[27]，這也可能是云南大葉種適制紅茶的根本原因。適制綠茶的品種如龍井 43 號(hào)[24]、碧螺春[13]、烏牛早[19]的最適 pH 分別為6.0、6.5和8.6，明顯高于勐庫大葉種茶樹PPO的最適pH，這也較好地支持了這一推斷。在茶樹PPO粗酶中存在多條PPO同工酶，其最適pH會(huì)受到同工酶的數(shù)量、比例及性質(zhì)的影響。本課題組以往的研究[28]發(fā)現(xiàn)，龍井43號(hào)的PPO粗酶在pH 5.2和8.0下有2個(gè)酶活力峰值，但其分離得到的同工酶PPOⅢ-2和PPOⅤ-3的最適pH均為4.4，表明PPO粗酶的最適pH并非其內(nèi)含同工酶最適pH的簡單加成，兩者間可能存在更為復(fù)雜的聯(lián)系，有待于深入探討。

3.2 PPO的最適反應(yīng)溫度

發(fā)酵是紅茶品質(zhì)特征成分形成的關(guān)鍵時(shí)期，而PPO在這一過程中起了重要作用[29]。發(fā)酵溫度的變化能對PPO活性進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響紅茶品質(zhì)的形成。本試驗(yàn)測得勐庫種茶樹PPO粗酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，在反應(yīng)溫度為35～45℃時(shí)的相對酶活均高于94%，在反應(yīng)溫度為25～30℃時(shí)的相對酶活約60%。在傳統(tǒng)的紅茶生產(chǎn)中發(fā)酵時(shí)的葉溫一般控制在30℃，氣溫一般為24～25℃[30]，此時(shí)勐庫種茶樹PPO的活性較為適宜，不會(huì)因酶活性過高而導(dǎo)致茶黃素含量的降低和茶褐素的大量累積[31]，且與紅茶品質(zhì)呈正相關(guān)的茶黃素和茶紅素都能夠較多地生成與保存[32]。提取自福鼎大白茶、烏牛早等茶樹品種的PPO的最適反應(yīng)溫度均高于37℃，在反應(yīng)溫度為25℃時(shí)的相對酶活較低[19]，因此，在25℃下發(fā)酵可能會(huì)因PPO活性過低而影響茶黃素[28]、香氣物質(zhì)等紅茶品質(zhì)成分[32]的形成。這可能是勐庫種茶樹鮮葉的紅茶適制性優(yōu)于其他品種茶樹鮮葉的原因之一。

3.3 PPO的蛋白結(jié)構(gòu)推測

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)亞硫酸鈉對勐庫大葉種PPO粗酶的抑制作用最強(qiáng)，而大多數(shù)研究都顯示抗壞血酸對PPO 的抑制效果最佳，優(yōu)于亞硫酸鈉[13，16，20，22，33]?？箟难岷蛠喠蛩徕c對PPO的抑制機(jī)制不同：前者是抗氧化劑，主要通過降低氧含量來抑制酶促反應(yīng)，也能將醌還原成酚從而抑制PPO的活力[19]；后者能還原PPO活性中心的Cu2+，使其失活，同時(shí)能與鄰醌發(fā)生不可逆的加成反應(yīng)[23]，抑制酶活性?；谄湟种茩C(jī)制的差異性，結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，我們推測勐庫種茶樹由于在進(jìn)化上保留了茶樹原始特性[14]，其攜帶的PPO編碼基因可能與其他茶樹品種差異較大，具體表現(xiàn)為勐庫大葉種PPO蛋白比其他酶源的PPO蛋白存在更多可與亞硫酸鈉以共價(jià)鍵結(jié)合的必需基團(tuán)，或其活性中心的Cu2+輔基相對較少，使得亞硫酸鈉對其抑制效果更強(qiáng)。而勐庫大葉種PPO的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是否與其他品種茶樹PPO存在較大差異，以及是否具有一定的規(guī)律性等問題，都值得進(jìn)一步研究。

