櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺誘導免疫低下小鼠的免疫增強作用

原 新，徐志立，梁晗業(yè)，穆陽陽，張明波 （遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連116600）

櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺誘導免疫低下小鼠的免疫增強作用

原 新，徐志立，梁晗業(yè)，穆陽陽，張明波 （遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連116600）

目的：探討櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫增強作用.方法：腹腔注射環(huán)磷酰胺造成小鼠免疫低下模型，給藥后觀察小鼠血清中溶血素水平，炭粒廓清功能及遲發(fā)型變態(tài)反應.結果：免疫低下小鼠給予櫻桃葉水煎液后，血清中溶血素水平明顯升高，炭粒廓清能力及遲發(fā)型變態(tài)反應增強.結論：櫻桃葉可增強免疫低下小鼠的免疫功能.

櫻桃葉；免疫低下；炭粒廓清；溶血素水平

0 引言

櫻桃（Cerasus pseudocerasus L.）為薔薇科多年生木本植物，櫻桃葉收錄于《中華本草》，為薔薇科植物櫻桃的葉片，性溫、味辛苦、無毒，可溫胃、健脾、止血、解毒，用于治療胃寒食積、腹瀉、吐血、瘡毒等［1］.櫻桃在遼寧南部地區(qū)廣泛種植，櫻桃葉來源豐富，櫻桃葉的開發(fā)與利用具有較好的市場價值與社會效益.但目前對櫻桃葉的開發(fā)利用研究較少，除極少量用于枕頭填充物外，多被作為動物飼料或廢渣丟棄，造成資源浪費及環(huán)境污染［2］.為了給予櫻桃葉的進一步開發(fā)提供科學依據(jù)，本研究考察櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫增強作用，現(xiàn)報道如下.

1 材料和方法

1.1 動物BALB/c小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質量18～22 g，購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號SCXK（遼）2013?0003.動物飼養(yǎng)條件：清潔級環(huán)境飼養(yǎng)，溫度（22±2）℃，相對濕度40%～60%，控制照明時間為14 h.適應兩周后開始實驗.

1.2 藥品櫻桃葉采自大連市旅順口區(qū)，經(jīng)中藥鑒定教研室王添敏副教授鑒定為薔薇科植物、品種為大紅燈櫻桃的葉片.注射用環(huán)磷酰胺（江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號16101125）；丙酮（國藥集團化學試劑公司，批號20110728）；2，4?二硝基氟苯（成都艾科達化學試劑有限公司，批號201411171）；碳酸鈉（北京化工廠，批號20031218）；鹽酸左旋咪唑片（山東仁和堂藥業(yè)有限公司，批號140802）；注射用印度墨汁（北京諾博萊德科技有限公司），臨用前以生理鹽水稀釋8倍.

1.3 儀器UV?5600紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；MA240D型電子分析天平（上海第二天平儀器廠）；TG?16W型臺式離心機（長沙湘儀離心機有限公司）.

1.4 方法

1.4.1 櫻桃葉水煎液的制備 櫻桃葉粉碎后加8倍量蒸餾水浸泡5 h，加熱煮沸后改文火加熱20 min，稍冷后過濾，濾渣再加6倍量水同上法煎煮20 min，過濾后合并兩次濾液，濃縮為40%櫻桃葉水煎液.

1.4.2 環(huán)磷酰胺所致免疫抑制模型建造 在實驗結束前7 d，除正常對照組小鼠注射等體積生理鹽水外，各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液80 mg/kg，連續(xù)3 d［3?4］.

1.4.3 分組及給藥 各實驗均取60只小鼠，隨機分為6組.分別為正常對照組（n＝10），免疫功能低下模型對照組（n＝10），櫻桃葉水煎液高（n＝10）、中（n＝10）、低劑量組（n＝10），左旋咪唑陽性對照組（n＝10）.櫻桃葉水煎液高、中、低劑量組分別灌胃給予4 g/kg，2 g/kg，1 g/kg的櫻桃葉水煎液；左旋咪唑組灌胃給予25 mg/kg；正常對照組及模型對照組灌胃等體積蒸餾水；1次/d，連續(xù)35 d.

1.4.4 櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠炭粒廓清功能的影響 第35天末次給藥后120 min，尾靜脈注射印度墨水0.1 mL/10 g，分別在注射后的5 min和20 min各組小鼠眼眶取血25 μL，立刻溶于0.1%Na2CO32 mL溶液中，搖勻，600 nm比色，測定吸光度（OD值），解剖小鼠，取肝、脾，稱重，計算廓清指數(shù)K值和校正廓清指數(shù)α值.廓清指數(shù)K＝（lgOD1－lgOD2）/（t2?t1），校正廓清指數(shù)α＝3K×體質量（g）/（肝重（g）＋脾重（g））［5?6］.

