羅氏沼蝦谷氨酸脫氫酶基因克隆及其在MrTV感染下的組織表達(dá)分析

鄭群艷，潘曉藝，沈錦玉,，陳少波,3*，徐洋，許婷

羅氏沼蝦谷氨酸脫氫酶基因克隆及其在MrTV感染下的組織表達(dá)分析

鄭群艷1，潘曉藝2，沈錦玉1,2，陳少波1,3*，徐洋2，許婷21

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院-生命科學(xué)學(xué)院，浙江溫州325035；2.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江省魚(yú)類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江湖州313001；3.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江溫州325005）

本研究利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆獲得羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase,GDH）基因（MrGDH）的cDNA全長(zhǎng)序列，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并檢測(cè)該基因在羅氏沼蝦不同組織中的表達(dá)差異；同時(shí)，利用羅氏沼蝦太湖病毒（Macrobrachium rosenbergii Taihu virus,MrTV）感染沼蝦，研究感染前后沼蝦鰓和肝胰腺M(fèi)rGDH的轉(zhuǎn)錄特征。結(jié)果顯示，MrGDH基因cDNA序列全長(zhǎng)2 257 bp，擁有一個(gè)1 662 bp長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框，合計(jì)編碼氨基酸553個(gè)，合成的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為61.37 kDa。MrGDH氨基酸序列與中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）、凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的同源性較高，達(dá)到92%，其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)與黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）以及家蠶（Bombyx mori）高度相似，說(shuō)明MrGDH氨基酸序列比較保守。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）結(jié)果顯示，MrGDH基因在與機(jī)體運(yùn)動(dòng)和代謝有關(guān)的組織中表達(dá)量較高，其中在肌肉中表達(dá)量最高，而在血淋巴中最低。羅氏沼蝦受MrTV病毒感染48 h，肝胰腺和鰓中MrGDH基因的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均極顯著高于對(duì)照組（p＜0.01）；感染72 h，鰓中MrGDH基因表達(dá)顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），肝胰腺中MrGDH基因表達(dá)極顯著高于對(duì)照組（p＜0.01）：說(shuō)明MrTV感染脅迫可以刺激羅氏沼蝦MrGDH的表達(dá)上調(diào)。

羅氏沼蝦；羅氏沼蝦太湖病毒；谷氨酸脫氫酶；基因克??；組織表達(dá)差異

谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）是一種結(jié)構(gòu)保守的蛋白酶，主要有四聚體和六聚體2種形式，在動(dòng)物、植物、微生物等生物體中廣泛存在，主要催化α-酮戊二酸和谷氨酸之間的可逆反應(yīng)，是谷氨酸生物合成中一種依賴輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADP）的關(guān)鍵酶；按依賴輔酶的類型可將谷氨酸脫氫酶分為專一利用NAD作為輔酶的GDH、專一利用NADP作為輔酶的GDH，以及能利用NAD和NADP作為輔酶的GDH 3種類型[1-2]。大多數(shù)微生物只具備1種GDH[1-4]；高等植物的GDH一般以NAD為輔酶，對(duì)其體內(nèi)氮代謝至關(guān)重要[2,5]；動(dòng)物能以NAD和NADP為輔酶，其中以NAD作輔酶時(shí)催化效率較高[2]。GDH催化的反應(yīng)是動(dòng)物獲得能量腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）的重要途徑，也是α-酮酸類在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的主要途徑，充當(dāng)著連接谷氨酸和三羧酸循環(huán)的橋梁，在甲殼類動(dòng)物氨氮代謝過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用[6-8]。