3.4 Cu2+對PPO活性的影響

PPO的活性中心含有Cu2+，一般認(rèn)為Cu2+是影響茶樹 PPO 活性的重要因素[13，20，22，24]。在本試驗(yàn)中，EDTA-2Na、亞硫酸鈉等抑制劑都可有效抑制勐庫大葉種PPO粗酶活性，其中EDTA-2Na可通過與PPO的輔基Cu2+螯合來實(shí)現(xiàn)對PPO粗酶的抑制[19]，而亞硫酸鈉可通過將Cu2+還原為Cu+來抑制PPO粗酶的活性[23]，其抑制機(jī)制都涉及與輔基Cu2+的相互作用，表明Cu2+與茶樹PPO活性息息相關(guān)。張書芹[24]以龍井43號(hào)PPO同工酶為研究對象，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加的Cu2+濃度為0.25×10－4mmol/L時(shí)PPOⅡ活性最高，之后酶活性隨添加的Cu2+濃度的增加而呈波動(dòng)狀態(tài)減?。挥蓐坷赱20]以鳳慶PPO同工酶為研究對象，發(fā)現(xiàn)PPOⅠ和PPOⅡ分別在Cu2+濃度為0.50×10－4、1.00×10－4mmol/L時(shí)的活力最大，之后隨濃度的增加同樣呈波動(dòng)狀態(tài)降低。兩者都認(rèn)為添加Cu2+對PPO活性的影響表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)、高濃度抑制。陳盛虎[28]在探究Cu2+對龍井43號(hào)PPO同工酶活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cu2+濃度在0.1～10 mmol/L時(shí)，酶活力隨濃度增加依次增大，當(dāng)Cu2+濃度超過25 mmol/L后開始出現(xiàn)抑制作用，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本吻合，但與張書芹[24]和虞昕磊[20]的結(jié)果存在差異。由此推測：Cu2+對PPO活性的影響可能是隨Cu2+濃度的增大表現(xiàn)出先增后降交替出現(xiàn)的波動(dòng)式的變化趨勢；Cu2+除了與PPO催化活性中心結(jié)合外，還可能與底物或PPO的其他部分結(jié)合來抑制酶活性，而這2種結(jié)合方式應(yīng)該都是可逆的，且存在競爭關(guān)系，有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

相較于其他品種的茶樹PPO，勐庫大葉種茶樹PPO粗酶的最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度均較低，有利于茶黃素和茶紅素等成分的形成與積累，這可能與勐庫大葉種茶樹適制紅茶的特性有關(guān)。勐庫大葉種茶樹PPO粗酶對焦性沒食子酸的催化活性大于鄰苯二酚，而對對苯二酚和間苯二酚幾乎沒有催化活性。勐庫大葉種茶樹PPO粗酶的最有效抑制劑為亞硫酸鈉，而前人提取自櫧葉齊、碧螺春、龍井43號(hào)等茶樹品種PPO粗酶的最有效抑制劑均為抗壞血酸。在本研究中，Na+、K+和Mg2+對勐庫大葉種茶樹PPO粗酶活性的影響與前人的研究結(jié)果高度一致，其中Na+表現(xiàn)出抑制作用，K+和Mg2+則表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)作用。在本試驗(yàn)中，Cu2+對勐庫大葉種茶樹PPO粗酶活性有極強(qiáng)的促進(jìn)作用，但綜合本課題組以往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加Cu2+對勐庫大葉種茶樹PPO粗酶活性的影響與劑量的選擇存在一定聯(lián)系。不同茶樹品種PPO酶學(xué)特性的差異可能是導(dǎo)致品種適制性的原因之一，這可能與其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)。本文對勐庫大葉種茶樹PPO酶學(xué)特性的研究，有利于更好地對PPO活性進(jìn)行調(diào)控，從而為紅茶生產(chǎn)中的品質(zhì)控制與茶黃素體外制備的條件優(yōu)化提供理論依據(jù)。