1.4.5 櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應（delayed type hypersensitivity，DTH）的影響 給藥后第29天，致敏各組小鼠（背部皮膚涂抹0.5%二硝基氟苯丙酮溶液50 μL），第34天激發(fā)（0.5%二硝基氟苯丙酮溶液50 μL涂抹于小鼠左耳兩面）.第35天即激發(fā)后24 h，小鼠處死，剪下左右兩耳，并用打孔器將每只小鼠的左右耳相同部位打下相同面積的耳片，分析天平稱耳片重量，以左、右耳片重量差的毫克數(shù)作為鼠耳遲發(fā)性超敏反應強度.計算腫脹度（%）＝（左耳重量－右耳重量）/右耳重量×100%.取胸腺及脾臟，稱重，計算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)［7－8］.

1.4.6 櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠血清溶血素水平的影響 在首次給藥后第30天，各組小鼠腹腔注射5%綿羊紅細胞（sheep red blood cell，SRBC），每只0.2 mL，連續(xù)3 d，免疫后5 d（即給藥后第35天）取血，離心，分離血清，將血清用生理鹽水稀釋300倍；取1 mL稀釋后血清加入試管內，各試管分別加入5%SRBC 0.5 mL，10%補體1 mL，37℃下孵育30 min，移至冰浴終止反應；1500 r/min，離心5 min，取上清1 mL，加入3 mL都氏試劑，混勻，10 min后540 nm比色；取同實驗用的5%SRBC 0.25 mL，加入4 mL都氏試劑，混勻，10 min后540 nm處比色，即SRBC半數(shù)溶血時吸光度值.半數(shù)溶血值HC50＝（樣品吸光度值÷SRBC半數(shù)溶血時的吸光度值）×稀釋倍數(shù)［9］.

1.5 統(tǒng)計學處理采用IBM SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 免疫抑制小鼠模型的制備小鼠注射環(huán)磷酰胺后，與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)明顯降低，對二硝基氟苯所致DTH反應顯著降低，炭粒廓清功能及溶血素水平明顯降低，表明免疫抑制小鼠模型制備成功（表1、2、3）.

表1 櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠炭粒廓清功能的影響（ ±s，n＝1 0）

表1 櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠炭粒廓清功能的影響（ ±s，n＝1 0）

bP＜0.01 vs正常對照組；cP＜0.05，dP＜0.01 vs模型對照組.

組別劑量（mg/kg）OD值K值α值5 min20 min正常對照組——0.289±0.0370.161±0.0350.017±0.0084.434±0.955模型對照組——0.190±0.0520.139±0.0430.009±0.0063.143±0.432b櫻桃葉水煎液高劑量組40000.285±0.0240.179±0.0250.014±0.0044.326±0.779d櫻桃葉水煎液中劑量組20000.328±0.0600.193±0.0260.015±0.0063.919±0.711d櫻桃葉水煎液低劑量組10000.302±0.0200.229±0.0320.008±0.0043.505±0.829左旋咪唑組250.323±0.0360.182±0.0320.017±0.0054.162±0.993c

表2 櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠DTH的影響（±s，n＝10）

表2 櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠DTH的影響（±s，n＝10）

bP＜0.01 vs正常對照組；cP＜0.05，dP＜0.01 vs模型對照組.

組別劑量（mg/kg）小鼠耳片重量（mg）反應強度（mg）腫脹度（%）左耳右耳正常對照組——6.46±1.083.61±0.622.85±0.6379.97±16.41模型對照組——4.57±0.813.75±0.710.82±0.34b22.31±9.63b櫻桃葉水煎液高劑量組40006.49±1.233.73±0.802.76±0.65d75.46±17.61d櫻桃葉水煎液中劑量組20005.16±0.653.55±0.561.61±0.36d46.24±13.37d櫻桃葉水煎液低劑量組10005.03±1.133.69±0.771.34±0.38c35.96±4.60c左旋咪唑組255.87±0.973.65±0.512.22±0.58d60.81±12.43d

表3 櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠溶血素水平及胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響（ ±s，n＝10）

表3 櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠溶血素水平及胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響（ ±s，n＝10）

bP＜0.01 vs正常對照組；cP＜0.05，dP＜0.01 vs模型對照組.

組別劑量（mg/kg）半數(shù)溶血值HC50胸腺指數(shù)（mg/g）脾指數(shù)（mg/g）正常對照組——119.26±13.622.46±0.465.16±1.18模型對照組——62.92±7.09b1.28±0.44b3.11±0.54b櫻桃葉水煎液高劑量組4000107.86±14.24d2.19±0.0.59d5.03±0.41c櫻桃葉水煎液中劑量組200093.53±5.40d1.38±0.253.91±1.30櫻桃葉水煎液低劑量組100076.80±8.15d1.05±0.203.36±0.42左旋咪唑組25105.45±9.49d1.67±0.64c4.22±1.18d

2.2 櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠炭粒廓清功能的影響與正常組相比，環(huán)磷酰胺導致免疫低下模型組小鼠的炭粒廓清能力明顯下降（P＜0.01）；而給予櫻桃葉水煎液高、中劑量可明顯提高免疫低下小鼠的炭粒廓清功能（P＜0.01，表1）.

2.3 櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠DTH的影響與正常對照組相比，給予環(huán)磷酰胺后，模型組對于二硝基氟苯所致DTH反應顯著降低（P＜0.01），而免疫抑制小鼠灌胃給予櫻桃葉水煎液后，DTH反應強度明顯增強（P＜0.05，P＜0.01，表2）.