目前與甲殼類動(dòng)物谷氨酸脫氫酶相關(guān)的報(bào)道較少。2009年，LI等[9]克隆了凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）的GDH基因。2010年，熊澤泉[10]研究了5種十足目甲殼動(dòng)物的GDH序列片段，發(fā)現(xiàn)GDH氨基酸序列十分保守，而在脊椎動(dòng)物與無(wú)脊椎動(dòng)物中存在差異。2012年，WANG等[11]克隆出了中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）的GDH基因，發(fā)現(xiàn)其對(duì)甲殼動(dòng)物具有重要的滲透調(diào)節(jié)作用。2014年，李少飛[7]克隆出了中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）的GDH基因并對(duì)其進(jìn)行了功能分析。2015年，劉勝男等[12]的研究表明，在氨氮脅迫下，三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的鰓組織及肝胰腺中GDH基因表達(dá)都有不同程度的上調(diào)。2016年，周發(fā)林等[8]克隆了斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）的GDH基因，并研究了該基因在氨氮脅迫下的時(shí)空表達(dá)情況；同年，LI等[13]發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦受白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus,WSSV）感染后，GDH的表達(dá)在一定時(shí)間里出現(xiàn)了上調(diào)，并通過(guò)將谷氨酸催化成α-酮戊二酸為三羧酸（tricarboxylic acid,TCA）循環(huán)提供能量來(lái)維持WSSV病毒復(fù)制。但迄今為止，尚未見(jiàn)有關(guān)羅氏沼蝦谷氨酸脫氫酶（MrGDH）的報(bào)道。

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）也被稱為馬來(lái)西亞大蝦，屬十足目長(zhǎng)臂蝦科，生長(zhǎng)在淡水或咸淡水中，其個(gè)體大，食性廣，肉質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量較高的蝦類品種之一[14-15]。隨著1980年后人工養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，羅氏沼蝦的養(yǎng)殖范圍遍布我國(guó)大部分省市，為養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)效益。隨著羅氏沼蝦養(yǎng)殖的逐漸擴(kuò)大化，各種制約羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的問(wèn)題紛至而來(lái)，除了受養(yǎng)殖品種本身的免疫防御及養(yǎng)殖環(huán)境的影響外，病原體也是一個(gè)非常重要的因素。由細(xì)菌或病毒引起的水產(chǎn)疾病普遍發(fā)病快、影響范圍廣、發(fā)病率高，是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展極為重要的原因之一。2010年被發(fā)現(xiàn)和命名的羅氏沼蝦太湖病毒（Macrobrachium rosenbergii Taihu virus,MrTV）是雙順?lè)醋硬《究浦幸环N新型的RNA病毒，其基因組為單一正鏈RNA，含2個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame,ORF），病毒粒子為二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，無(wú)囊膜，有單層衣殼；其敏感宿主主要是羅氏沼蝦幼體，致死率達(dá)到80%～90%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)95%以上[16-17]。本研究利用cDNA末端快速擴(kuò)增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技術(shù)獲得了MrGDH基因的cDNA全長(zhǎng)，從序列、結(jié)構(gòu)及同源性等方面對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）技術(shù)測(cè)定該基因在羅氏沼蝦各組織中的表達(dá)情況；此外，用MrTV感染羅氏沼蝦，并檢測(cè)MrGDH基因在不同組織的表達(dá)差異，旨在為甲殼類動(dòng)物MrGDH的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

MrTV陰性羅氏沼蝦活體購(gòu)自浙江省湖州市南太湖水產(chǎn)種業(yè)有限公司。選取7日齡羅氏沼蝦幼體用于MrGDH基因克??；選取體長(zhǎng)（14±2）cm、體質(zhì)量（24±2.1）g的羅氏沼蝦成蝦50只，用于MrGDH基因在MrTV病毒感染脅迫下的組織表達(dá)分析；MrTV陽(yáng)性樣品由浙江省淡水水產(chǎn)研究所魚(yú)病研究室保存。

1.2 MrGDH基因的cDNA克隆

參考cDNA文庫(kù)測(cè)序得到的EST序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，并由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，序列見(jiàn)表1。采用TIANGEN總RNA提取試劑盒提取羅氏沼蝦幼體總RNA，并利用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，將RNA保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