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Characterization of crude polyphenol oxidase isolated from Camellia sinensis var.assamica cv.Mengku.Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2017,43(5):579-588

WU Mengyao,HUANG Yingjie,YAO Yanni,HUANG Youyi*
(Ministry of Education Key Laboratory of Horticultural Plant Biology/Department of Tea Science,College of Horticulture and Forestry Sciences,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430000,China)

Camellia sinensis var.assamica cv.Mengku;crude polyphenol oxidase;enzymatic characterization

S 571.1

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2017.02.121

Summary Polyphenol oxidase(PPO,EC 1.10.3.1)has great significance to the growth and development of Camellia sinensis,for instance it participates in adjusting and maintaining the normal physiology and metabolism,plays an essential role in the course of the quality formation of tea products,and contributes to the oxidation reaction of tea polyphenols.The oxidation products,such as quinines,theaflavins and thearubigins,have a remarkable effect on the quality of black tea.The existing researches of C.sinensis PPO involve in various varieties and multiple aspects,including separation and purification,enzymatic property analysis,genetic structure,etc.Nevertheless,there is no research on C.sinensis var.assamica cv.Mengku,even though it carries relative original genetic information and has a great suitability for black tea manufacture.

In this study,the fresh leaves of Camellia sinensis var.assamica cv.Mengku were used as materials.The crude polyphenol oxidase(PPO)from tea leaves was extracted by using homogenate extraction technology and purified through(NH4)2SO4precipitation.The characteristics including optimum reaction pH,optimum reaction temperature,substratespecificity,Michaelis-Menten constants and the effect of inhibitors and metal ions on its activity were studied.It aims to lay the foundation for regulating PPO activity and illuminating the suitability for black tea manufacture of C.sinensis var.assamica.

國家自然科學(xué)基金（31270731）。

黃友誼（http://orcid.org/0000-0001-5735-2830），E-mail:youyi@mail.hzau.edu.cn

（First author）：伍夢瑤（http://orcid.org/0000-0001-8577-5304），E-mail:1062684346@qq.com

2017-02-12；接受日期（Accepted）：2017-05-03

The results showed that the optimum pH of crude PPO was 4.4,and its optimum temperature was 37℃.It had the catalytic activity on catechol and pyrogallic acid,but not on hydroquinone and resorcinol.When pyrogallic acid and catechol as its substrate,their Kmvalues were 4.2 and 36.5 mmol/L,respectively,and their Vmaxvalues were 2 000 and 5 000 U/mL,respectively,indicating that the catalytic efficiency of pyrogallic acid was better.The inhibition of EDTA-2Na,sodium sulfite,ascorbic acid and L-cysteine on crude PPO was enhanced with the increasing concentration,and sodium sulfite had the strongest inhibitory effect on it,while EDTA-2Na showed the lowest inhibitory rate,with 3.64%in 1.00 mmol/L.In this experimental condition,citric acid showed no inhibitory effect on crude PPO,on the contrary its activity was slightly increased(P＞0.05).Na+had inhibition action on the crude PPO,whereas both K+and Mg2+showed a promotion effect on the crude PPO.Cu2+of 10 mmol/L increased the enzymatic activity of crude PPO to 172.85%,which shows that Cu2+has a strong promotion effect on the crude PPO.

In conclusion,the relative lower optimal pH and optimum reaction temperature of the crude PPO are advantageous to the formation of main quality components in black tea,particularly the formation of theaflavins,which may account for that C.sinensis var.assamica cv.Mengku is fit to manufacture black tea.The characteristics of the crude PPO,which was extracted and purified from C.sinensis var.assamica cv.Mengku,show visible differences with other varieties.This may be caused by discrepancy of protein structure,and lead to suitability for manufacture of tea varieties.