2.4 櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠溶血素水平、胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的影響與正常對照組比較，免疫低下小鼠半數(shù)溶血值明顯降低（P＜0.01），櫻桃葉可顯著提高環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的半數(shù)溶血值（P＜0.01）.小鼠灌胃給予不同劑量櫻桃葉水煎液后，各組小鼠的胸腺指數(shù)與脾指數(shù)均有提高，并呈劑量依賴性，其中高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01，表3）.

3 討論

櫻桃種植范圍廣，櫻桃葉來源豐富且價廉，對櫻桃葉提取物及其組分的研究與開發(fā)有廣闊的前景.櫻桃具有抗衰老，抗自由基，抗氧化，抗炎，抗類風濕性、痛風性關節(jié)炎，抗前列腺增生等活性［10－13］.對于櫻桃葉及其活性成分的藥理作用，亦有學者進行了多方面研究，研究表明櫻桃葉水煎液顯示出明顯的降壓作用，效價強于櫻桃葉中所含總黃酮苷［14］，櫻桃葉中多糖可增強機體清除自由基活性，抑制大鼠肝自發(fā)性脂質過氧化［14］.櫻桃葉中黃酮類亦有較強的體外抗氧化活性，抑制H2O2誘導的小鼠紅細胞溶血［15］.但針對櫻桃葉對于免疫抑制狀態(tài)下的免疫調節(jié)作用研究較少.

機體免疫系統(tǒng)主要有三大功能：免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫自穩(wěn)定，免疫抑制會導致機體防御、識別與排除外來抗原（病原微生物等）和自身抗原的能力下降，難以維持機體生理平衡，導致疾病產生.本研究采用經(jīng)典的環(huán)磷酰胺誘導免疫功能低下小鼠模型，考察櫻桃葉水煎液對免疫抑制小鼠免疫功能的促進作用.

脾臟和胸腺都是人體重要的免疫器官，胸腺對維持細胞免疫和調節(jié)免疫反應起重要的作用，脾臟是機體細胞免疫和體液免疫的中心［16］.機體免疫系統(tǒng)中，巨噬細胞是最先對抗原產生反應的免疫細胞之一，其吞噬功能反映機體的非特異性免疫功能［17］.DTH是檢測T細胞功能的體內實驗方法之一，通過測定受試物對機體DTH反應的影響，可反應機體的T細胞功能或受試物的作用.二硝基氟苯是一種半抗原，其進入機體后與體內蛋白結合為完全抗原，刺激T淋巴細胞增殖為致敏淋巴細胞，從而誘導細胞免疫反應（DTH反應）.經(jīng)SRBC免疫后，小鼠的淋巴細胞產生抗SRBC抗體（溶血素），可通過測定在體外溶血反應中釋放的血紅蛋白表示免疫小鼠血清中溶血素含量，反映機體特異性體液免疫功能.

本研究結果表明，櫻桃葉水煎液能顯著提高小鼠炭粒廓清能力，提示櫻桃葉可促進機體內皮網(wǎng)狀系統(tǒng)對異物的廓清、吞噬，提高機體非特異性免疫；櫻桃葉水煎液對環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的DTH反應具有明顯刺激作用，表明其可顯著增加免疫抑制狀態(tài)小鼠的細胞免疫功能；櫻桃葉能對抗環(huán)磷酰胺引起的脾、胸腺萎縮，對脾與胸腺具有保護作用.實驗結果亦顯示，櫻桃葉可提高免疫抑制小鼠的半數(shù)溶血值，增加抗體水平，提高免疫抑制小鼠的體液免疫功能.

總之，櫻桃葉對于環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠的非特異性、特異性體液免疫及特異性細胞免疫功能均具有增強作用，可能對于臨床免疫抑制性疾病具有良好的治療效果.有關其促進免疫的活性仍需要進一步研究.

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The immunological enhancement of decoction of cherry leaf on immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide

YUAN Xin，XU Zhi-Li，LIANG Han-Ye，MU Yang-Yang，ZHANG Ming-Bo
College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China

AIM：To investigate the immunological enhancement of decoction of cherry leaf on immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide.METHODS：The carbon clearance function，delayed type hypersensitivity（DTH）activities and hemolysin lev?el were determined in immunosuppressed mice induced by cyclo?phosphamide after administrating with decoction of cherry leaf of different concentration.RESULTS：The carbon clearance func?tion，delayed type hypersensitivity（DTH）activities and hemoly?sin level were increased obviously in immunosuppressed mice after administrating with decoction of cherry leaf.CONCLUSION：The cherry leaf could improve the immune function of immunosup?pressed mice.

cherry leaf；immune suppression；carbon clear?ance；hemolysin level

R285.5

A

2017－05－13；接受日期：2017－06－01

2016年遼寧中醫(yī)藥大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201610162067）

原 新.本科.E?mail：2621194230＠qq.com

徐志立.博士，副教授，碩導.研究方向：中藥藥理學.E?mail：xu＿zhili＠126.com

2095?6894（2017）10?43?04