以RNA為模板，GDH-Race-100R與GDH-332R引物用于5'端RACE PCR，GDH-Race-23F與GDH-36F用于3'端RACE PCR，具體步驟參照SMARTerTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒（Clontech公司，美國(guó)）說(shuō)明書(shū)。其中RACE cDNA擴(kuò)增試驗(yàn)重復(fù)3次，每次送測(cè)序的陽(yáng)性克隆5個(gè)。以總RNA為模板，采用TIANGEN FastQuant cDNA第1鏈合成試劑盒合成cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR和已知片段的驗(yàn)證，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 MrGDH基因序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)MrGDH基因全長(zhǎng)進(jìn)行BLAST分析與氨基酸序列預(yù)測(cè)；用MEGA 6.0和ClustalX2對(duì)氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)[8]，且將比對(duì)過(guò)的序列用GeneDoc進(jìn)行編輯。蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)在ExPASy中進(jìn)行[8,10]；在EMBL-EBI中分析MrGDH蛋白的結(jié)構(gòu)域[7]；蛋白信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)以及位置預(yù)測(cè)均在生物序列分析中心（Center for Biological Sequence Analysis,CBS）[10,18]中進(jìn)行。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用GOR IV[8,18]二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)法；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過(guò)SWISS-MODEL[7,10,18]軟件進(jìn)行。除了選取BLAST比對(duì)結(jié)果中與MrGDH氨基酸序列同源性較高的序列之外，還檢索了代表性物種的GDH氨基酸序列，用MEGA 6.0軟件對(duì)這些氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建GDH進(jìn)化樹(shù)，分析MrGDH的進(jìn)化歷程以及與其他物種的親緣關(guān)系。

1.4 病毒感染

MrTV陽(yáng)性樣品加液氮研磨后，以1∶10的比例加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution,PBS）稀釋，8 000 r/min離心30 min后，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾后采用蔗糖密度梯度離心法[4]進(jìn)行純化濃縮，制得MrTV病毒，用PBS稀釋至初始體積，并于－80℃保存?zhèn)溆谩Ａ_氏沼蝦病毒感染設(shè)為2組：MrTV病毒感染組（A1）和PBS注射對(duì)照組（A2）。采用尾部肌肉注射感染，每尾注射0.1 mL，于0、24、48、72、96 h分別對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行取樣并標(biāo)記，每個(gè)樣品混合了同組中同時(shí)間點(diǎn)5尾雄蝦的同種組織，將樣品進(jìn)行MrTV病毒檢測(cè)后于－80℃保存。

1.5 MrGDH基因表達(dá)分析

用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)MrGDH基因在健康成蝦的胃、心、肝胰腺、腸、附肢、鰓、肌肉、眼柄和血淋巴中的表達(dá)情況，以及受MrTV感染前后在肝胰腺和鰓中的表達(dá)情況。

所用引物為GDH Q99F/R，內(nèi)參引物為MR-βactin-F/R（表1）。反應(yīng)步驟如下：95℃變性15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。用熔解曲線評(píng)判qRT-PCR中產(chǎn)物擴(kuò)增的特異情況，采用2－ΔΔCT法計(jì)算各組織中MrGDH基因的相對(duì)表達(dá)量。利用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MrGDH基因全長(zhǎng)克隆

聯(lián)合RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得MrGDH基因的cDNA全長(zhǎng)并提交GenBank（序列號(hào)為KY349118），PCR產(chǎn)物和RACE產(chǎn)物的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。序列分析表明，MrGDH基因cDNA全長(zhǎng)為2 257 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 662 bp，編碼553個(gè)氨基酸，5'端非編碼區(qū)（untranslated regions,UTR）長(zhǎng)53 bp，3'端非編碼區(qū)長(zhǎng)542 bp，含多聚體[poly(A)]尾。

圖1 MrGDH基因的PCR和RACE電泳結(jié)果Fig.1 PCR and RACE electrophoresis results of MrGDH gene

2.2 MrGDH序列及理化性質(zhì)分析

圖2 MrGDH基因cDNA全序列及氨基酸序列Fig.2 cDNA and amino acid sequences of MrGDH gene

由圖2可知，MrGDH基因共編碼553個(gè)氨基酸。MrGDH蛋白分子質(zhì)量約為61.37 kDa，理論等電點(diǎn)為6.51，含帶正電荷殘基（Asp+Glu）64個(gè)，帶負(fù)電荷殘基（Arg+Lys）69個(gè)，不穩(wěn)定指數(shù)為28.22，屬于穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為80.80，親水性平均值為－0.307，推測(cè)該蛋白為親水蛋白；SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果顯示無(wú)信號(hào)肽，平均信號(hào)肽分值（D）為0.133，屬于非分泌型蛋白；NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果表明，MrGDH含蛋白磷酸化作用位點(diǎn)共53個(gè)，其中絲氨酸磷酸化作用位點(diǎn)26個(gè)，蘇氨酸磷酸化作用位點(diǎn)16個(gè)，酪氨酸磷酸化作用位點(diǎn)11個(gè)。Interpro分析出第259個(gè)至549個(gè)氨基酸為MrGDH 4種氨基酸（Glu/Phe/Leu/Val）的脫氫酶結(jié)構(gòu)域（圖2中用灰色框標(biāo)出），第171個(gè)至184個(gè)氨基酸為MrGDH 3種氨基酸（Leu/Phe/Val）的脫氫酶活性位點(diǎn)（VPFGGAKAGLKINP）（圖3中第1和2個(gè)用紅框標(biāo)示序列），第393個(gè)至403個(gè)氨基酸為無(wú)脊椎動(dòng)物的保守序列AKIIAE AANGP（圖3中第3個(gè)用紅框標(biāo)示序列），第428個(gè)至433個(gè)氨基酸為真核生物GDH的高度保守序列（GGVTVS）（圖3中第4和5個(gè)用紅框標(biāo)示序列）。

2.3 氨基酸序列同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MrGDH氨基酸序列與其他甲殼類動(dòng)物GDH氨基酸序列高度同源，同源性為74%～92%，其中與中國(guó)明對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦同源性最高，均達(dá)92%，其次是斑節(jié)對(duì)蝦，同源性為91%，與擬穴青蟹（Scylla paramamosain）的同源性為90%。此外，與黑腹果蠅和家蠶的同源性分別達(dá)到79%和82%，與昆蟲(chóng)類如柑橘鳳蝶（Papilio xuthus）、玉帶鳳蝶（Papilio polytes）以及金鳳蝶（Papilio machaon）的線粒體GDH同源性為79%～80%。

所選GDH氨基酸序列經(jīng)MEGA 6.0多重比對(duì)后，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖4）顯示，中華絨螯蟹與天津厚蟹（Helice tientsinensis）聚為類A，三疣梭子蟹和擬穴青蟹聚成類B，凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦先聚在一起，然后與中國(guó)明對(duì)蝦聚成類C，類A、類B、類C聚成類D，羅氏沼蝦和類D聚成類E，家蠶和黑腹果蠅聚成類F，類E和類F聚成類G，類G與大型蚤（Daphnia magna）聚成類H。之后的親緣關(guān)系從近到遠(yuǎn)依次是：脊椎動(dòng)物、線蟲(chóng)、原生動(dòng)物、古細(xì)菌、植物、原核細(xì)菌及真核細(xì)菌。這說(shuō)明甲殼類與家蠶及果蠅的親緣關(guān)系近，與植物、微生物等親緣關(guān)系遠(yuǎn)。

圖3 MrGDH氨基酸序列與其他物種GDH的氨基酸多重序列比對(duì)Fig.3 Multiple alignment of the predicted amino acid sequence of MrGDH with other eukaryote GDH amino acid sequences

圖4 用鄰接法構(gòu)建的GDH氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of GDH amino acid sequences from different species based on neighbor-joining methool

2.4 MrGDH蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 MrGDH蛋白、果蠅GDH蛋白以及家蠶GDH蛋白三維結(jié)構(gòu)模型Fig.5 Three-dimensional ribbon structure of MrGDH protein,Drosophila melanogaster GDH and Bombyx mori GDH

α螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成MrGDH蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，占整條鏈的比例分別為34.00%、20.07%和45.93%。家蠶及黑腹果蠅的GDH蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)也由α螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成，其中家蠶GDH二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲所占比例分別為32.49%、16.43%、51.08%，黑腹果蠅各部分所占比例分別為32.56%、19.75%、47.69%。3種生物GDH蛋白的三維結(jié)構(gòu)都非常接近（圖5）。

2.5 MrGDH基因在羅氏沼蝦各組織中的表達(dá)分析

以MR-β-actin為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR對(duì)羅氏沼蝦肌肉、附肢、肝胰腺、心、鰓、腸、眼柄、胃、血淋巴9個(gè)組織中MrGDH基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖6）顯示：MrGDH基因在所檢組織中均有表達(dá)；除肝胰腺與心、心與鰓、腸與眼柄、胃與血淋巴間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）外，其他組織間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；MrGDH基因在肌肉中的相對(duì)表達(dá)量最高，其后依次是附肢、肝胰腺、心、鰓、腸、眼柄、胃、血淋巴。

圖6 MrGDH基因在羅氏沼蝦各組織中的相對(duì)表達(dá)情況Fig.6 Relative expression level of MrGDH gene in different tissues of Macrobrachium rosenbergii

2.6 感染MrTV病毒前后MrGDH基因在肝胰腺和鰓中的表達(dá)分析

MrTV病毒檢測(cè)[16-17]結(jié)果顯示，除0 h樣品外，MrTV病毒感染組（A1組）都為陽(yáng)性，注射PBS的對(duì)照組（A2組）都為陰性。感染MrTV前后MrGDH基因在鰓和肝胰腺中的表達(dá)變化情況如圖7、圖8所示。在羅氏沼蝦鰓組織中，感染0 h和24 h的A1組和A2組間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異（P＞0.05）；感染48 h時(shí)，A1組高于A2組，差異達(dá)極顯著水平（p＜0.01）；感染72 h時(shí)，A1組高于A2組，差異顯著（p＜0.05）；感染96 h時(shí)，A1組和A2組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。肝胰腺中MrGDH基因的表達(dá)變化情況與鰓類似：感染0 h和24 h的A1組和A2組間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異（P＞0.05）；感染48 h和72 h時(shí)，A1組高于A2組，差異達(dá)極顯著水平（p＜0.01）；感染96 h時(shí)，A1組和A2組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖7 感染MrTV前后鰓中MrGDH基因在不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression level of MrGDH gene in gill before and after MrTV injection at different time

以上結(jié)果說(shuō)明，在MrTV感染期間，羅氏沼蝦鰓和肝胰腺中MrGDH基因的表達(dá)水平在24～48 h間有明顯的上調(diào)，在72～96 h期間開(kāi)始恢復(fù)，均呈現(xiàn)出一個(gè)明顯的趨勢(shì)，即低水平表達(dá)與對(duì)照組持平，再上調(diào)顯著超過(guò)對(duì)照組，之后恢復(fù)到對(duì)照組水平。

圖8 感染MrTV前后肝胰腺中MrGDH基因在不同時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression level of MrGDH gene in hepatopancreas before and after MrTV injection at different time

3 討論

某些生物的谷氨酸脫氫酶（GDH）氨基末端含線粒體定向運(yùn)輸?shù)膶?dǎo)肽序列[10,19-20]，經(jīng)TargetP 1.1 Server預(yù)測(cè)，MrGDH蛋白極有可能為線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（分值為0.615）。蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)修飾中最普遍且最重要的一種方式，在細(xì)胞信號(hào)傳遞中占有重要地位，分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)對(duì)全面了解蛋白質(zhì)不可或缺。本研究發(fā)現(xiàn)MrGDH基因序列中存在一段保守序列AKIIAEAANGP，與脊椎動(dòng)物中AKIIAEGANGP略有差異，與熊澤泉對(duì)十足目GDH的研究[10]一致。釀酒酵母不具備真核生物GDH的高度保守序列GGVTVS，說(shuō)明該段序列在真核生物中并不都存在。

GDH是一種結(jié)構(gòu)保守的蛋白酶，在生物體中廣泛存在，對(duì)生物體氮代謝具有重要的作用[1,7-8]，其催化的反應(yīng)是獲得能量ATP的重要途徑。甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丙氨酸和?；撬岬扔坞x氨基酸對(duì)大多數(shù)甲殼動(dòng)物滲透壓起著主要的調(diào)節(jié)作用，不同甲殼動(dòng)物中起滲透調(diào)節(jié)的氨基酸種類雖不一定相同，但這些氨基酸的代謝均受GDH調(diào)控[10]。

肌肉支配著全身的運(yùn)動(dòng)，是蝦體的主要構(gòu)成部分，其對(duì)能量的需求遠(yuǎn)高于其他組織；附肢與蝦在水中的運(yùn)動(dòng)有關(guān)，對(duì)能量的需求也很高；肝胰腺是甲殼類動(dòng)物的主要消化腺，在脂類的儲(chǔ)存、營(yíng)養(yǎng)消化吸收和分泌中有重要的作用，也是甲殼動(dòng)物氨氮解毒代謝及氨氮排泄場(chǎng)所[6,21]；心臟的作用是推動(dòng)血液流動(dòng)，向各器官、各組織及各細(xì)胞提供養(yǎng)分和氧，并帶走代謝終產(chǎn)物，維持細(xì)胞和機(jī)體正常的代謝和功能，激素和體內(nèi)其他體液因子也需要通過(guò)血液的推動(dòng)被運(yùn)送至相應(yīng)的靶細(xì)胞，來(lái)實(shí)現(xiàn)體液調(diào)節(jié)及維持內(nèi)環(huán)境平衡；鰓是蝦與外界進(jìn)行氣體交換的場(chǎng)所；腸與消化、吸收、排泄相關(guān)，等等。各組織功能的差異可能是導(dǎo)致MrGDH基因差異性表達(dá)的主要原因。研究表明，羅氏沼蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦及中國(guó)明對(duì)蝦中GDH組織表達(dá)均在肌肉中最高[6-8]。

PBS注射組中MrGDH基因的表達(dá)在24～96 h時(shí)基本處于遞增狀態(tài)，可能是由室內(nèi)養(yǎng)殖過(guò)程中水體環(huán)境發(fā)生改變?cè)斐傻?。生物體新陳代謝排泄出來(lái)的一些物質(zhì)增加了水體中的滲透壓，在滲透脅迫下，機(jī)體需要調(diào)動(dòng)體內(nèi)大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一方面提供足夠的能量用于滲透調(diào)節(jié)，另一方面盡量爭(zhēng)取更快的生長(zhǎng)速度[21]；當(dāng)蝦體內(nèi)與外界環(huán)境滲透壓達(dá)到平衡后，MrGDH的表達(dá)不再大幅度增加。在MrTV病毒感染組中，羅氏沼蝦肝胰腺和鰓中MrGDH基因的表達(dá)均發(fā)生了一定的變化，其中感染48 h和72 h時(shí)的MrTV病毒感染組均高于PBS注射組，其他時(shí)間則2組差異不大。脂類儲(chǔ)存、營(yíng)養(yǎng)消化吸收和分泌、氨氮解毒及排泄都主要在肝胰腺中進(jìn)行；鰓是蝦最主要的離子轉(zhuǎn)運(yùn)器官，也是與外界進(jìn)行氣體交換的場(chǎng)所，起著連接體內(nèi)和體外的橋梁作用，病毒也可通過(guò)鰓進(jìn)入蝦體內(nèi)。LI等[13]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對(duì)蝦受白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus,WSSV）感染后，GDH的表達(dá)在一定時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)了上調(diào)，它通過(guò)將谷氨酸催化成α-酮戊二酸，為T(mén)CA循環(huán)提供能量來(lái)維持WSSV復(fù)制。感染MrTV后的羅氏沼蝦，很可能受病毒的影響，使體內(nèi)谷氨酸轉(zhuǎn)化成α-酮戊二酸的反應(yīng)增加，為T(mén)CA循環(huán)補(bǔ)充能量維持病毒復(fù)制，從而使MrGDH基因表達(dá)上調(diào)。本研究對(duì)MrGDH的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步分析，為甲殼類MrGDH的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Molecular cloning and tissue expression analysis of glutamate dehydrogenase gene from Macrobrachium rosenbergii under MrTV infection stress.Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2017,43(5):639-648

ZHENG Qunyan1,PAN Xiaoyi2,SHEN Jinyu1,2,CHEN Shaobo1,3*,XU Yang2,XU Ting2
(1.School of Laboratory Medicine and Life Sciences,Wenzhou Medical University,Wenzhou 325035,Zhejiang,China;2.Key Laboratory of Fish Health and Nutrition of Zhejiang Province,Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries,Huzhou 313001,Zhejiang,China;3.Zhejiang Mariculture Research Institute,Wenzhou 325005,Zhejiang,China)

Macrobrachium rosenbergii;Macrobrachium rosenbergii Taihu virus;glutamate dehydrogenase;gene cloning;difference in tissue expression

Q 17

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2017.04.171

Summary Macrobrachium rosenbergii is one of the major aquaculture shrimp,whose larva is the susceptible host of Macrobrachium rosenbergii Taihu virus(MrTV)which is one kind of novel RNA virus,and a member of Dicistroviridae owning a single positive strand with two open reading frames.Glutamate dehydrogenase(GDH)is a key enzyme in glutamate biosynthesis and plays an important role in organism’s metabolism.But there are still few reports aboutglutamate dehydrogenase in crustaceans,and almost no reports of M.rosenbergii glutamate dehydrogenase(MrGDH),as well as the interaction between MrGDH and MrTV.

國(guó)家自然科學(xué)基金（2013skj002）；浙江省自然科學(xué)基金（LY12C19007）；浙江省科技廳院所扶持專項(xiàng)（2017F30033）；浙江省湖州市公益性技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目（2015GZ09）。

*通信作者（Correspondingauthor）:陳少波（http://orcid.org/0000-0001-6693-2335），Tel:+86-572-86699360,E-mail:chenshaobo@hotmail.com第一作者（First author）:鄭群艷（http://orcid.org/0000-0002-3687-192X），E-mail:zhengqunyan2010@126.com

2017-04-17；接受日期（Accepted）:2017-09-06

In this study,the complete sequence of MrGDH gene was cloned by rapid amplification of cDNA ends(RACE)technology,and the expression of MrGDH gene in different tissues was studied by quantitative real-time polymerase chain reaction(qRTPCR).Then the transcriptional characteristics of MrGDH gene in the gill and hepatopancreas of M.rosenbergii were analyzed under MrTV infection(positive group),and the negative group was injected with phosphate buffered solution.

The results showed that the complete cDNA sequence of MrGDH gene was 2 257 bp in length with a 1 662 bp open reading frame(ORF)encoding 553 amino acids,which shared 92%homology with Fenneropenaeus chinensis GDH and Litopenaeus vannamei GDH.The protein molecular mass of MrGDH was approximately 61.37 kDa.Its secondary and threedimensional structures were extremely similar to Drosophila melanogaster GDH and Bombyx mori GDH.The MrGDH gene was expressed in all detected tissues of M.rosenbergii.After 48 h and 72 h of injection,the expression of MrGDH gene in hepatopancreas and gill of positive group was significantly higher than the negative group.

In summary,the MrGDH gene is conservative,and its expression distribution indicates that it’s highly expressed in the organisms extremely related to movement and metabolism,with the highest in muscle and the lowest in haemolymph.This difference may be caused by the diversity in energy demand of each organization.Overall,it is indicated that MrTV infection could stimulate the expression of MrGDH gene.